Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהבעת משותפת של RNA chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. המוצר העיקרי הוא מולקולה מעגלית המקל על טיהור עד הומוגניות.

Abstract

עם הגדלת ההתעניינות RNA ביולוגיה והשימוש של מולקולות RNA ביישומים הביו-טכנולוגיה מתוחכמת, השיטות להפקת כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי מוגבלים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהתבסס על ביטוי משותף של מולקולה chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. Viroids הם RNAs עגול קטן יחסית, ללא קידוד, מאוד בסיס לזווג שאינן זיהומיות צמחים גבוהים יותר. המארח לשתול tRNA ליגאז הוא אנזים גויס על ידי viroids שייך למשפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd), לתווך RNA circularization במהלך וירואיד שכפול. למרות ELVd לא לשכפל ב e. coliקודמן ELVd ביעילות עיבד על ידי e. coli RNA פולימראז, עיבדה את ribozymes האמרהאד מוטבעים תאים חיידקיים, שנוצר מונומרים הם circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף להגיע ריכוז יוצא דופן. החדרת RNA עניין לתוך לגרדום ELVd מאפשר הייצור של עשרות מיליגרם רקומביננטי RNA לליטר של התרבות חיידקי בתנאי מעבדה רגיל. שבר העיקרי של המוצר RNA היא מעגלית, תכונה המאפשרת הטיהור של הרנ א רקומביננטי כדי הומוגניות וירטואלי. ב פרוטוקול זה, תואמת DNA (cDNA) משלימים ל RNA עניין נוסף במצב מסוים של cDNA ELVd ב פלסמיד ביטוי המשמש, לאורך פלסמיד לבטא משותפת ליגאז tRNA חציל, להפוך את החיידק. ביטוי משותף של שתי מולקולות תחת השליטה של היזמים מכוננת חזק מוביל לייצור כמויות גדולות של הרנ א רקומביננטי. הרנ א רקומביננטי יכול להיות שחולצו מן התאים חיידקי, הופרדו עיקר RNAs חיידקים ניצול של מעגליות שלה.

Introduction

בניגוד DNA, חלבונים, פרוטוקולים לייצור קל, יעיל וחסכוני של כמויות גדולות של RNA אינם בשפע. עם זאת, המחקר והתעשייה דרישה להגדיל כמויות של מולקולות אלה כדי לחקור תכונות ביולוגיות ייחודיות שלהם1, או להיות מועסק ב מתוחכמים ביוטכנולוגי יישומים, כולל שימוש ספציפי מאוד aptamers 2, סוכני טיפולית3או הדברה סלקטיבי4. תמלול במבחנה, סינתזה משמשים במחקר לייצר RNA. עם זאת, שיטות אלה כרוכה מגבלות חשובות כאשר כמויות גדולות של המוצרים נדרשים. החלופה ההגיונית היא להשתמש את מכונות שעתוק אנדוגני של תאים חיים, ואחריו תהליך טיהור להפריד את RNAs עניין חבריו הסלולר. בעקבות אסטרטגיה זו, פותחו שיטות כדי לייצר RNAs רקומביננטי בתאי חיידקים, כגון המעבדה-הידידותית Escherichia coli5 או את ימית סגול phototrophic האלפא-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. לרוב השיטות לייצור RNA רקומביננטי בחיידקים להסתמך על הביטוי של לפיגום RNA יליד יציב מאוד, כגון להוסיף tRNA או של rRNA, בהן הרנ א עניין הוא7. זה מטיל את ההכרח משחרר את הרנ א עניין מחוץ מולקולת chimeric, אם הנוכחות של RNA נוספת היא בעיה עבור יישומי הזרם8. המושג ב רקומביננטי ביוטכנולוגיה RNA הוא הייצור של מכלולים ribonucleoprotein רקומביננטי ייתכן המוצר הרצוי כשלעצמו או השתמשו כאסטרטגיה מגן כדי להגביר את היציבות RNA של ריבית9, 10. באופן דומה, הייצור של RNAs מעגלית גם הוצע כאסטרטגיה לייצר מוצרים יציב יותר11.

לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה להפקת כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב e. coli המשתתפת בשלוש מתוך המושגים לעיל: החדרת את הרנ א ביקוש לפיגום RNA מעגלי יציב מאוד וביטוי שיתוף רקומביננטי RNA עם חלבונים אינטראקציה לייצר סביר של ribonucleoprotein יציב מורכבים שמצטבר בכמויות מדהים בבקטריאלי תאים12. בניגוד התפתחויות הקודם, השתמשנו זר לחלוטין כדי e. coli, כלומר וירואיד של RNA לגרדום. Viroids הם סוג מאוד מסוים של מדבקים של צמחים גבוהים יותר באופן בלעדי היוו מאת קטן יחסית (246-401 nt) מאוד בסיס לזווג מעגלית רנ א13. מעניין, viroids הם ללא קידוד RNAs, בלי עזרה של חלבונים משלהם, הם מסוגלים להשלים את מורכבות מחזורים זיהומיות ב לנשאים נגועים14. מחזורים אלה כוללות שכפול רנ א-ל-RNA גרעינים או מהכלורופלסט, בהתאם משפחת וירואיד —Pospiviroidae או Avsunviroidae, בהתאמה – תנועה דרך צמחים נגועים התחמקות של התגובה ההגנתית המארח. Viroids חייב להיות מדורגת בין RNAs היציב ביותר בטבע, כתוצאה להיות ה-RNA מעגלי עירומים ויש להם לשרוד בסביבה עוינת של תאי צמחים נגועים. מאפיין זה עלול להפוך viroids מתאים במיוחד כמו פיגומים לייצב רקומביננטי RNA בגישות הביו-טכנולוגיה. בנוסף, השיטה החדשה מבוססת על שיתוף לביטוי לגרדום וירואיד עם חלבון אינטראקציה הצמח. Viroids שכפל באמצעות מנגנון מתגלגל-מעגל בפונדקאי אשר מגויסים אנזימים כדי לעודד את השלבים השונים של התהליך. בייחוד את viroids קצת, ליתר דיוק אלה השייכים המשפחה Avsunviroidae15, מכילים ribozymes המעורבים גם שכפול. תלוי בזן וירואיד, שעתוק של וירואיד RNAs מתווך על-ידי המחשב המארח RNA פולימראז II או את chloroplastic הגרעיני מקודד ה-RNA פולימראז (NEP). וירואיד RNA עיבוד נראה להיות מזורז על-ידי מחשב מארח RNase סוג-III, למרות ב viroids עם ribozymes oligomeric RNA intermediates עצמית קליב במהלך שכפול. בסופו של דבר, שנוצר מונומרים וירואיד הם circularized, בהתאם משפחת וירואיד, את מארח ה-DNA ליגאז 1 או איזופורם chloroplastic tRNA ליגאז16,17. אנזים זה האחרון מעורב מצדו של צורות monomeric של viroids משפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd)18.

במהלך עבודה כדי לנתח את הדרישות רצף מבניים של ELVd הקובעים הכרה על ידי החציל (סולנום melongena ל') ליגאז tRNA, הקמנו מערכת ניסיוני המבוסס על ביטוי משותף של שתי מולקולות ב e. coli 19. הבחנו כי עוד יותר-יחידות ELVd תעתיקים עצמית קליב ביעילות בתאים e. coli עד ribozymes האמרהאד מוטבע וכי וירואיד שנוצר מונומרים עם 5'-הידרוקסיל, 2', טרמיני 3'-phosphodiester circularized ביעילות על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף חציל. אפילו יותר, RNA מעגלי וירואיד וכתוצאה מכך להגיע של ריכוז גבוה לא צפוי ב e. coli, מעבר. rRNAs אנדוגני12. היעדר שכפול intermediates הצביעו על חוסר ELVd רנ א-ל-RNA הגברה תאים חיידקיים אלה. מעניין, החדרת heterologous RNAs במצב מסוים של המולקולה וירואיד הייתה השפעה מתונה על הצטברות של מעגלי נגזר וירואיד RNAs12. תצפיות אלה גרמו לנו לדמיין שיטה לייצר כמויות גדולות של רקומביננטי RNAs בחיידקים. בשיטה זו, cDNAs התואמים RNAs עניין הנוספים של cDNA ELVd, הרנ א chimeric וכתוצאה מכך זה מתבטא ב e. coli דרך מקדם מכוננת חזקה. עבור מערכת לעבודה, e. coli ולשוד במשותף עם פלסמיד לבטא את ליגאז tRNA חציל. בתמליל עוד יותר-יחידות הנגזרות ELVd יעובד על-ידי ribozymes האמרהאד מוטבע, שנוצר מונומרים עם טרמיני המתאים מזוהה, circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף. בדרך זו, הרנ א עניין מוכנס לתוך לפיגום מעגלית יציב מאוד המורכב של המולקולה המעגלית וירואיד. רנ א רקומביננטי זה chimeric היא ככל הנראה עוד התייצב בתוך התאים e. coli על ידי היווצרות ribonucleoprotein מורכבים תוך אינטראקציה עם ליגאז tRNA. בשיטה זו (ראה פרוטוקול להלן), RNA aptamers, סיכת ראש RNAs RNAs מובנים אחרים יש כבר בקלות מיוצר בכמויות של עשרות מיליגרם לליטר של e. coli תרבות בתנאי מעבדה רגיל וטיהרו את ההומוגניות לוקח היתרון של מעגליות12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פלסמיד בנייה

