Summary
Burada, ortak ilgi bir viroid iskele ve bir bitki RNA içeren bir chimeric RNA ifade ederek Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol mevcut tRNA ligaz. Ana ürün arıtma homojenliği için kolaylaştırır dairesel bir moleküldür.
Abstract
Giderek artan bir ilgi RNA biyoloji ve sofistike biyoteknolojik uygulamaları RNA molekülleri kullanımı, rekombinant RNA'ların büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sınırlıdır. Burada, biz bir viroid iskele ve bir bitki ilgi RNA içeren chimeric molekülünün ortak ifade dayalı Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol tarif tRNA ligaz. Viroids daha yüksek bitkilerin bulaşıcı nispeten küçük, kodlamayan, son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA'lar vardır. Ana bitki tRNA ligaz olan RNA daireselleşmesi viroid çoğaltma sırasında aracılık Avsunviroidae, patlıcan gizli viroid (ELVd), gibi ailesine ait viroids tarafından işe bir enzim. Her ne kadar ELVd E. coliçoğaltmak değil, bir ELVd öncül verimli E. coli RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ve bakteri hücreleri içinde katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenen ve elde edilen monomerleri tarafından circularized ortak ifade tRNA ligaz dikkate değer bir konsantrasyon ulaşan. Bir RNA ilgi ELVd iskele içine ekleme normal laboratuvar koşullarında bakteriyel kültürünün litre başına rekombinant RNA miligram onlarca üretimini sağlar. RNA ürün ana bir kısmını yuvarlaktır sanal homojenliği için rekombinant RNA arıtma kolaylaştırır bir özellik. Bu protokol için tamamlayıcı DNA (cDNA) faiz RNA için karşılık gelen bir ELVd cDNA belirli bir pozisyon, patlıcan tRNA ligaz, ortak ifade etmek için plazmid E. colidönüştürmek için kullanılan bir ifade plazmid olarak eklenir. Güçlü kurucu Rehberleri kontrol altında her iki moleküllerin ortak ifade rekombinant RNA büyük miktarda üretim için açar. Rekombinant RNA bakteriyel hücrelerinden çıkarılan ve onun Döngüsellik yararlanarak bakteriyel RNA'ların toplu ayrılmış.
Introduction
DNA ve proteinler aksine kolay, verimli ve düşük maliyetli üretim RNA büyük miktarda protokollerde bol değildir. Ancak, biyoteknolojik uygulamaları, çok özel aptamers olarak bunların kullanımı da dahil olmak üzere araştırma ve Sanayi talep onların benzersiz biyolojik özellikleri1araştırmak veya istihdam için bu biomolecules miktarda artan sofistike 2, terapötik ajanlar3veya selektif pestisit4. İn vitro transkripsiyon ve kimyasal sentez yaygın olarak araştırmada RNA üretmek için kullanılır. Ancak, büyük miktarda ürün gerekli olduğunda bu yöntemler önemli sınırlamalar gerektirecektir. Mantıksal alternatif hücresel arkadaşları faiz RNA'lar ayırmak için bir arıtma işlemi ardından yaşam hücrelerinin endojen transkripsiyon makine kullanmaktır. Bu stratejiyi yöntemleri geliştirilmiştir laboratuvar dostu gibi bakteri hücreleri içinde rekombinant RNA'ların üretmek için Escherichia coli5 veya deniz mor Kemotrofik Alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. bir tRNA ya da RNA ilgi olduğu bir rRNA7eklenen gibi bakterilerde rekombinant RNA üretmek için pek çok yöntem bir yerel son derece kararlı RNA iskele ifade üzerinde güveniyor. İlave RNA varlığı8karşıdan akış uygulamaları için bir sorun ise bu çıkar chimeric molekül RNA bırakmadan gerekliliği getirir. Başka bir kavram olarak rekombinant RNA biyoteknoloji istenen ürün başına olabilir veya faiz9RNA kararlılığını artırmak için koruyucu bir strateji olarak kullanılan rekombinan Ribonükleoprotein kompleksleri yapımıdır, 10. Benzer şekilde, dairesel RNA'ların üretimi daha istikrarlı ürünleri11oluşturmak için bir strateji olarak sürülmüştür.
