Summary
Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.
Abstract
Akut miyokard infarktüsü (mı) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Rejeneratif tıp ana amacı ölü Miyokardiyum MI sonra doldurmak etmektir. Her ne kadar çeşitli stratejiler Miyokardiyum yeniden oluşturmak için kullanılan, kök hücre tedavisi MI kalp ölü Miyokardiyum doldurmak için büyük bir yaklaşım kalır. Kanıt biriken yetişkin kalp ve kalp rejenerasyon endokrin ve/veya parakrin etkileri ikamet kardiyak kök hücreleri (CSCs) varlığını göstermektedir. Ancak, CSC yalıtım ve karakterizasyonu ve farklılaşma miyokard hücreleri, özellikle cardiomyocytes, doğru bir teknik sorun kalır. Bu da çalışmanın, yalıtım, karakterizasyonu ve CSCs farklılaşma yetişkin fare kalp için basit bir yöntem sağladı. Burada, CSCs nerede kalp % 0,2 collagenase II çözüm tarafından sindirilmiş, yalıtım için bir yoğunluk degrade yöntemi açıklanmaktadır. İzole CSCs ayırdetmek için CSCs/kalp işaretleri Sca-1, NKX2-5 ve GATA4 ve pluripotency/stemness işaretleri OCT4, SOX2 ve MicroRNAs ifadesi değerlendirilir. Biz de onları bir kabında kültür ve nükleer silahların yayılmasına karşı işaret Ki-67 ifade değerlendirirken izole CSCs yayılması potansiyelini belirledi. CSCs farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için biz yedi - on - gün kültürlü CSCs seçildi. Biz onları cardiomyocyte farklılaşma orta ile yeni bir tabak transfer. Farklılaşma Orta üç günde değişti iken onlar 12 gün boyunca bir hücre kültür kuluçka makinesine inkübe. Cardiomyocyte özel işaretleri farklılaştırılmış CSCs hızlı: Aktinin ve troponin ı. Böylece, stemness ve kardiyak Marker CSCs bu iletişim kuralı ile izole var ve onlar için yayılma ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage bir potansiyele sahip.
Introduction
İskemik kalp hastalığı, akut miyokard infarktüsü (mı), dahil olmak üzere ölüm1dünya çapında önemli bir nedenidir. Ölü Miyokardiyum Yenileyici için kök hücre tedavisi bir mı kalp2,3,4,5kardiyak fonksiyon geliştirmek için önemli bir yaklaşım kalır. Kök hücrelerin farklı türleri ölü Miyokardiyum doldurmak için ve bir MI kalp kardiyak fonksiyon geliştirmek için kullanılmıştır. Embriyonik kök hücre6 ve yetişkin kök hücre genel olarak sınıflandırılabilir. Yetişkin kök hücre, kök hücre türleri, mononükleer hücreler kemik iliği elde edilen7,8, kemik iliği9dan,10, yağ dokusu elde edilen mezenkimal kök hücre gibi kullanılmıştır 11,12ve göbek kordonu13ve CSCs14,15. Kök hücre den endokrin ve/veya parakrin eylemler16,17,18,19,20kardiyak rejenerasyon yükseltebilirsiniz. Ancak, kök hücre tedavisi büyük bir sınırlama çoğalırlar ve/veya doğru belirli kardiyak lineage21,22ayırt kök hücreleri yeterli sayıda almaktır. Otolog ve allojenik kök hücre nakli kök hücre tedavisi9önemli bir sorundur. CSCs onlar yürekten türetilmiştir ve onlar daha kolay kalp soy kalp kök hücreler farklı çünkü kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Böylece, teratoma riskini azaltır. Buna ek olarak, CSCs, endokrin ve parakrin etkileri exosomes ve CSCs türetilmiş miRNAs gibi daha kök hücreler diğer tür daha etkili olabilir. Böylece, CSCs kardiyak rejenerasyon23,24için daha iyi bir seçenek kalır.