  1. להגביר את ה-PCR (או על ידי שעתוק במהופך PCR אם החל תבנית הרנ א) cDNA התואם הרנ א עניין באמצעות תחל עם סיומת 5' כדי לאפשר הרכבה לתוך פלסמיד הביטוי. כדי למנוע מוטציות בלתי רצויה, להשתמש אמינות גבוהה DNA פולימראז.
    1. כדי להוסיף את cDNA פלסמיד ביטוי גיבסון הרכבה20, להוסיף סיומות 5' הבאות תחל ה-PCR: קדימה, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; הפוך, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X מייצג נוקלאוטידים הומולוגי לקצה מסוף הרנ א עניין.
    2. תקופת דגירה של 30 s ב 98 ° C, ואחריו מחזורים של 10 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C ו- 30 s 72 ° C, ואת סיומת הסופי של 10 דקות-72 מעלות צלזיוס.
  2. תקציר 100 ננוגרם של פלסמיד pLELVd-BZB עם 10 U של האנזים הגבלת סוג-IIS Bpi אני עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב תגובה 20 µL 0.5 מ ל צינור במאגר G (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ MgCl2, 50 מ מ NaCl 0.1 מ"ג/מ"ל BSA).
    הערה: פלסמידים כל זמינים על פי בקשה למחבר המתאים. אקדמיית קנוסה אני שווה ל- Bbs אני.
  3. הפרד את המוצרים PCR לעיכול על ידי אלקטרופורזה ב 1% ג'ל agarose טה מאגר (40 מ מ טריס, חומצה אצטית, EDTA 1 מ מ, 20 מ מ pH 7.2). מכתים את ג'ל למשך 15 דקות ע י ניעור ב- 200-מ ל 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד. לדמיין את הדנ א באמצעות transilluminator UV וחותכים הלהקות התואם את cDNA מוגבר, את אקדמיית קנוסה -עיכלתי פלסמיד (2046 bp) באמצעות סכין ומהדקים.
    הערה: אקדמיית קנוסה אני העיכול של pLELVd-BZB משחרר גם מוצר bp 528 המתאים הכתב LacZ כחול-לבן.
  4. Elute את DNAs מן השברים ג'ל תוך שימוש בעמודות סיליקה ג'ל (ג'ל ה-DNA שחזור ערכת שולחן שלחומרים) ולכמת את ריכוז הדנ א על ידי ניתוח spectrophotometric.
  5. להגדיר את תגובת הרכבה גיבסון באמצעות את cDNA מוגבר של פלסמיד מעוכל. השתמש של עודף טוחנת 3-fold של הוספה לעומת וקטור20. תקופת דגירה של h 1 ב 50 מעלות צלזיוס, לטהר את המוצרים תגובת משתמש בעמודה סיליקה ג'ל (DNA נקי & רכז ערכת את השולחן של חומרים).
  6. להשתמש במוצרים מטוהרים של התגובה הרכבה גיבסון electroporate המוסמכת e. coli DH5α תאים. בעזרת וואקום אלקטרופורציה 1 מ מ, להחיל את ההגדרות הבאות: 1,500 V ו- 5 גב' Incubate עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב מרק סופר ממוטבת עם דיכוי catabolite (SOC; טריפטון 20 g/L, תמצית שמרים 5 g/L, 0.5 g/L NaCl, 2.5 מ מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2 גלוקוז 20 מ מ, pH 7.0) בינוני נוזלי, התפשטה ואז על גבי לוריה-Bertani (ליברות; טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L, 10 גרם/ליטר NaCl) המכיל אמפיצילין µg/mL 50 פלטות אגר (1.5%).
    1. על המסך עבור מושבות המתאים טרנספורמציה e. coli שיבוטים המביאות סביר להניח את תותב, 15 דקות לפני ציפוי תאי electroporated, להפיץ µL 30 של 50 מ"ג/מ"ל 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) ב dimethylformamide. דגירה צלחות בן לילה ב 37 º C.
  7. לבחור מספר מושבות לבן ולגדול בן לילה ב 37 ° C בתקשורת LB נוזלי. לטהר פלסמידים באמצעות miniprep של קיט (ראה טבלה של חומרים) וניתוח הגדלים שלהם על ידי אלקטרופורזה ב 1% ג'ל agarose טה מאגר.
  8. בחר את פלסמיד רקומביננטי סביר המבוסס על הגירה electrophoretic בהשוואה הפקד pLELVd-BZB. לאשר את רצף פלסמיד שנבחרו על ידי רצף באמצעות תחל 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' ו 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' זה לאגף את הקלטת כל ביטוי ב- pLELVd-BZB.
    הערה: זכור כי זה פלסמיד מכיל polylinker bp 528 עם הסמן LacZ זה מוחלף על-ידי cDNA עניין. הגבלת מיפוי עשוי לעזור כדי לבחור את פלסמידים נכון רקומביננטי.

2. RNA ביטוי

  1. Co-electroporate (ראה תנאי ב- 1.6) הנבחר e. coli זן (e. coli BL21 או נגזרת BL21) עם pLELVd-BZB-הנגזרת המכיל את cDNA התואם ה p15LtRnlSm פלסמיד ועניין לבטא במשותף חציל ליגאז tRNA. השתמש את e. coli HT115(DE3), אשר חסרה RNase השלישי21, לבטא RNAs עם אזורי זמן כפול גדילי.
    הערה: הן את הרנ א של עניין ליגאז את סינתזת mRNA משוקלטים על ידי e. coli RNA פולימראז. אין lysogen DE3 כדי להביע T7 RNA פולימראז נדרש המתח e. coli , למרות נוכחותם של lysogen הזה יש אין השפעות מזיקות.
  2. לאחר דגירה 1 h ב 37 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי SOC, צלחת electroporated חיידקים במדיום מוצק LB המכיל אמפיצילין µg/mL 50 ו- 34 כלורמפניקול µg/mL. דגירה בין לילה ב 37 º C.
  3. לאסוף מושבה ואת לחסן 1 ליטר התפישה Erlenmeyer הבקבוק עם 250 מ של נוזלי מרק נהדר (TB) בינונית (טריפטון 12 g/L, 24 g/L שמרים תמצית, 0.4% גליצרול, 0.17 מ' ח'2PO4ו- 0.72 M K-2-HPO-4), המכיל אמפיצילין µg/mL 50 34 כלורמפניקול µg/mL. דגירה ב 37 ° C עם טלטול נמרץ ב 180 סיבובים לדקה (סל ד). הקציר חיידקים בין 12 ל- 16 שעות לאחר חיסון תרבות.