Biz son zamanlarda üç yukarıdaki kavramlar katılan E. coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yeni bir yöntem geliştirdik: son derece kararlı bir dairesel RNA iskele ilgi RNA ve ortak bir ifade ekleme bakteriyel dikkate değer miktarlarda biriken büyük olasılıkla istikrarlı Ribonükleoprotein karmaşık üretmek için rekombinant RNA etkileşen bir protein ile12hücreleri. Aksine önceki gelişmeler, E. coliiçin yani bir viroid tamamen yabancı bir RNA iskele kullandık. Viroids sadece nispeten küçük tarafından (246-401 nt) oluşturulan daha yüksek bitkilerin bulaşıcı ajanlar çok özel bir türü vardır son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA13. İlginçtir, viroids RNA'ların kodlamayan ve kendi proteinler hiçbir yardımıyla, onlar virüslü ana14karmaşık bulaşıcı döngüleri tamamlamak mümkündür. Bu döngüleri çekirdeği veya kloroplast, viroid aile bağlı olarak RNA, RNA-RNA çoğaltma dahil —Pospiviroidae veya Avsunviroidae, sırasıyla — hareket virüslü bitki ve konak savunma yanıtının kaçakçılığı. Viroids doğada, çıplak bir dairesel RNA olmak ve enfekte bitki hücreleri düşmanca bir ortamda hayatta kalmak sahip bir sonucu olarak en istikrarlı RNA'ların arasında yer gerekir. Bu özellik viroids iskele rekombinant RNA biyoteknolojik yaklaşımlar stabilize etmek için özellikle uygun hale getirebilir. Buna ek olarak, yeni yöntemi ile etkileşen bir bitki protein viroid iskele iş ifade temel alır. Viroids hangi ana enzimler işleminin farklı adımları katalizler işe bir haddeleme-daire mekanizması ile çoğaltma. Özellikle bazı viroids, özellikle bu aile Avsunviroidae15' e, ait Ayrıca çoğaltmaya katılan çokluğunun içerir. Viroid tür bağlı olarak, viroid RNA transkripsiyonu RNA polimeraz II ana bilgisayar veya chloroplastic kodlanmış nükleer RNA polimeraz (NEP) tarafından aracılık ettiği. Viroid RNA işleme görünmek-e doğru ev sahibi tarafından katalize tip III RNase, her ne kadar viroids ile çokluğunun oligomeric RNA içinde ara ürün çoğaltma sırasında kendi kendine ayırmak. Son olarak, elde edilen viroid monomerleri, viroid aile bağlı olarak, ana bilgisayar DNA ligaz 1 veya chloroplastic izoformu tRNA ligaz16,17circularized. Bu son enzim ligasyonu patlıcan gizli viroid (ELVd)18gibi aile Avsunviroidae, viroids monomeric formları ilgilenmektedir.
Patlıcan (Solanum melongena L.) tarafından tanıma belirleyen sıralı ve yapısal gereksinimlerini ELVd analiz etmek için bir çalışma sırasında tRNA ligaz, biz ortak ifade E. coli hem moleküllerin dayalı deneysel bir sistem kurmak 19. biz birim daha uzun ELVd transkript verimli katıştırılmış hammerhead çokluğunun ile E. coli hücrelerde kendi kendine ayırmak olduğunu ve elde edilen viroid monomerleri ile 5'-hidroksil ve 2' 3'-fosfodiester termini olduğunu fark verimli bir şekilde birlikte ifade patlıcan tRNA ligaz tarafından circularized. Daha da, elde edilen dairesel viroid RNA E. coli, beklenmeyen bir yüksek konsantrasyon endojen rRNA'lar12olanların aşan ulaştı. Çoğaltma intermediates yokluğu ELVd RNA, RNA-RNA amplifikasyon bu bakteri hücreleri içinde eksikliği gösterilir. İlginçtir, viroid molekülünün belirli bir konumda Contegra RNA'ları ekleme döngüsel viroid kaynaklı RNA'ların12birikimi ılımlı bir etkisi vardı. Bu gözlem bize rekombinant RNA'ların bakterilerde büyük miktarlarda üretmek için bir yöntem öngörülüyor yaptı. Bu yöntemde, faiz RNA'lar için karşılık gelen cDNAs ELVd cDNA eklenir ve elde edilen chimeric RNA güçlü bir bünye organizatörü E. coli ifade edilir. Sistemin çalışması için E. coli patlıcan tRNA ligaz ifade etmek için bir plazmid ile birlikte dönüştürülmesi gerekir. ELVd elde edilen birim daha uzun transkript katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenir ve uygun termini ile elde edilen monomerleri tanınır ve ortak ifade tRNA ligaz tarafından circularized. Bu şekilde ilgi RNA çok kararlı bir dairesel iskele viroid dairesel molekülünün oluşan eklenir. Bu rekombinant chimeric RNA en büyük ihtimal daha fazla bir Ribonükleoprotein tRNA ligaz ile etkileşimi aracılığıyla karmaşık oluşumu tarafından E. coli hücrelerin içinde stabilize. Bu yöntemi kullanarak (bkz: protokolü aşağıdaki), RNA aptamers, saç tokası RNA'ların ve diğer yapısal RNA'ların edilmiş kolayca litre başına miligram E. coli kültür düzenli laboratuvar koşullarında onlarca miktarda üretilen ve alarak homojenliği için saf Döngüsellik12avantajı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plazmid İnşaat
-
PCR (veya Ters transkripsiyon bir RNA şablonundan yola PCR) yükseltmek RNA ifade plazmid derlemeye izin vermek için 5' uzantısıyla primerler kullanılarak ilgi karşılık gelen cDNA. İstenmeyen mutasyonlar önlemek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanın.