CSCs MI kalp kalp kökenlerine nedeniyle kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir aday olmakla birlikte, önemli bir sınırlama CSCs ile daha az verimli yalıtım yöntemini eksikliği nedeniyle verimidir. Başka bir sınırlama CSCs Engelli farklılaşma cardiomyocytes lineage2,25,26,27doğru olabilir. Bu sınırlamaları aşmak için CSC yalıtım, karakterizasyonu ve farklılaşma kardiyak lineage doğru için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek önemlidir. CSCs yok tek kabul edilebilir işaretçisi ve bir belirli hücre yüzeyine marker tabanlı yalıtım CSCs, daha az CSCs verim. Burada, düşük maliyetli ve CSCs artan bir verim içinde sonuç fare kalp CSCs yalıtmak için bir basit degrade Santrifüjü yaklaşım standartlaştırmak. Bu izole CSCs floresans aktif hücre kısa devre tarafından belirli hücre yüzeyine işaretler için seçilebilir. CSCs yalıtım ek olarak, biz CSC kültür, karakterizasyonu ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage için bir protokol sağladı. Böylece, biz izole, karakterize, kültür ve CSCs yetişkin fare kalpler (Şekil 5) ayırt etmek için zarif bir yöntem mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Konut, anestezi ve kurban farelerin Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi onaylı IACUC protokolüne yapıldı.
1. malzeme
- Kullanım 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J siyah erkek fare, kurumsal hayvan tesis, CSCs. CSCs yalıtım için şirket içinde muhafaza-ebilmek da gebe olmayan dişi fareler izole edilmesi.
- Cerrahi makas, iyi cerrahi makas, eğri şaftlı forseps ve cerrahi bir bıçak, ısıyla tarafından da dahil olmak üzere tüm gerekli cerrahi aletler, sterilize fare ötenazi önce.
- CSC yalıtım arabellekleri sterilize koşuldaki hazırlamak ve onları buz üzerinde 4 ° C'de depolayın. Polysucrose ve 1.077 g/mL bir yoğunluk için ayarlanmış bir sodyum diatrizoate çözüm bu arabellekleri içerir, kartal'ın orta eksik Dulbecco'nın değiştirilmiş, 1 x Ham'ın dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve kültür-grade 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücre. (Filtre uygulanmış ve sterilize) bir % 1 collagenase II stok çözüm ve HBSS içinde % 0,2 çalışan bir çözüm hazırlamak.
- Biyogüvenlik steril durumda doku kültürü malzeme dolabı, bir 10 mm Petri, 6-şey plaka, bir 24-şey plaka, T-25 ve T-75 kültür şişeler, 15 mL ve 50 mL konik tüpler ve tek kullanımlık serolojik Pipetler ile 40-µm ve 100 gibi tutmak -µm hücre süzgeçler 0,22-µm filtreleri ile.
- 10 µL, 200-µL ve 1.000-µL pipet ipuçları otoklav tarafından sterilize.
- Pudrasız nitril eldiven ve % 70 etanol steril bir koşulu deneme boyunca korumak için kullanın.
- % 10 çamaşır suyu bir dezenfektan olarak kullanın.
- Piyasada bulunan CSC bakım orta ve cardiomyocytes farklılaşma orta kültür ve CSCs, farklılaşma için sırasıyla kullanın.
2. izolasyon yöntemi kardiyak kök hücre
- 4-5 Yetişkin erkek (veya gebe olmayan kadın) ötenazi CO2 odası kullanarak fare. Her fare silah ayrı diseksiyon karton üzerinde bağlantıları veya yapışkan bantlar ile düzeltmek.
- % 70 etanol dış mikrop kurtulmak ve kalbinde hasat sırasında steril durumu korumak için fareyi sprey. Karın ortasında makasla bir kesi yapmak ve düz bir çizgide kadar toraks karın derisini kesti. Cilt cilt ve saçlar karın bölgesi temizlemek için orta kesim her iki taraftan kaldırın. Makas ve cımbız kullanarak, göğüs kafesi altındaki diyafram kesti.
- Göğüs boşluğuna fare kafesi başlık içinde keserek açın. Kalp maruz ve kanın kalp yanına kaldırmak. Çevresi kalp kalp çevresinde hiç kan kurtulmak için buz gibi PBS ile yıkayın.
- Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalp incelemek. Buz gibi PBS 10 mL içeren 100-mm Petri kabına kalbinde bir yer.
- Eğri şaftlı forseps kullanarak kalp palpitate ve kalan kan kalbin içindeki kaldırın.
- Bütün kalp CSCs yalıtımı için kullanma.
- Tüm dört ya da beş tüm kalpleri bir 50 mL konik tüp buz gibi HBSS 10 mL içeren aktarın. Tüp buz üzerinde daha fazla işleme kadar tutun.
- İçinde ve dışında bir Biyogüvenlik steril bir ortam oluşturmak için % 70 etanol ile kabine silin. Kalp içeren tüp ve diğer gerekli malzemeler % 70 etanol ile sterilize. Kalp içeren tüp Biyogüvenlik kabine için daha fazla alay yerleştirin.
- Kalplerini buz gibi HBSS 10 mL içeren bir 100-mm Petri kabına aktarın. Kalbini tekrar kalbin içindeki herhangi bir kalıntı kan kaldırmak için palpating yıkayın. HBSS çözüm kan tümüyle kaldırılmasını sağlamak için her yıkama sonra değiştirin.
- Kalpleri bir 100-mm 5-7 mL HBSS çözeltisi içeren kabında iyi cerrahi makas veya cerrahi bir bıçak kullanarak küçük parçalar halinde kes. Forseps ile per: her kalp ve kalp 2 - 4 mm parçalar halinde kesmek için bir çift cerrahi iyi makas veya cerrahi bir bıçak kullanın. Sık sık kan-Alerjik HBSS emin olmak için HBSS çözüm değiştirin. HBSS çözüm kalbimizde kıyma.
- 500 x g 5 dk. atma için 4 ° C'de, kıyılmış doku süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet tutun.
- Pelet 5-6 mL % 0,2 collagenase II çözeltisi 50 mL konik tüp içinde resuspend. Collagenase çözüm hacmi neredeyse 1.5 - için 2 - kat Pelet hacmi olmalıdır.
Not: doku, ben ve 2.5 U/mL dispase çözüm % 0,2 collagenase II değiştirebilirsiniz % 0,2 collagenase sindirim için. Dispase çözüm collagenase için neredeyse eşit bir hacmi kullanın ben çözüm. - Tüp Tantanacı veya 45-60 dk 37 ° C'de bir shaker-75 x g de televizyonda sallanan Pelet % 0,2 collagenase II çözüm ile iyice karıştırın Tüp el ile lizis geliştirmek için her 20-30 dakika sonra şiddetle çalkalanır.
- 5 mL serolojik pipet ve 1 mL pipet ucu doku yumru tek hücre süspansiyon ayırmak için lysed doku karışımının triturate.
Not: CSCs en fazla iyileşme elde etmek için en az 5 min için lizis karışımı triturate. Doku topaklar nispeten büyük iseniz, 1 mL pipet ucu ucu makas veya cerrahi bir bıçak ile kesmek ve toz için kullanabilirsiniz. - Doku enzimatik lizis ticari olarak temin CSC bakım orta ekleyerek durdurmak. Neredeyse 2-3 x kadar bakım orta adım 2,14 lysed doku hacmi olarak ekleyin.
- Sindirilir hücre süspansiyon herhangi bir sindirilmemiş doku parçaları kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
- 40-µm hücre süzgeç kullanarak 2,16 arasındaki adımları yineleyin.
- Yoğunluk gradient Santrifüjü ile hücreleri ayırın. Hücreleri ayırma için hafifçe polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerinde filtrate eşit bir hacmi yerleşimi. Örneğin, ilk olarak, bir 50 mL konik tüp içinde 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözeltisi ekleyin ve sonra filtrate 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm 2.17 adımından ekleyin.