3. RNA מיצוי וטיהור

  1. למטרות אנליטית, לקחת 2 מ"ל aliquots של התרבות בנקודות הזמן הרצויים צנטריפוגה ב x 14,000 g עבור 2 דק. להשליך תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 50 טה מאגר (10 מ מ EDTA טריס-HCl, pH 8.0 ו- 1 מ מ) על ידי vortexing.
    1. הוסף אמצעי אחסון אחד (50 µL) של שילוב 1:1 (v/v) של פנול (רווי מים ו- equilibrated ב- pH 8.0 עם טריס-HCl, pH 8.0), כלורופורם. לשבור את התאים על ידי vortexing נמרצת ולהפריד את שלבי מימית ואורגניים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 14,000 x g.
    2. בזהירות לשחזר את שלבי מימית (העליון) המכילה סה כ RNA חיידקי.
      הערה: ניתן לאחסן ההכנות ב-20 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר.
  2. למטרות מפוח, יוצקים תרבות לתוך הבקבוק צנטריפוגה 250 מ ל ספין למטה תאים ב 14,000 x g עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 30 מ ל מים. להעביר את שפופרת צנטרפוגה, ספין למטה התאים שוב תחת באותם התנאים.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend התאים 10 מ"ל של מאגר כרומטוגרפיה (50 מ מ טריס-HCl, pH 6.5, 150 מ מ NaCl, 0.2 מ מ EDTA) על ידי vortexing.
    הערה: בשלב זה, תאים שיכול להיות קפוא ב-20 ° C כדי להמשיך בטהרה בכל רגע אחר.
  4. באמצעות הכנה חיידקי טריים או המופשרים, לשבור את התאים על ידי הוספת נפח 1 (10 מ ל) של פנול: כלורופורם (ראה שלב 3.2) ו vortexing נמרצות.
  5. צנטריפוגה 10 דקות ב 12,000 x g, לשחזר את פאזה מימית, לחלץ מחדש עם נפח 1 (10 מ ל) של כלורופורם תחת באותם התנאים.
    הערה: הכנת RNA ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס בנקודה זו.
  6. בהמשך לטהר RNA חיידקי הכולל על-ידי החלפת אניון כרומטוגרפיה. לסנן ההכנה RNA דרך מסנן מזרק מיקרומטר 45 עומס על עמודה 1 מ"ל diethylethanolamine (DEAE).
    1. כרומטוגרפיה-טיהור, לשימוש מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בספיקה של 1 מ"ל לדקה. לפני לדוגמה טוען, equilibrate את העמודה עם 10 מ"ל של מאגר כרומטוגרפיה (ראה שלב 3.3 עבור הרכב).
    2. לטעון את הדגימה ולשטוף את העמודה עם 10 מ"ל כרומטוגרפיה המאגר. Elute RNA עם 20 מ של מאגר • תנאי (50 מ"מ טריס-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 מ מ EDTA) ולאסוף aliquots 1 מ"ל.
      הערה: RNA elutes במהירות בחלקים הראשונית. העמודה עשויה להיות שימוש חוזר עבור עוד יותר purifications. בשביל זה, לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל מים ולאחסן ב 4 ° C ב- 20% אתנול.
  7. מאז חלק מרכזי רקומביננטי ש-RNA שמצטבר e. coli בטופס מעגלית, מאפיין זה יכול להיות שהרוויח לטיהור הומוגניות12. להפריד RNAs מעגלית עמיתיהם ליניארי על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית לזיהוי בג'ל (עמוד 2D) המשלב הלא-denaturing and denaturing (אוריאה מ' 8) התנאים12,22.