- CDNA ifade plazmid Gibson derleme20tarafından eklemek için aşağıdaki 5' uzantıları PCR astar ekle: ileri, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; geri, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X nükleotit homolog faiz RNA terminal sonuna kadar temsil eder.
- 30 için kuluçkaya s 98 ° C'de 10 30 döngüsü tarafından takip 98 ° c, 30 s s 55 ° C ve 30 s 72 ° C ve 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı
- Plazmid pLELVd-BZB 10 U türü IIS Restriksiyon enzimi BPI ile in Özet 100 ng ben 0,5 ml 20 µL tepki olarak 37 ° C'de 1 h için G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl arabellekte tüp 0.1 mg/mL BSA).
Not: Tüm plazmid yazarın isteğine sağlanmaktadır. BPI Bbs için eşdeğer ben. - PCR ve sindirim ürünleri TAE arabelleği (40 mM Tris, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA, pH 7.2) % 1'özel jel elektroforez ile ayırın. Jel 15dk için 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür 200 mL içinde sallayarak leke. UV transilluminator kullanarak DNA görselleştirmek ve güçlendirilmiş cDNA ve bir neşter bıçak kullanarak BPI -sindirmek plazmid (2046 bp) karşılık gelen grup kesti.
Not: BPI Ben pLELVd-BZB hazım da serbest bırakmak LacZ mavi-beyaz muhabir için karşılık gelen bir 528 bp ürün. - Silika jel sütunları (DNA kurtarma seti malzemeleri tablojel) kullanarak jel parçaları DNA'lar elute ve DNA toplama göre spektrofotometrik analiz ölçmek.
- Güçlendirilmiş cDNA ve sindirilmiş plazmid kullanarak bir Gibson derleme tepki kadar ayarla. Vektör karşı Ekle203 kat molar fazlalığı kullanın. 1s 50 ° c için kuluçkaya ve reaksiyon ürünleri bir silika jel sütun (DNA temiz ve yoğunlaştırıcı kiti Malzemeler tablo) kullanarak arındırmak.
-
Electroporate yetkili Gibson derleme tepkimden arıtılmış ürünleri kullanmak E. coli DH5α hücreleri. 1-mm Elektroporasyon cuvettes kullanarak, aşağıdaki ayarlar uygulanır: 1,500 V ve 5 Bayan Incubate catabolite baskı ile süper optimize et suyu içinde 37 ° C'de 1 h için (SOC; 20 g/L tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 0.5 g/M NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glikoz, pH 7,0) sıvı orta ve sonra yayılmasını Luria-Bertani üzerine (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 10 g/M NaCl) agar (% 1.5) içeren 50 µg/mL ampisilin tabaklar.
- Dönüştürülmüş E. coli için karşılık gelen kolonileri için ekran büyük olasılıkla INSERT, electroporated hücreleri kaplama önce 15 dk dahil klonlar yayılmış olarak 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) içinde 30 µL dimethylformamide. Tabak gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Beyaz sömürgeler almak ve sıvı LB medya 37 ° C'de gecede büyümek. Arındırmak bir miniprep kullanarak plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve boyutlarının TAE arabelleği % 1'özel jel elektroforez tarafından analiz.
- Elektroforetik geçiş pLELVd-BZB denetimine göre temel olasılıkla rekombinant plazmid seçin. Astar 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3 kullanarak sıralama tarafından seçilen plazmid dizi Onayla ' ve 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' pLELVd-BZB tüm ifade kasete kuşatın.
Not: Bu plazmid faiz cDNA tarafından değiştirilir LacZ marker ile 528 bp polylinker içerdiğini unutmayın. Kısıtlama eşleme şu rekombinant plazmid seçmek için yardımcı olabilir.
2. RNA ifade
- Co-electroporate (1.6 koşullara bakınız) seçilen E. coli süzün (E. coli BL21 veya BL21 türevi) ile pLELVd BZB ilgi ve plazmid p15LtRnlSm RNA ortak ifade etmek için karşılık gelen cDNA içeren türev Patlıcan tRNA ligaz. E. coli RNase III21yoksun, HT115(DE3) RNA'ların uzun çift iplikçikli bölgeleri ile ifade etmek için kullanın.