Not: Prewarm polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm daha önce 37 ° C'de hücreler ile kullanın. Filtrate çok dikkatli ve yavaş adım 2.17 polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerine eklemek herhangi bir iki çözümleri karıştırma önlemek için. Bu çok önemli bir adım olarak kabul edilir. - Her iki çözüm de 500 x g bir salıncak kova santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüp santrifüj kapasitesi. Santrifüj iki çözüm karıştırma önlemek için daha düşük bir yavaşlama hızlanma ve hız ve uygun CSCs ayrılması için ayarlayın. CSC izolasyon önemli bir adımdır. Çok yavaş santrifüj içinde karışıklık olmadan degrade karışımı içeren tüpü yerleştirmek ve Santrifüjü için ayarlayın.
- Buffy kat ilave bir 15 mL steril tüpe 1 mL pipet ya da plastik bir Pasteur pipet kullanarak üst katmanı çözümden birlikte dışarı çıkar. Buffy bu katman CSCs içerir.
Not: CSCs için toksik olduğu için polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm katmanı almaya buffy kat pipetting sırasında ilave tedbirleri almak. - CSC bakım orta eşit bir birim hücre süspansiyon 2.20 adımından ve düzgün kalan polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm, etkisiz hale getirmek için varsa karıştırın.
- 500 x g 4 ° C'de 5 min için de yukarıdaki hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
- Pelet 7-10 mL eksik DMEM orta resuspend ve 500 x g 4 ° C'de herhangi bir kalıntı polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm kurtulmak için 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Arıtılmış CSCs içerir Pelet toplamak.
- Pelet CSC bakım orta 1 mL resuspend, CSC saymak ve Pelet kültür için kullanın. CSC saymak için Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanın. Dört erkek fareler kalpleri ile ~1.8 milyon CSCs verimidir.
- Tohum bir 6-şey kültür plaka CSCs bir %0.02 jelatin çözüm içeren % 0.5 fibronektin kaplı. Tam bakım Orta 2 mL tohum için kullanın. Kültür plaka bir kuluçka %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
- Kültür CSCs orta ile tam CSC bakım orta üçüncü güne kadar her gün değiştirin. Bundan sonra diğer günlerde orta değiştirin.
- CSCs büyüme mikroskop altında gözlemleyerek belirlemek.
3. kültür bakım ve kardiyak kök hücre geçirilmesi
- Kültür bir piyasada bulunan bakım orta izole CSCs. Kültür orta diğer günlerde taze bakım orta ile değiştirin. CSC kültür confluency ulaştığında CSCs jelatin ve fibronektin, ile kaplı bir yeni plaka adım 2.26 belirtildiği gibi aktarın. Kültürlü CSCs enzimatik hücre ayrılma arabellek ayırmak. Hücre ayrılma standart protokol kültür plaka izleyin. Bu aşamada, CSCs geçiş 0 (P0) sahne olarak kabul edilir.
- Kültür P0 CSCs içinde yeni bir jelatin ve fibronektin kaplı plaka tam CSC bakım orta % 5 CO2 kuluçka, 37 ° C'de bunları konfluent izin ve adım geçiş 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs sıvı azot almak veya deney için kullanmak için 3.1 izleyin ments.
- 6-şey plaka veya onun ilk aşamada CSC kültürü korumak için T-25 hücrelerde 1 milyon tohum 0.5 milyon hücreler.
- Geçit onlar % 85-%90 birleşmesi olunca CSCs. CSCs bakım orta dört ila altı hafta kadar kültürlü.
Not: daha düşük bir tohumlama yoğunluğu CSCs onların morfolojisi düz ve uzun değiştirmek için CSCs nispeten yüksek (% 40-%50) ilk tohumlama yoğunluğu tutun.
4. kardiyak kök hücrelerin karakterizasyonu
- Kültürlü CSCs karakterize etmek için onları fajının kontrast veya alan parlak mikroskop altında gözlemlemek. CSC içeren plaka floresan mikroskop amaçta yerleştirin. Hücreleri odaklanmak için büyütme oranını oldukça düşük (10 X) ayarlayın. Faz kontrast diyafram hücreleri gözlemlemek için kullanın. 20 X büyütme objektif lensi değiştirerek artırmak ve CSCs. artış hedefi 40 X görüntü ve CSCs görüntü. İki gün, CSCs neredeyse yuvarlak şekil, ama zamanla ve yedi gün içinde hücre artar boyutu görünür, CSCs şekli (Şekil 1A - 1 C) neredeyse silindirik görünür.