4. RNA ניתוח

  1. הכנת ג'ל לזיהוי 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, יחס מסת) ב TBE מאגר (89 מ"מ טריס, 89 מ מ פנמיות, 2 מ מ EDTA) המכילה אוריאה שמונה מ'.
  2. מיקס 20 µL של RNA ההכנות עם נפח 1 (20 µL) של טעינת מאגר (98% formamide, 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.0025% bromophenol כחול, ו 0.0025% קסילן cyanol), תקופת דגירה של 1.5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום, והכנס מגניב על קרח.
  3. לטעון את הדגימות הג'ל לזיהוי ולרוץ אלקטרופורזה של תנאים מתאימים בהתאם לממדי ג'ל (למשל, לרוץ 140 x 130 x 2 ג'לים מ מ עבור 2.5 h ב- 200 וולט). מכתים את ג'ל למשך 15 דקות 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד, לשטוף עם מים, והמחש RNA תחת אור UV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לייצר רקומביננטי RNA ב e. coli באמצעות מערכת ELVd-derived12, הרנ א עניין הוא הושתל לתוך לגרדום ELVd RNA. רנ א chimeric זו היא ביטוי במשותף לאורך ליגאז tRNA החציל ב- e. coli. לאחר עיבוד, ביקע, circularized, RNA מעגלי chimeric, שממנו הרנ א עניין בולט, סביר להניח צורות מורכבות עם האנזים חציל ביטוי במשותף המגיע ריכוז יוצא דופן התאים חיידקי ( ribonucleoprotein איור 1). כתוצאה מכך, הצעד הראשון כדי לייצר רקומביננטי RNA באמצעות מערכת זו כוללת החדרת את cDNA התואם הרנ א עניין לתוך תפקיד מסוים ב cDNA ELVd, T245-T246 ב- variant רצף ELVd AJ536613. פלסמיד pLELVd-BZB, אשר מכיל את polylinker על זה הצב עם שני Bpi אני זיהוי אתרים, גן כחול/לבן סמן LacZ, מקלה על ההכנסה הזאת על ידי יעילה מאוד גיבסון הרכבה שיטת20. הבחירה של טרנספורמציה e. coli שיבוטים המכיל פלסמידים רקומביננטי הרצוי בהנחייתם של ההקרנה כחול/לבן של LacZ סמן. פלסמידים שבהם כפול Bpi אני לעיכול לא היה שלם, לא לכלול את המושבות סביר תוצרת כחול הוספה בנוכחות X-גל. איור 2 מציג ניתוח electrophoretic של מספר פלסמידים רקומביננטי שבו הוכנסו cDNAs שונים. פלסמידים אלה מראים העברות שונות בהשוואה ל- pLELVd-BZB. הערה את pLELVd-BZB מכיל את סמן LacZ (528 bp) זה מוחלף על-ידי cDNA התואם הרנ א עניין. אז, אם כי זה תלוי בגודל של cDNA מוספים, פלסמידים רקומביננטי בדרך כלל העברת מהר יותר פלסמיד שליטה (איור 2).

PLELVd-BZB-נגזרים המכילים את cDNAs התואמים RNAs עניין משמשים לאורך p15LtRnlSm כדי co-electroporate e. coli. חיידקים משותפת טרנספורמציה ייבחרו על צלחות המכיל אמפיצילין, כלורמפניקול. לאחר מכן, נבחר e. coli שיבוטים הם מגדלים ב 37 ° C עם עצבנות חזקה במדיום טרה-בתים עשירים. בתנאים תרבות זו, ייצור רקומביננטי שרנ א היא מוגדלים12. הנוכחות של הרנ א רקומביננטי של החיידק ניתן לנטר בקלות על ידי שבירת התאים עם שילוב של פנול כלורופורם בנוכחות מאגר וניתוח של RNA, המחיצות במאגר מימית, מאת denaturing דף. איור 3 הצג אתידיום ברומיד מוכתם ג'לים לזיהוי ב אילו RNAs הכולל מ שונים e. coli הופרדו שיבוטים. התמונות להראות להקות חזקות המתאימות ELVd ריק וצורות ELVd chimeric שבו הוכנסו RNAs שונות של עניין. מעניין אנו מוצאים חלק מרכזי של הרנ א רקומביננטי כטופס מעגלית. באמצעות שילוב של שני עמודים תחת תנאים denaturing בחוזק גבוה ונמוך יוניים, מעגליות של השבר הראשי של רקומביננטי RNA יכול להיות בקלות שנצפו (איור 4).