Not: Her iki RNA ilgi ve tRNA ligaz mRNA transkripsiyonu E. coli RNA polimeraz tarafından. Bu lysogen varlığı hiçbir zararlı etkisi yoktur rağmen hiçbir DE3 lysogen için hızlı T7 RNA polimeraz e.coli suşu gerekir. - SOC sıvı ortamda 37 ° C'de 1 h kuluçka sonra 50 µg/mL ampisilin ve 34 µg/mL kloramfenikol içeren LB katı orta electroporated bakteri plaka. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Bir koloni almak ve bir 1 L aşılamak Erlenmeyer şişesi 250 mL sıvı müthiş suyu (TB) orta ile şaşkın (12 g/L tryptone, 24 g/L maya ekstresi, %0,4 gliserol, 0,17 M KH2PO4ve 0,72 M K2HPO4), 50 µg/mL ampisilin içeren ve 34 µg/mL kloramfenikol. 37 ° C'de (devir/dakika) dakikada 180 devrimler, güçlü sallayarak ile kuluçkaya. Bakteri 12 ve 16 s arasında kültür aşı sonra hasat.
3. RNA çıkarma ve arıtma
-
Analitik amaçlı 2 mL aliquots kültür arzu etmek zaman puan almak ve 14.000 x g 2 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi ve TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 1 mM EDTA) 50 µL hücrelerde vortexing tarafından resuspend.
- Bir birim (50 µL) (su ile doymuş ve pH 8.0 Tris-HCl, pH 8.0 ile equilibrated) fenol 1:1 (v/v) karışımı ekleyin ve kloroform. Tarafından dinç vortexing hücreler kırmak ve sulu ve organik aşamaları Santrifüjü 14.000 x gde 5 min için tarafından ayrı.
- Toplam bakteri RNA içeren sulu aşamaları (üst) dikkatli bir şekilde kurtarmak.
Not:-20 ° c daha sonraki analiz için hazırlıklar depolanabilir.
- Partiye hazırlık amacıyla kültür 250 mL santrifüj şişe ve 14.000 x g için 10 dk. atma süpernatant hücreleri aşağı spin içine dökün. Hücreleri 30 mL su resuspending tarafından yıkayın. Bir santrifüj tüpü aktarmak ve spin hücreleri tekrar aynı koşullar altında aşağı.
- Süpernatant atın ve 10 mL Kromatografi arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA) hücrelerde vortexing tarafından resuspend.
Not: Şu anda, hücreleri arıtma her an devam etmek için-20 ° C'de donmuş olabilir. - Taze veya çözdürülen bakteriyel hazırlık kullanarak, hücreleri 1 birim (10 mL) ekleyerek fenol: kloroform break (bkz. Adım 3.2) ve vortexing şiddetle.
- 12.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi, sulu faz yeniden elde etmek ve aynı koşullar altında kloroform 1 hacmi (10 mL) ile yeniden ayıklayın.
Not: RNA hazırlık bu aşamada-20 ° C'de muhafaza edilebilir. -
Daha fazla toplam bakteri RNA anyon-Satım Kromatografi tarafından arındırmak. RNA hazırlık bir 45 µm şırınga filtre ve 1 mL diethylethanolamine (DEAE) sütun üzerindeki yükü üzerinden filtre.
- Kromatografi arıtma için 1 mL/dk debi sıvı kromatografi sistemi kullanın. Yükleme örnek önce sütun Kromatografi arabellek 10 mL ile equilibrate (bkz. Adım 3.3 kompozisyon için).
- Örnek yüklemek ve sütun Kromatografi arabellek 10 mL ile yıkayın. RNA elüsyon arabellek (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 mM EDTA) ile 20 mL elute ve 1 mL aliquots toplamak.
Not: RNA hızlı bir şekilde ilk kesirler elutes. Sütunu daha da purifications için yeniden kullanılabilir. Bunun için sütun 10 mL su ile yıkayın ve % 20 etanol içinde 4 ° C'de depolayın.
- Rekombinant RNA E. coli içinde dairesel formda biriken önemli bir bölümünü beri bu özellik arıtma homojenliği12kazançlı. Dairesel RNA'ların doğrusal karşıtları sigara denaturing ve (8 M üre) koşulları12,22denaturing birleştiren iki boyutlu polyacrylamide jel elektroforez tarafından (2D sayfa) ayırın.
4. RNA Analizi
- %5 polyacrylamide jel hazırlamak (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, kütle oranı) TBE tampon (89 mM Tris, 89 mM Borik asit, 2 mM EDTA) içeren 8 M üre içinde.
- Mix 20 µL RNA hazırlıkların arabellek (% 98'i formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, %0.0025 bromophenol mavi ve %0.0025 ksilen cyanol), yükleme 1 birim (20 µL) ile 95 ° c Isıtma bloğundaki 1,5 dk için kuluçkaya ve serin buz üzerinde oturtun.