- CSCs immunostaining işaretli pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 veya MicroRNAs) yayılması (Ki-67) (Şekil 2A - 2B) ve kardiyak kökenli/progenitor hücreler (Sca-1, NKX2-5 veya GATA4) gerçekleştirmek (Şekil 3A - 3 C).
- CSCs immunostaining için bir 24-şey kültür plaka 10.000 CSCs tohum.
- (18-24 h) sonra ertesi gün CSCs 300 µL % 4 paraformaldehyde 10 dk için fix.
- Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
- CSCs 0,2 Triton X-100 10 dakikadır PBS içinde seyreltilmiş % 300 µL ile permeabilize.
- Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
- CSCs PBST içinde seyreltilmiş % 1 BSA 300 µL ile engelleme gerçekleştirmek (PBS + %0,1 ara 20) veya 1 h için PBST içinde seyreltilmiş % 10 normal tavuk serum 300 µL.
- Birincil antikor çözüm gecede 4 ° C'de engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya Birincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.
- Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
- İkincil antikor çözüm engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya (bkz. Adım 4.2.6) Oda sıcaklığında 1 h için. İkincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.
- Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
- CSCs DAPI 200 µL ile counterstain (1 µg/mL) seyreltilmiş PBS için 5 dak.
- CSCs 1 yıkama x 500 µL buz gibi PBS ile. Daha sonra buz gibi PBS 300 µL her kuyuya ekleyin.
- Bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleme gerçekleştirmek. Imaging, plaka üzerinde doğrudan güneş ışığı önlemek gibi floresan yönergeleri izleyin. Kültür plaka mikroskop altında tutun. Hücreleri farklı büyüklüklerde, odaklan. Faz kontrast ve/veya farklı uyarma filtreleri altında hücreler gözlemlemek ve görüntüleri kaydetmek.
- Plaka karanlıkta 4 ° C'de depolayın
5. Cardiomyocyte içine kalp kök hücre farklılaşma
- CSCs farklılaşma için bir 6-şey plaka 2 mL prewarm (37 ° C) ticari olarak temin CSC bakım orta ile 500.000 CSCs tohum.
- CO2 kuluçka 37 ° C'de CSCs içeren plaka kuluçkaya CSCs kadar alt konfluent büyüme çoğalırlar ve takmak izin verir. Orta sarı dönüşürse, kültür orta ile taze bakım orta yerine.
- % 85-%90 confluency prewarm (37 ° C) cardiomyocytes 2 mL ile bakım orta yerine farklılaşma orta. Plaka CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 haftaya kadar kuluçkaya.
- Her 2-3 ö gözlemlemek CSCs morfoloji iyi kültür koşulları sağlamak için değiştirmek her zaman orta sırasında mikroskopla farklılaşma orta değiştirin.
- CSC kültür farklılaşma orta 12 d sonra görüntü CSCs standart bir immunostaining takip ayırt etme belirteçleri için protokol (adımlara 4.2.1 - 4.2.14 bakın). Cardiomyocytes işaretleri (Şekil 4A - 4B) bir ifade için floresan görüntüleri kaydetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu da çalışmanın, CSCs 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J erkek fareler kalpler izole. Burada, biz CSC yalıtım ve pluripotency işaretçileri kullanarak karakterizasyonu için basit bir yöntem sundu. Biz de CSC farklılaşma için zarif bir yöntemi ve cardiomyocytes lineage doğru Ayrıştırılan CSCs karakterizasyonu sundu. Biz 2 için 3-gün-kültürlü CSCs (Şekil 1A ve 1B) faz kontrast mikroskop altında bir Milli şekil morfolojisi gözlenen. CSCs morfoloji bir değişiklik, 7 gün süre içinde kök hücre haline bakım ortamda kültürünün (Şekil 1 c) uzamış bulduk. Biz CSCs pluripotency işaretler için karakterize ve onlar OCT4, SOX2 ve MicroRNAs (Şekil 2A - 2 C) ifade bulundu. Ayrıca CSCs kültür ortamında çoğalırlar ve nükleer silahların yayılmasına karşı işaret Ki-67 (2D rakam) hızlı bulduk. CSCs kardiyak kökenli karakterize için kardiyak Marker Sca-1, NKX2-5 ve GATA4 CSCs içinde ifade belirler. Kültürlü CSCs (Şekil 3A - 3 C) bir ifade kardiyak Marker bulduk. CSCs farklılaşma cardiomyocyte lineage doğru belirlemek için biz CSCs cardiomyocyte farklılaşma ortamda 12 gün boyunca kültürlü. 12 gün sonra biz cardiomyocyte işaretleri Aktinin ve troponin için farklılaştırılmış CSCs görüntüsü ben. Biz cardiomyocyte işaretleri farklılaştırılmış CSCs (Şekil 4A - 4B) ifade edildi gözlenen. Genel olarak, bu sonuçlar Biz başarıyla fare yürekten CSCs izole ve bu CSCs çoğalırlar ve cardiomyocytes lineage doğru ayırt gösterilmektedir.
Şekil 1: kültürlü CSCs morfolojisi. Bu paneller kültürlü CSCs, yani temsilcisi CSCs (A1) 20 X bakım orta ve (A2) 40 X hedefleri, temsilcisi CSCs bakım Orta (), kültür 3 gün sonra kültür 2 gün sonra faz kontrast görüntüleme göster B1) 20 X ve (B2) 40 X hedefler ve temsilcisi CSCs (C1) 20 X bakım orta ve (C2) 40 X hedefleri 7 gün sonra. Ölçek Bar 40 X büyütme için 100 µm ve 20 X büyütme için 200 µm edilir.
Şekil 2: CSCs pluripotency işaretleri karakterizasyonu. Bu paneller pluripotency (OCT4, SOX2 ve MicroRNAs) ve nükleer silahların yayılmasına karşı (Ki-67) işaretleri kültürlü CSCs temsilcisi floresans görüntüleme göster. Paneller A CSCs (A1) 20 X ve (A2) 40 X büyütme OCT4 (yeşil) ve DAPI ifadeler (mavi) gösterir. Panelleri B (B1) 20 X, CSCs ve (B2) 40 X büyütme ifadeler, SOX2 (yeşil) ve DAPI (mavi) gösterir. Paneller C (C1) 20 X, CSCs ve (C2) 40 X büyütme MicroRNAs (yeşil) ve DAPI ifadeler (mavi) göster. Paneller D CSCs (D1) 20 X ve (D2) 40 X büyütme ifadeler DAPI ve Ki-67 (kırmızı) (mavi) göster. Ölçek Bar 40 X büyütme için 100 µm ve 20 X büyütme için 200 µm edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kardiyak işaretleri CSCs karakterizasyonu. Bu paneller temsilcisi floresans görüntüleme kültürlü CSCs kalp işaretleri göster. Paneller A ifadeler, DAPI (mavi) ve ani kalp durması-1 (kırmızı) (A1) 20 X, CSCs ve (A2) 40 X büyütme gösterir. Paneller B CSCs (B1) 20 X ve (B2) 40 X büyütme NKX2-5 (yeşil) ve DAPI ifadeler (mavi) göster. Panelleri C (C1) 20 X, CSCs ve (C2) 40 X büyütme ifadeler, DAPI ve GATA4 (kırmızı) (mavi) gösterir. Ölçek Bar 40 X büyütme için 100 µm ve 20 X büyütme için 200 µm edilir.
Şekil 4: CSC farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage karakterizasyonu. Bu paneller temsilcisi göster faz kontrast ve 12 gün Ayrıştırılan CSCs.(a)floresan görüntüleme Bu panel gösterir cardiomyocyte işaretçisi Aktinin ifade içinde farklılaşmış CSCs, (a) ile bir faz-sözleşme görüntü (b ) Floresan görüntü DAPI (boyama çekirdeği), Aktinin (yeşil) (c) bir floresan görüntü ve panelleri bir - c(d) birleştirilmiş bir görüntü. Büyütme 40 X vardır. (B) Bu panel cardiomyocyte işaretçisi troponin ı CSCs (bir) bir faz-sözleşme görüntü, (b) bir floresan görüntü ile DAPI (boyama çekirdeği), (c) bir floresan görüntü Ayrıştırılan ifade gösterir Troponin ı (yeşil) ve (d) panelleri bir - cbirleştirilmiş bir görüntü. Büyütme 40 X vardır. Ölçek Bar 40 X büyütme için 100 µm ve 20 X büyütme için 200 µm edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: CSC yalıtım, kültür ve farklılaşma farklı adımları şematik gösterimi. Dört beş yetişkin fareler cerrahi olarak kaldırılan kalpler CSCs yalıtımı için kullanılan. Kademeli işleminin CSC yalıtım, kültür ve farklılaşma doğru cardiomyocytes soy sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu CSC yalıtım protokol kritik adımları aşağıdaki gibidir. 1) steril bir koşul fareler kalplerin çıkarılması için muhafaza edilmelidir. Kalp ayıklama sırasında herhangi bir kirlenme CSCs. 2 kalitesini bozabilir) kan tamamen birkaç yıkar bütün kalp ve kalp tarafından HBSS çözüm taşlarla yapılır kalp kıyma önce kaldırılmalıdır. 3) kalp parçaları tamamen içine bir tek hücre süspansiyon collagenase çözüm ile lysed gerekir. 4) polysucrose ve sodyum diatrizoate degrade çözüm hücreleri ayrılması için prewarmed gerekir. 5) orta CSC kültür için prewarmed gerekir. 6) düşük confluency içinde onların morfolojisi CSCs değiştirmek için bir kültür tabak içinde tohum sırasında CSCs izdiham yüksek olmalıdır. 7) CSC numarayı yalıtım kalp ve kaplama bir kültür çanak içine önce sonra attı. CSCs kalp izolasyonu verimliliğini gösterir. CSCs sayım kültür plaka CSCs tohum için önemlidir.
Biz yetişkin fareler kemirgen modelleri23,28diğer müfettişler tarafından kullanılan CSCs yalıtmak için kullanılır. CSCs yenidoğan kemirgen kalpler29,-30 ve hatta bir insan kalbi31biyopsi ayrılmış olabilir. Daha önce raporlanmış CSC yalıtım protokolleri daha az verim, karmaşık yalıtım yordamı, farklılaşma ve daha az cardiomyocyte farklılaşma potansiyeli32,33, uzun bir süre gibi bazı kısıtlamalar bulunmaktadır 34. burada sunulan CSC yalıtım iletişim kuralı basit: daha kısa sürer ve maliyet-etkin ve CSC verim daha verimlidir. Ayrıca, izole CSCs Sca-1+ ve (fare CSCs iyi kabul edilen avans) are (rakamlar 1A1 - 3 c 2). CSCs farklılaşma için üç ila dört hafta35,36diğer protokoller gerekir. Ancak, bu iletişim kuralını 12 gün (rakamlar 4A - 4B) gerektirir. Burada sunulan degrade Santrifüjü göre CSC yalıtım ~1.8 milyon CSCs dört erkek fareler kalpler verir.
CSCs verimi yüksek olsa da, bir bu protokolü homojenlik ve izole CSCs saflığı kısıtlamadır. CSCs yok tek kabul edilebilir işaretçisi olduğundan, bir tek hücre yüzey marker CSCs seçerken kullanmak zordur. Ancak, bu iletişim kuralı tarafından izole CSCs CSCs belirli bir işaret veya CSCs, floresans aktif hücre sıralama kullanarak birkaç işaretleri temel Tekdüzen nüfusu elde etmek için kullanılabilir. Böylece, bu yöntem CSC yalıtım ile yüksek verim düşük maliyetli ve tek tip bir CSC popülasyonun belirli hücre yüzeyine marker(s) almak için seçeneği vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser, parçalar, HL-113281 ve HL116205 Paras Kumar Mishra için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