בהתאם ליישום במורד הזרם, סה כ e. coli RNA הכנה שמכיל את ה-ELVd chimeric של עניין ייתכן המטרה של הפרוטוקול הנוכחי. עם זאת, בעת הצורך, הכנת RNA יכול עוד להיטהר על-ידי אניון חילופי גזים. Chromatogram באיור 5 מראה השמירה יעיל של e. coli RNA על עמודה בכל עוצמת יוניים נמוכה (150 מ מ NaCl) ו • תנאי עוקבות בחוזק יוניים גבוהה (1 M NaCl). רוב הרנ א נאסף בחלקים 2 ו- 3. לטהר את הרנ א רקומביננטי כדי הומוגניות, ניתן לקחת יתרון של מעגליות. RNAs מעגלית איחרו ביחס מקביליהם ליניארי denaturing התנאים22. יכול להיות eluted אלה RNAs מן הג'ל לאחר אתידיום ברומיד מכתים. השימוש solubilizable ג'ל לזיהוי, כגון אלה קישורים צולבים עם N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, מקלה על טיהור של כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי (איור 6).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של מערכת מבוססת וירואיד לייצר רנ א רקומביננטי ב e. coli. CDNA התואם הרנ א עניין (98 nt באורך RNA aptamer תרד בערכת) מוכנס לתוך פלסמיד pLELVd-BZB. E. coli הוא טרנספורמציה במשותף עם p15LtRnlSm pLELVd-BZB-נגזרת של פלסמיד לבטא משותפת ליגאז tRNA חציל. ב E. coli, בתמליל ELVd-תרד RNA chimeric הוא cleaved עצמית (אדום ראשי חץ) על ידי ribozymes האמרהאד וירואיד. מונומר וכתוצאה מכך המוכרות את ליגאז tRNA ביטוי במשותף, circularized. הרנ א רקומביננטי מורכב לפיגום וירואיד מעגלית שממנה בולט הרנ א עניין (בירוק). הצטברות רנ א רקומביננטי לכמויות גדולות ב e. coli סביר נובעת ייצוב ribonucleoprotein מורכבים עם ליגאז tRNA. בנוסף הפיצול cDNA ELVd, פלסמיד pLELVd-BZB כוללת מקור שכפול של pUC (אורי pUC), ג'ין הבחירה של אמפיצילין (AmpR), יזם מאתר ליפופרוטאין (lpp) של e. coli ו המחסל rRNA (rrnC) של LacZ סמן. פלסמיד p15LtRnlSm מכיל מקור שכפול של p15A (אורי p15A), גן עמידות כלורמפניקול (ס מR), יזם את e. coli lpp בסיים שעתוק phage T7, בנוסף cDNA ליגאז חצילים tRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח Electrophoretic של pLELVd-BZB-נגזר הביטוי פלסמידים המכילים cDNAs שונות של עניין. פלסמידים היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה ב 1% agarose ג ' ל הוכתם אתידיום ברומיד. ליין 1, סמן הדנ א עם מידות kbp של חלק מהרכיבים בצד השמאל; ליין 2, pLELVd-BZB; ליין 3, pLELVd-BZB נגזרת לבטא ELVd ריקה; נתיבים 4-7, pLELVd-BZB נגזרים לבטא את aptamer RNA תרד (ליין 4), aptamer מחייב את streptavidin (ליין 5), סיכת ראש של RNA עם רציף 42 bp גדילי כפול אזור (ליין 6), ואת את 3' תלוי cap-תרגום enhancer (CITE) של צמח וירוס (ליין 7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: רנ א רקומביננטי מיוצר e. coli באמצעות מערכת מבוססת וירואיד. RNAs הכולל מ שונים e. coli שיבוטים חולצו על ידי טיפול עם פנול: כלורופורם וב aliquots מופרדים על-ידי denaturing דף. ג'לים מוכתם אתידיום ברומיד מוצגים. RNAs רקומביננטי הופקו ב e. coli (א) BL21(DE3) ו- HT115(DE3) (B). (A ו- B) נתיבים 1, סמן RNA עם גדלים ב- nt בצד השמאל; מסלולים 2, RNAs מ e. coli שיבוטים לבטא ELVd ריקה (333 nt). מסלולים (א) 3 ו-4, RNAs מ e. coli שיבוטים כדי לבטא את ELVd chimeric של טופס המכיל את aptamer תרד (98 nt) ו aptamer מחייב את streptavidin (42 nt), בהתאמה. ליין (B) 3, RNAs של שיבוט e. coli לבטא chimeric ELVd טופס המכיל של RNA bp-לונג נטושים כפול 42. חצים אדומים הצבע RNAs רקומביננטי מעגלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: מעגליות של הרנ א רקומביננטי מיוצר e. coli באמצעות מערכת מבוססת וירואיד. RNAs הכולל של שיבוט e. coli לבטא ELVd chimeric, שמכיל את aptamer תרד היו מופרדים על ידי 2D denaturing דף ראשון מתחת לגובה ולאחר מכן תחת עוצמת יוניים נמוכה. ג'לים היו מוכתמות אתידיום ברומיד. החצים הכחולים מצביעים על כיווני הגירה electrophoretic. החץ האדום מצביע על מעגליות ELVd-התרד זה מתעכב באופן סלקטיבי מ עמיתיהם ליניארי בגודל זהה במהלך שתי הפרדות הצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: טיהור כרומטוגרפי של RNA חלבון המיוצר ב e. coli באמצעות מערכת מבוססת וירואיד. RNAs הכולל של שיבוט e. coli שמייצר chimeric ELVd-3' CITE (55 nt) נטענו על עמודה כרומטוגרפיה DEAE נשטף בנוכחותו של 150 מ מ NaCl. RNA היה eluted בנוכחות 1 M NaCl. Chromatogram מראה ספיגת 254 ננומטר (קו כחול), מוליכות mS/ס מ (קו כתום) לעומת נפח. השלבים השונים ההפרדה כרומטוגרפי (equilibration, הזרקה, לשטוף, • תנאי ועמודה התחדשות) מסומנים. שברים שנאספו גם מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: טיהור עד הומוגניות של חלבון ה-RNA מיוצר e. coli באמצעות מערכת מבוססת וירואיד. RNAs הכולל של שיבוט e. coli שמייצר chimeric ELVd-3' CITE היו קודם מטוהרת על-ידי גזים באמצעות עמודה DEAE-Sepharose, ואז כשהם מופרדים באמצעות דף 2D. ג'ל הראשון היה לפעול תחת denaturing תנאים (אוריאה 8 מ', מאגר TBE). לאחר צביעת עם אתידיום ברומיד, הלהקה ג'ל המכיל את הצורה המעגלית של הרנ א רקומביננטי הועברה לחלק העליון של ג'ל השני היה לפעול בתנאי שאינם denaturing (מאגר טה). אקרילאמיד של הג'ל השני היה צולבים N, N'-cystamine bis (acryloyl), אשר אפשרה solubilization של השבר ג'ל שהכיל את הרנ א רקומביננטי טהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כשחיפשתי את רצף ELVd ודרישות מבנה מעורב ההכרה על ידי ליגאז tRNA חציל, שמנו לב את הביטוי שיתוף של שתי מולקולות ב-פונדקאי e. coli הוביל הצטברות גדולה לא צפויה של וירואיד מעגלית טפסים תאים חיידקיים19. הבנו כי הצטברות גדולה של וירואיד RNA ב e. coli ככל הנראה היה התוצאה של שיתוף לבטא מולקולה RNA יציב מאוד, כגון קטן יחסית (333 nt), מאוד מבוסס-מזווג, וירואיד מעגלית, חלבון עבורם וירואיד מסוים מציג זיקה גבוהה. ELVd RNA לגייס את ליגאז tRNA מארח לתווך שלה circularization במהלך שכפול בתוך הצמח הנגוע ה-17. אמנם אין לנו אישור ניסויי, אנו צופים כי שתי מולקולות טופס על ribonucleoprotein מורכבים ב e. coli נוסף מייצבת את וירואיד RNA ומאפשר להגיע ריכוז יוצא דופן של 150 מ"ג לליטר בקטריאלי תרבות אשר גבוה בהרבה מאלה RNAs אנדוגני, כגון rRNAs12. מאחר ELVd לא לשכפל ב e. coli, אנחנו הסיק כי ההכנסה של RNA heterologous לא באופן דרמטי להשפיע על הצטברות RNA נגזר וירואיד ואני, למעשה, זה היה המקרה. התבוננות זו היא הבסיס של השיטה כדי לייצר כמויות גדולות של רקומביננטי RNA ב e. coli זה נתאר כאן. השיטה משתמשת מולקולת RNA מעגלי של ELVd בדומה לפיגום שבו מוצג את הרנ א עניין. כדי לייצר לפיגום ELVd מעגלית ב e. coli, עלינו לבטא הקדמה RNA בתחום ריבוזים האמרהאד וירואיד המשוכפלת. ELVd ribozymes עצמית קליב ביעילות רבה ב e. coli ו שנוצר מונומרים וירואיד מזוהה, circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף. שיתוף הבעת ליגאז tRNA היא תכונה מרכזית של המערכת. ELVd RNA הוא זוהה בקושי ב e. coli , אלא אם אנזים מסוים זה הוא ביטוי במשותף12.