- Polyacrylamide jel örneklerinde yük ve Elektroforez jel boyutları (140 x 130 2,5 h için 2 mm jelleri x 200 V çalıştırmakÖrneğin,) bağlı olarak uygun koşullar çalıştırın. 15 dakika içinde 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür jel leke, su ile yıkayın ve UV ışığı altında RNA görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant RNA E. coli ELVd kaynaklı sistem12kullanarak üretmek için faiz RNA bir ELVd RNA iskele aşılı. Bu chimeric RNA E. colipatlıcan tRNA ligaz boyunca ortak ifade. İşlenen, i ciddi ve circularized sonra chimeric dairesel RNA, RNA ilgi içinden dışarı çıkar, büyük olasılıkla bir Ribonükleoprotein bakteri hücreleri ( dikkat çekici konsantrasyon ulaşır ortak ifade patlıcan enzim ile karmaşık formlar Şekil 1). Sonuç olarak, rekombinant RNA bu sistemi kullanarak üretmek için ilk adım faiz RNA ELVd cDNA, T245-T246 ELVd sıra varyant AJ536613 olarak belirli bir konumda içine karşılık gelen cDNA ekleme oluşur. Plazmid pLELVd-bu bir polylinker içeren BZB, ben siteleri ve bir LacZ mavi/beyaz marker gen kolaylaştırır bu ekleme çok verimli Gibson derleme yöntemi20tarafından tanıma ile iki BPI getirin. Dönüştürülmüş E. coli yelpazesi istenen rekombinant plazmid LacZ işareti mavi/beyaz tarama tarafından kolaylaştırdı içeren klonlar. Plazmid hangi Çift Kişilik BPI ben sindirim eksik ve INSERT büyük olasılıkla üretmek mavi koloniler X-gal huzurunda dahil olabilir değil. Şekil 2 içinde farklı cDNAs eklenen birkaç rekombinant plazmid elektroforetik analizini gösterir. Bu Plasmid'ler pLELVd-BZB için karşılaştırıldığında farklı geçişleri gösterir. Not Bu pLELVd BZB LacZ işaretçisi içerir (528 bp) faiz RNA için karşılık gelen cDNA tarafından değiştirilmiştir. Bu yüzden, bu eklenen cDNA boyutuna bağlı olsa da, rekombinant plazmid genellikle Denetim plazmid (Şekil 2) daha hızlı geçiş.
PLELVd BZB faiz RNA'lar için karşılık gelen cDNAs içeren türevleri p15LtRnlSm co-electroporate E. coliiçin birlikte kullanılır. Co dönüştürülmüş bakteri ampisilin ve kloramfenikol içeren tabaklarda seçilir. O zaman, E. coli seçili klonlar zengin TB Orta güçlü ajitasyon ile 37 ° C'de yetişkin. Bu kültür koşullar altında rekombinant RNA üretimini12ekranı kaplamış. Bakterilerde rekombinant RNA varlığı tarafından fenol ve kloroform bir arabellek huzurunda hücrelerle kırma ve RNA, sulu tampon hangi bölümlerinde sayfa denaturing tarafından analiz kolayca takip edilebilir. Şekil 3 gösteri etidyum bromür polyacrylamide klonlar hangi toplam RNA'ların farklı E. coli dan ayrıldık jelleri lekeli. Resim için boş ELVd karşılık gelen güçlü bantları ve hangi ilgi farklı RNA'ların yerleştirildi chimeric ELVd formları gösterir. İlginç bir şekilde dairesel form olarak rekombinant RNA büyük bir kısmını bul. Denaturing şartlar altında iki sayfa yüksek ve düşük iyonik gücü kullanarak, rekombinant RNA ana kısmını Döngüsellik kolayca (Şekil 4) görülebilir.
Bağlı olarak aşağı akım uygulama, toplam E. coli RNA ilgi chimeric ELVd-RNA içeren hazırlık geçerli protokol amacı olabilir. Ancak, gerektiğinde, RNA hazırlık daha fazla anyon-Satım Kromatografi tarafından saf. Şekil 5 ' te kromatografik yüksek iyonik gücü (1 M NaCl), E. coli RNA düşük iyonik gücü (150 mM NaCl) adresindeki sütun ve sonraki elüsyon saklama verimli gösterir. Çoğu RNA'ın kesirler 2 ve 3 toplanır. Homojenizasyon için rekombinant RNA arındırmak için döngü avantajlarından alınabilir. Dairesel RNA'lar ile ilgili koşulları22denaturing doğrusal karşılıkları gecikiyor. Bu RNA'ların jel etidyum bromür boyama sonra eluted. İle çapraz bağlı olanlar gibi solubilizable polyacrylamide jel kullanımı N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, arıtma rekombinant RNA'ların (Şekil 6) büyük miktarda kolaylaştırır.
Resim 1: E.colirekombinant RNA üretmek için viroid tabanlı sistem şematik gösterimi. Faiz RNA için karşılık gelen cDNA (98 nt-uzun RNA aptamer ıspanak düzeni) plazmid pLELVd-BZB eklenir. E. coli patlıcan tRNA ligaz ortak ifade etmek için pLELVd-BZB-türev ve plazmid p15LtRnlSm ile birlikte dönüştürülmüş. İçinde E. coli, kendi kendine i ciddi (kırmızı ok uçları) tarafından viroid hammerhead çokluğunun chimeric ELVd-ıspanak RNA transkript olduğunu. Elde edilen monomer ortak ifade tRNA ligaz tarafından tanınıyor ve circularized. Rekombinant RNA hangi ilgi (yeşil) RNA çıkıntı bir dairesel viroid iskele oluşur. E. coli büyük olasılıkla büyük miktarlarda için rekombinant RNA birikimi tRNA ligaz ile karmaşık Ribonükleoprotein istikrar kaynaklanır. Bölmenin yanı sıra ELVd cDNA, plazmid pLELVd-BZB içeren bir pUC çoğaltma kökenli (pUC ori), ampisilin seçimi gen (AmpR), E. coli fare lipoprotein (lpp) organizatörü ve rRNA (rrnC) Sonlandırıcı ve LacZ işaret. Plazmid p15LtRnlSm bir p15A çoğaltma kökenli (p15A ori), kloramfenikol direnç gen (CmR), E. coli lpp organizatörü ve faj T7 transkripsiyon kollarıdır yanı sıra patlıcan tRNA ligaz cDNA içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: elektroforetik ilgi farklı cDNAs içeren pLELVd BZB elde edilen ifade plazmid analizi. Plazmid etidyum bromür ile lekeli bir % 1'özel jel elektroforez tarafından ayrı kaldık. 1 yolu, DNA marker ile bazı bileşenleri soldaki kbp boyutlarda; Lane 2, pLELVd-BZB; Lane 3, boş bir ELVd ifade etmek için pLELVd-BZB türev; Şerit 4-7, RNA aptamer ıspanak (lane 4), streptavidin bağlama aptamer (lane 5), bir RNA saç tokası bölgesiyle bir ardışık 42 bp çift iplikçikli (lane 6) ve 3' kap bağımsız çeviri artırıcı (CITE) bir bitkinin ifade pLELVd BZB türevleri virüs (lane 7). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Rekombinant RNA viroid tabanlı sistemi kullanılarak E. coli üretilen. Toplam RNA'ların farklı E. coli klonlar fenol: kloroform ve sayfa denaturing tarafından ayrılmış aliquots ile tedavi tarafından çıkarılan. Etidyum bromür ile lekeli jelleri gösterilir. Rekombinant RNA'ların E. coli (a)BL21(DE3) ve (B) HT115(DE3) üretildi. (A ve B) şerit 1, RNA marker ile nt boyutlarda soldaki; Şerit 2, boş bir ELVd ifade etmek için RNA'ların E. coli klonlar üzerinden (333 nt). (A)yolları 3 ve 4, RNA'ların E. coli klonlar üzerinden chimeric ELVd ifade etmek için formu içeren ıspanak aptamer (98 nt) ve streptavidin bağlama aptamer (42 nt), anılan sıraya göre. (B) Lane 3, RNA'ların bir 42 bp-uzun çift iplikçikli RNA içeren chimeric ELVd formu hızlı bir E. coli klon üzerinden. Kırmızı oklar dairesel rekombinant RNA'ların için gelin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Döngüsellik rekombinant RNA'ın viroid tabanlı sistemi kullanılarak E. coli üretilen. Toplam aptamer ıspanak içeren bir chimeric ELVd ifade etmek için RNA'ların bir E. coli klon üzerinden 2D sayfa ilk yüksek altında ve daha sonra düşük iyonik gücü altında denaturing tarafından ayrılmış. Jelleri etidyum bromür ile lekeli. Mavi oklar, elektroforetik göçü yön gösterir. Kırmızı ok seçerek aynı boyutta karşıtları doğrusal sırasında iki renk ayrımlarının ertelendiği dairesel ELVd-ıspanak işaret eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 5: Bir rekombinant RNA kromatografik arıtma viroid tabanlı sistemi kullanılarak E. coli üretilen. Bir chimeric ELVd-3 üreten bir E. coli klon üzerinden toplam RNA'ların ' CITE (55 nt) 150 mM NaCl varlığında yıkandı bir DEAE Kromatografi sütunda dolu. RNA 1 M NaCl varlığında eluted. Kromatografik 254 nm (mavi çizgi) ve iletkenlik absorbans karşı mS/cm (turuncu çizgi) biriminde gösterir. Kromatografik ayırma (denge, enjeksiyon, yıkama, elüsyon ve sütun yenilenme) farklı adımlar gösterilir. Toplanan kesirler de gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Bir rekombinant RNA homojenliği için arıtma viroid tabanlı sistemi kullanılarak E. coli üretilen. Bir chimeric ELVd-3 üreten bir E. coli klon üzerinden toplam RNA'ların ' CITE ilk DEAE-Sepharose sütun kullanarak Kromatografi tarafından saf ve 2D sayfa tarafından ayrılmış. İlk jel koşulları (8 M üre, arabellek TBE) denaturing altında çalıştırıldı. Etidyum bromür ile boyama sonra rekombinant RNA dairesel şeklinde içeren jel grup koşul altında olmayan denaturing (arabellek TAE) çalıştırıldığı ikinci bir jel tepesine transfer edildi. İkinci jel akrilamid ile çapraz bağlı N, N'-solubilization saf rekombinant RNA içeren jel parçasının izin BIS (acryloyl) cystamine. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELVd sırası ve yapısı gereksinimleri tanıma patlıcan tRNA ligaz ile ilgili araştırma yaparken, biz liderliğindeki viroid dairesel büyük beklenmedik bir birikimi olmayan ana bilgisayar E. coli hem moleküllerin Co bu ifadeyi fark formları bakteri hücreleri19. Biz viroid RNA E. coli olarak büyük birikimi en büyük olasılıkla son derece kararlı bir RNA molekülü, nispeten küçük gibi ortak ifade sonucu olduğunu anladım (333 nt), son derece dayalı eşleştirilmiş, dairesel viroid ve bu bir protein belirli viroid yüksek afinite gösterir. ELVd RNA kendi daireselleşmesi çoğaltma virüslü bitki17sırasında arabuluculuk için ana bilgisayar tRNA ligaz işe almak gerekir. Her ne kadar biz deneysel onay yok mu, biz her iki molekül Ribonükleoprotein E. coli daha fazla viroid RNA stabilize ve bakteriyel litre başına 150 mg olağanüstü konsantrasyonu ulaşan sağlayan karmaşık form tahmin Son derece o rRNA'lar12gibi endojen RNA'ları aşan kültür. Bu yana ELVd E. coliçoğaltmak, ekleme kapaklı bir RNA'ın önemli ölçüde etkileyen viroid kaynaklı RNA birikimi olacak değildi ve aslında, bu böyleydi, gerekçeli. Bu gözlem yöntemi rekombinant RNA biz burada tarif E. coli olarak büyük miktarlarda üretmek için temelidir. Yöntem ELVd dairesel RNA molekülünün faiz RNA sunulan bir iskele kullanır. E. colibir dairesel ELVd iskele üretmeye, viroid çekiç ribozyme çoğaltılan etki alanıyla bir habercisi RNA ifade etmek ihtiyacımız var. ELVd çokluğunun çok verimli E. coli kendi kendine ayırmak ve elde edilen viroid monomerleri tanınır ve ortak ifade tRNA ligaz tarafından circularized. TRNA ligaz ortak ifade sisteminin önemli bir özelliktir. Bu belirli enzim ortak ifade12olmadıkça ELVd RNA pek E. coli algılanır.
Bizim iletişim kuralında, plazmid pLELVd-BZB RNA pozisyonlar U245 ve ELVd U246 arasında basit ve etkili Gibson derleme tarafından ilgi karşılık gelen cDNA eklemek için izin verir. Bu site bir uzun saç tokası olasılıkla ELVd biçimi24,25içinde mevcut terminal döngü karşılık gelir. Bu belirli konumda ekleme faiz RNA ELVd tarafından kurulan çok kararlı iskele üzerinden dışarı çıkar ve RNA ilgi ve ELVd (Şekil 1) arasında intramolecular etkileşim kaçınmak gerekir yükseltmeniz gerekir. Faiz ELVd molekülünün alternatif pozisyonlarda RNA ekleme etkisini incelemiş bulunuyoruz değil. Plazmid p15LtRnlSm patlıcan tRNA ligaz ortak ifade sağlar. RNA'ların transkripsiyonu bir bünye güçlü E. coli kontrol altında her iki plazmid içinde organizatörü, yani murein lipoprotein (lpp). Bu sistem gerek indüksiyon ile kurucu yapar. Ancak, aynı zamanda tRNA ligaz fajının T7 RNA polimeraz kontrol altında bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüklenebilir sisteminde ifade etmek için benzer bir plazmid (p15tRnlSm) oluşturun. Bu plazmid kullanarak, rekombinant RNA birikimi sadece tRNA ligaz ifade indüksiyon sonra IPTG12ekleyerek oluşur. TRNA ligaz p15A çoğaltma kökenli ılımlı kopya numarası plazmid üzerinden ifade edilir iken mevcut sistemde yüksek kopya numarası plazmid pUC çoğaltma kökenli üzerinden faiz RNA ifade edilir. Kopya sayısını değiştirme olup olmadığını her iki plazmid sistemde yer rekombinant RNA defa keşfedilmeyi değil birikimi geliştirir. Sistem tarafından kabul edilen faiz RNA boyutu aralığını sistematik olmamıştır küçük RNA'ların mantıksal olarak daha yüksek konsantrasyonları büyük birikir bekleniyor olsa da, araştırıldı.