הפרוטוקול שלנו פלסמיד pLELVd-BZB מאפשרת להוסיף את cDNA התואם הרנ א עניין על ידי העצרת גיבסון פשוטה ויעילה בין עמדות U245 ו- U246 של ELVd. אתר זה מקביל למעגל המסוף של נוכח סביר ELVd קונפורמציה24,25סיכת ראש ארוך. הכניסה בתנוחה הזאת חייבים לקדם הרנ א עניין בולטת לגרדום יציב מאוד הנוצרת על-ידי ELVd, עליך להימנע התפלגות האינטראקציה בין את הרנ א עניין ELVd (איור 1). לא בחנו את ההשפעה של הוספת את הרנ א עניין בתפקידים חלופיים של מולקולת ELVd. פלסמיד p15LtRnlSm מאפשר שיתוף הבעת ליגאז tRNA חציל. RNAs משוקלטים בשני פלסמידים תחת השליטה של חזקה המכונן e. coli מקדם, כלומר murein ליפופרוטאין (lpp). זה הופך את המערכת מכוננת עם אין צורך האינדוקציה. עם זאת, אנו בונים גם פלסמיד דומה (p15tRnlSm) כדי לבטא את ליגאז tRNA תחת השליטה של phage T7 RNA פולימראז במערכת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible. באמצעות פלסמיד הזה, הצטברות רנ א רקומביננטי מתרחשת רק לאחר אינדוקציה של tRNA ליגאז הביטוי על-ידי הוספת IPTG12. המערכת הנוכחית, הרנ א עניין מבוטא מ פלסמיד מספר העתק גבוהה עם מקור שכפול pUC, ואילו ליגאז tRNA מתבטא מן פלסמיד מספר העתקה בינונית עם מקור שכפול p15A. אם משנים את עותק מספר בשני פלסמידים מעורב במערכת משפר את הצטברות רקומביננטי יש RNA לא נחקרו עד כה. גודל טווח הרנ א עניין הודה על ידי המערכת לא היה שיטתי נחקרו גם, למרות RNAs קטנים צפויים לוגית לצבירת על ריכוזים גבוהים יותר מאשר בגדולים.