Neden rekombinant RNA içinde vivo üretimi kolay değil nedenlerinden en büyük olasılıkla RNA molekülleri içsel düşük half-life nedeniyle biridir. Sistemimiz bu sorun için yabancı değil. Aslında, aşama büyüyen bir geç E. coli ,12hemen hemen kaybolmaya azaltmak rekombinant RNA birikimi başlar. Bu bir hücre hasat için sağdaki pencereye bulmak için zorlar. Biz yine de, bu pencere sistemi kolay hale getirmek için büyük gözlenen. Ancak, en iyi pencere çok üzerinde bağlıdır gözlenen belirli E. coli gibi faktörlere zorlanma, kültür orta, büyüyen koşulları (ajitasyon, havalandırma, vb şişeye,.hacmi) ve bakteri fizyolojik aşaması sıvı kültür başlatmak için kullanılır. Biz taze E. coli kullanılarak rekombinant RNA üretim başlangıç tavsiye kolonilerin önceki gün aşılamaya ve 37 ° C'de yetiştirilen bir plaka Tabak buzdolabında saklamak hasat penceresi daha öngörülemez anlaşılır. Biz bir plaka bir kürdan ile aldı bakteri ile sıvı kültürleri başlayarak en tutarlı sonuçlar elde. Bir sıvı öncesi kültür kullanımı özellikle doymuş, aynı zamanda üretim Protokolü değişkenlik sürücüleri.
Arıtma, ilgili fenol: kloroform ile bakteri hücreleri tedavisinde hücreleri kırmak için çok etkili bir şekilde ve toplam bakteri RNA nicel kurtarma için sulu aşamasında sağlar. Rekombinant RNA aşağı akım uygulamaya bağlı olarak, bu sulu faz veya RNA bir alkol ile sulu bu aşamasından presipite sonuçları hazırlık yeterli olabilir. Daha fazla arıtma gereklidir, anyon-Satım Kromatografi DEAE anyon Satım sütun (Şekil 5) kullanarak öneririz. Bu arıtma adım DNA ve ayrıca sulu aşamasında bölümlenmiş bakteriyel metabolitleri verimli kaldırılmasını sağlar. Rekombinant RNA'ın aşağı akım uygulama arıtma homojenliği için isterse, viroid kaynaklı sistemi diğer yöntemlerine göre bir avantaj sunuyor. Rekombinant RNA ana bir kısmını dairesel form olarak üretilen bu yana, bu özelliğin avantajı bakteriyel RNA'ların toplu ayırmak için alınabilir. Dairesel RNA'ların doğrusal meslektaşları ile ilgili koşullar aynı boyutu22denaturing içinde elektroforetik geçiş içinde bir gecikme olur. RNA düşük iyonik gücü altında electrophoresed zaman bu gecikme daha belirgin. Uygulamada, iki boyutlu denaturing sayfa altında yüksek tarafından ayrılmış ve düşük de dairesel RNA'ların can iyonik güçlü (Şekil 4). Elektroforetik ayrılıktan sonra rekombinant RNA jel eluted gerekir. Akrilamid, tersinir bir cross-linker kullanımı gibi N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, özellikle büyük miktarda RNA (Şekil 6) arındırıcı zaman kurtarma, kolaylaştırır. Son olarak, üretilen RNA'ın aşağı akım uygulama faiz RNA'ın ayrılması viroid iskele isterse bizim iletişim kuralı önceki yöntemler belirli herhangi bir avantaj sağlamamaktadır. RNA ilgi bazı tip RNA'lar ribozim, DNAzymes kullanımı gibi yukarıda açıklanan stratejiler kullanarak chimeric molekül üzerinden eksize gerekir veya büyük olasılıkla en verimli RNase H kullanımı iki DNA oligonucleotides7tarafından destekli. Bu son hantal arıtma adım önlemek için çalışıyoruz, biz kısmi başarı rağmen ile viroid iskele boyutunu azaltmak çalışırken çalıştık. Rekombinant RNA silinmiş viroid formları kullanarak önemli miktarda üretmek başardık (175, 215 ve 246 nt) ama viroid iskele silme artan korelasyon birikimi12azaltılarak.
Özetle, burada bir protokol artıran, bizim bilgi için daha önce yayımlanmış yöntemleri verim E. coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için kullanılmıştır. Protokol viroid (ELVd) iskele ve patlıcan tRNA ligaz bu viroid virüslü bitkilerde circularizes enzim eklenen faiz E. coli RNA'ın içinde ortak ifade temel alır. Bizim iletişim kuralı bir ayırt edici özelliği o rekombinant RNA ağırlıklı dairesel form, arıtma homojenliği için aşağı akım uygulamaları için kolaylaştıran bir özellik olarak üretilen var. Bu protokol on miligram rekombinant RNA kolayca düzenli laboratuvar koşullarında E. coli kültürünün litre başına üretilen kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu protokol için açıklanan teknoloji olmuştur ilan (bizi Patent No patentli EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).
Acknowledgments
Bu eser hibe BIO2017-83184-R ve BIO2017-91865-EXP gelen İspanyol "gayri resmi" de Ciencia, Innovación y Universidades (ortak sermayeli FEDER fonlar) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F.
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