אחת הסיבות מדוע ייצור של RNA רקומביננטי ויוו אינה קלה נובעת ככל הנראה נמוך half-life מהותי של מולקולות RNA. המערכת שלנו אינו זר לבעיה זו. למעשה, מאוחר e. coli הגדלים שלב, הצטברות של רנ א רקומביננטי מתחילה ירידה להיעלם כמעט12. פעולה זו מאלצת את אחד למצוא את החלון הנכון לקצור את התאים. הבחנו, אף, כי חלון זה הוא גדול מספיק כדי להפוך את המערכת ידידותית. עם זאת, גם הבחנו כי החלון האופטימלי תלוי הרבה גורמים, כולל את המסוים e. coli להתאמץ, תרבות בינוני, גדל בתנאים (עצבנות, נפח + בקבוקי שתייה צידניות, משדרים, וכו '.) והשלב פיזיולוגיים של החיידקים משמש כדי להפעיל את התרבות נוזלי. אנו ממליצים החל ייצור RNA רקומביננטי באמצעות טריים e. coli מושבות מצלחת מחוסן ביום הקודם, גדל ב 37 º C. לאחסון צלחות במקרר הופך את החלון הקציר יותר לא צפוי. השגנו את התוצאות הכי עקבי על-ידי הפעלת נוזלי תרביות חיידקים שנקטפו צלחת עם קיסם. השימוש של תרבות טרום נוזלי, במיוחד אם רווי, גם כונני כדי השתנות בפרוטוקול הייצור.

לגבי טיהור, טיפול של תאים חיידקיים עם פנול: כלורופורם הוא באופן יעיל מאוד לשבור את התאים ומאפשר התאוששות כמותית של RNA חיידקי הכולל בשלב מימית. בהתאם ליישום במורד הזרם של רקומביננטי RNA, זו פאזה מימית או הכנה שהם תוצאה של מאיצים את הרנ א מ זו פאזה מימית עם אלכוהול אולי יהיה מספיק אם נוסף טיהור יש צורך, אנו ממליצים אניון חילופי גזים באמצעות עמודה exchange אניון DEAE (איור 5). שלב טיהור זה מאפשר הסרת יעיל DNA חיידקי מטבוליטים זה גם למחיצות בשלב מימית. אם היישום במורד הזרם של הרנ א רקומביננטי דורשת טיהור עד הומוגניות, מערכת נגזר וירואיד מציע יתרון ברור כאשר לעומת שיטות אחרות. מאז שבריר הראשי הרנ א רקומביננטי המיוצר כטופס מעגלית, ניתן לקחת יתרון של מאפיין זה כדי להפריד בין זה לבין עיקר RNAs חיידקי. RNAs מעגלית לחוות עיכוב העברה electrophoretic ב denaturing תנאי ביחס עמיתיהם ליניארי באותו גודל22. עיכוב זה מודגש יותר כאשר ה-RNA הוא electrophoresed תחת כוח יונית נמוכה יותר. בפועל, מעגלית RNAs יכול גם להיות מופרדים על-ידי דף denaturing דו-ממדית מתחת לגובה נמוך יוניים החוזקות (איור 4). לאחר הפרידה electrophoretic, הרנ א רקומביננטי חייב להיות eluted של הג'ל. השימוש חוצה-מקשרים הפיך של אקרילאמיד, כגון N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, מקלה על ההחלמה, במיוחד כאשר לטיהור כמויות גדולות של RNA (איור 6). לבסוף, אם דרישות היישום במורד הזרם של RNA שהופק פרידתה של RNA עניין לגרדום וירואיד, פרוטוקול שלנו אינו מציע שום יתרון מסוים לשיטות הקודמות. חייבים להוציא את הרנ א עניין של מולקולת chimeric בעזרת חלק האסטרטגיות שתואר לעיל, בהן: ribozymes, DNAzymes, או, יכול להיות יעיל ביותר, השימוש RNase H בהדרכת דנ א שני oligonucleotides7. מנסה להימנע מכך שעבר טיהור מסורבלת, עבדנו על מנסה להקטין את הגודל של לגרדום וירואיד, אך עם הצלחה חלקית. הצלחנו לייצר כמויות הבולטים של רנ א רקומביננטי שימוש בטפסים וירואיד שנמחקו (175, 215 ו- 246 nt) אבל הגדלת מחיקות של לגרדום וירואיד בקורלציה עם הפחתת הצטברות12.

לסיכום, כאן מתואר פרוטוקול לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב e. coli זה, לידע שלנו, משפר את התשואה של שיטות שפורסמו בעבר. הפרוטוקול מבוסס הביטוי שותף ב e. coli של RNA עניין מוכנס לתוך לפיגום וירואיד (ELVd) וליגאז tRNA חציל, האנזים circularizes הזה וירואיד צמחים נגועים. תכונה ייחודית של פרוטוקול שלנו הוא זה רקומביננטי ש-RNA מופק בעיקר בתור צורה מעגלית, מאפיין המקל על טיהור עד הומוגניות ליישומים במורד הזרם. באמצעות פרוטוקול זה עשרות של מיליגרם של רקומביננטי ש-RNA יכול להיות מיוצר בקלות לליטר של e. coli תרבות בתנאי מעבדה רגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי הטכנולוגיה שמתואר פרוטוקול זה כבר פטנט (לנו פטנט מס ' EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BIO2017-83184-R ו- BIO2017-91865-EXP מ ספרדי Ministerio דה Ciencia, Innovación y Universidades (שותפה במימון קרנות פדר).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 141 רנ א רקומביננטי RNA מעגלי וירואיד ליגאז סינתזת RNA aptamer Escherichia coli
ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter