Summary
Здесь представлены два метода, которые могут использоваться отдельно или в сочетании для анализа воздействия бета амилоида на структуру сгусток фибрина. Включено — это протокол для создания фибрина в vitro сгусток, следуют сгусток мутность и растровая электронная микроскопия методы.
Abstract
Эта статья представляет методы для генерации в сгустков фибрина in vitro и анализируя эффект бета амилоида (значения) белка на сгустков и структура спектрометрическим методом и растровая электронная микроскопия (SEM). Было показано, что значения, который образует нейротоксическое амилоидных агрегатов в болезни Альцгеймера (AD), взаимодействовать с фибриногена. Это значения фибриноген взаимодействие делает сгусток фибрина структурно ненормальное и устойчивы к фибринолиза. Значения индуцированной аномалии в фибрин свертывания может также способствовать цереброваскулярные аспекты AD патологии как квадрантной, воспаления, а так же, Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА). Учитывая потенциально решающую роль нервно-сосудистого дефицита в AD патологии, разработке соединений, которые могут препятствовать или уменьшить значения фибриноген взаимодействия имеет многообещающие терапевтическую ценность. В vitro методы, которые фибрина сгустков можно легко и систематически оценивать являются потенциально полезными инструментами для разработки терапевтических соединений. Представленные здесь является оптимизированный протокол в vitro поколения фибринового сгустка, а также анализ влияния значения и значения фибриноген взаимодействие ингибиторов. Сгусток мутность быстрое, высокую воспроизводимость и может использоваться для проверки нескольких условий одновременно, позволяя для скрининга большого числа ингибиторов фибриноген значения. Хит соединений из этой проверки может оцениваться дальнейшие за их способность улучшить значения индуцированные структурные аномалии фибринового сгустка архитектуры с использованием SEM. Эффективность этих оптимизированных протоколов свидетельствует здесь с помощью TDI-2760, ингибитор взаимодействия недавно выявленных значения фибриногена.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD), нейродегенеративных заболеваний, ведущих к когнитивным снижением пожилых пациентов, преимущественно возникает из ненормальное бета амилоида (значения) выражение, агрегирование и нарушением Распродажа результате нейротоксичность1, 2. Несмотря на хорошо изученных связь между значения агрегатов и объявление3, точные механизмы, лежащие в основе заболевания патология не являются хорошо понимали4. Все больше фактов предполагает нервно-сосудистого дефицита играть роль в прогрессии и тяжести AD5, как значения непосредственно взаимодействует с компонентами системы кровообращения6. Значения есть высокоспецифичных взаимодействие с фибриноген7,8, который также локализует значения вкладов в AD пациентов и мыши модели9,10,11. Кроме того значения фибриноген взаимодействия вызывает аномальные фибрин-сгустков и структура, а также сопротивление фибринолиза9,12. Один терапевтические возможности в лечении AD, облегчение кровообращения дефицита путем ингибирования взаимодействие между Aβ и фибриногена13,14. Мы, таким образом, определены несколько небольших соединений, ингибирующих значения фибриноген взаимодействия с помощью скрининга высокую пропускную способность и фармацевтическая химия подходы13,14. Чтобы проверить эффективность ингибиторов фибриноген значения взаимодействия, мы оптимизировали два метода для анализа в vitro сгустков фибрина: сгусток мутность пробирного и сканирование электронная микроскопия (SEM)14.
Сгусток мутность пробирного является прямой и быстрый метод для мониторинга сгустков фибрина с помощью УФ видимые спектроскопии. Как сгусток фибрина чаще рассеивается формы, света и помутнение раствора увеличивается. И наоборот, когда значения присутствует, изменяется структура фибринового сгустка, и помутнения смеси снижается (рис. 1). Эффект ингибирующее соединений можно оценить потенциал для восстановления сгусток мутности от значения индуцированной аномалии. Хотя мутность assay позволяет для быстрого анализа нескольких условий, предоставляет ограниченные сведения о сгусток формы и структуры. SEM, в котором топографии твердых объектов раскрывается зондом электрона, позволяет для анализа 3D архитектура сгусток15,16,17,18 и оценки как наличие значения и ингибирующее соединений или изменяет что структура9,14. Оба-спектрометрии и SEM классических лабораторных методов, используемых для различных целей, например, спектрофотометрия используется для мониторинга амилоида агрегации19,20. Аналогичным образом SEM также используется для анализа фибринового сгустка, образуются из плазмы Альцгеймера, Паркинсона и тромбоэмболических инсульт пациентов21,,22-23. Здесь представлены протоколы оптимизированы для оценки сгустков фибрина воспроизводимость и быстрым образом.
Следующий протокол содержит инструкции для подготовки в vitro фибрин сгусток с и без значения. В нем также подробно методы для анализа влияния значения на сгустков фибрина и структуры. Эффективность этих двух методов для измерения ингибирование значения фибриноген взаимодействия подтверждается с помощью TDI-2760, небольшой тормозящий составные14. Эти методы, как индивидуально, так и вместе, позволяют для быстрой и простой анализ формирования в vitro фибринового сгустка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Aβ42 и фибриногена для анализа
- Подготовить мономерных Aβ42 от лиофилизированный порошок
- Теплый Aβ42 порошок до комнатной температуры и спин вниз на 1500 x g 30 s.
- 100 мкл ледяной hexafluoroisopropanol (HFIP) на 0,5 мг порошка Aβ42 и Инкубируйте 30 мин на льду.
Предупреждение: Следует соблюдать осторожность при обращении с HFIP и выполните все шаги в химические вытяжки. - Подготовка 20 мкл аликвоты и пусть фильмы воздух сухой химической капот для 2-3 ч. фильмы могут храниться при температуре-20 ° C.
- Воссоздания мономерных Aβ42 фильм в 10 мкл свежие диметилсульфоксида (ДМСО) по агитации в ванной sonicator за 10 мин при комнатной температуре.
- 190 мкл 50 мм трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris) буфера (рН 7,4) и Пипетка вверх и вниз осторожно.
- Удаление агрегатов белка центрифугированием в 20817 x g при 4 ° C в течение 20 мин.
- Инкубируйте супернатант на 4 ° C для центрифуг решение на 20817 x g при 4 ° C на ночь и на следующий день за 20 мин отказаться от каких-либо дальнейших белка агрегатов.
- Измерьте концентрацию Aβ42 bicinchoninic кислоты (BCA) анализа. Серийный разбавляют очищенного бычьим сывороточным альбумином (БСА) от 1 мг/мл до 0.0625 мг/мл для производства белка стандарт, 10 мкл каждого стандарта к скважинам несколькими хорошо пластины в трех экземплярах. Развести образцы значения 1:4 и 10 мкл скважин в трех экземплярах. Смешайте BCA решения A и B и 200 мкл метки для каждой скважины. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и читать на тарелку читателя в 562 Нм. Оставшийся раствор значения на льду сохранять и использовать этот препарат для assay мутность и SEM.
- Готовят раствор фибриногена
- Мера 20 мг порошка лиофилизированных фибриногена в 15 мл трубку и вновь приостановить с подогретым 2 мл 20 мм hydroxyethylpiperazine Этан перфтороктановой сульфоновой кислоты (HEPES) буфера (рН 7,4).
- Инкубируйте в ванну воды 37 ° C за 10 мин.
- Через шприц фильтр 0.2 мкм фильтр решения и хранить при 4 ° C на 30 мин. Возьмите решение от 4 ° C и фильтр снова через 0,1 мкм фильтром шприц для удаления фибриноген агрегатов или существующие фибрина.
- Измерьте концентрации фибриногена пробирного BCA. Выполните инструкции с шаг 1.1.8. Держите оставшийся раствор фибриногена на 4 ° C и использовать этот препарат для assay мутность и SEM.
2. сгусток мутность Assay
- Для каждой экспериментальной скважины 96-луночных плиты добавьте 20 мкл раствора 30 мкм Aβ42 из шага 1.1.8 так, что его конечная концентрация 3,0 мкм в 200 мкл буфера. Добавьте такой же объем 5% ДМСО в 50 мм трис буфере (рН 7,4) для буферизации контроля скважин в 96-луночных пластины.
Примечание: Точный объем Aβ42 на этом шаге не является важным. Для низкой концентрации препаратов больший объем могут быть использованы, и объем буфера формирования сгусток может корректироваться. Окончательный объем должен оставаться 200 мкл. - Если тестирование тормозной соединений, разбавленные соединения рабочей концентрации как ДМСО. Добавить соединение или ДМСО только для элемента управления для скважин с Aβ42 и хорошо перемешать.
Примечание: Aβ42 решение должно образовывать дискретных капель в нижней части скважины, соединение или ДМСО должны быть накапаны непосредственно в центре капелька. - Разбавить Стоковый раствор фибриногена от шага 1.2.4 в буфере формирования сгустка (20 мм HEPES буфер (рН 7,4), CaCl 5 мм2и 137 мм NaCl) и добавить его в Aβ42 содержащий и контроля скважин 96-луночных пластины. Отрегулируйте громкость раствор фибриногена, так что его конечная концентрация становится 1,5 мкм в объеме 200 мкл реакции. Пипетка решение медленно и избежать формирования пузырьков. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 30 мин, пожимая на вращающейся платформе.
Примечание: Объем фибриноген решения может варьироваться в зависимости от его запасов концентрации, но общий объем в каждом хорошо должно быть 170 мкл при инкубации. - Готовят раствор тромбина путем растворения порошка коммерчески очищенный тромбина в ddH2O сделать Стоковый раствор 50 ед/мл. Разбавляют до 5 ед/мл рабочего раствора в 20 мм HEPES буфере (рН 7,4) непосредственно перед использованием.
- После 30 минут инкубации одновременно добавьте 30 мкл раствора тромбина (5 ед/мл) в фибриноген решения в 96-луночных пластины от 2.3 шаг с помощью многоканальных дозаторов. Добавление тромбина будет немедленно инициировать сгустков. Таким образом добавления тромбина непосредственно в центр фибриноген решения с осторожностью, чтобы избежать образования пузырьков.
Примечание: Активность тромбина может варьироваться от экспериментальных условий, а также множество тромбина. Правильной концентрации требуется производить энергично сгустки могут иметь определяется эмпирически. - Читайте поглощения в vitro сгусток на тарелку читателя сразу же после добавления тромбина. Измерение оптической плотности на 350 Нм в течение 10 мин, s. выполнять каждые 30-60 весь assay при комнатной температуре.
Примечание: Некоторые ингибиторы соединения может изменить решение поглощения на 350 Нм, в котором случае мутность может быть измерена в 405 нм.
3. сканирующая электронная микроскопия
- Подготовка сгусток, фиксации и стирки
- Место чистой силиконизированный стекло круг крышки слайды (12 мм) в 12-ну или 24-ну пластину, используя пинцет.
- Подготовьте фибриногена в буфере формирования сгустка. Смотрите Шаг 1.2 протокол для деталей.
- Чтобы оценить эффект ингибиторов фибриноген значения взаимодействия на структуре сгусток фибрина, следуйте инструкциям для инкубации, как описано для assay мутность (шаг 2). Всегда включайте контроль скважины, которые содержат фибриногена в отсутствие значения и ингибиторов.
- Пипетка 80 мкл фибриноген смеси из шага 3.1.3 на обложке слайды. Аккуратно распространение решение, таким образом, чтобы она равномерно распределяется на обложке слайд.
- Разбавить тромбина фондовой (50 ед/мл) в 20 мм HEPES буфер солевой раствор до конечной концентрации 2,5 ед/мл и 20 мкл непосредственно к центру фибриноген решение без перемешивания.
Примечание: При необходимости, более высокую концентрацию тромбина рабочих (5 ед/мл) может использоваться. - Крышка 12-колодец с пластиковой крышкой и оставить его при комнатной температуре за 30-60 мин.
- Во время свертывания реакции, подготовьте обезвоживания и фиксации решений. Подготовьте натрия cacodylate буфера (0,1 М, рН 7,4). Развести 10% глютаральдегид Стоковый раствор натрия cacodylate буфера (0,1 М, рН 7,4) сделать 2% рабочим раствором низкотемпературном растворе глютаральдегида. Держите все эти решения на льду. Свеже разреженных глутаровый (2%) должны использоваться в течение 1 недели, когда правильно хранить в холодильнике при температуре 4 ° C.
- Разбавьте абсолютного этанола (100%) в двойной дистиллированной воды (80%, 50% и 20% этанола). Держите эти растворы этанола и абсолютного этанола (100%), на льду.
Предупреждение: следует соблюдать осторожность при обращении с cacodylate натрия и глютаральдегид, выполните эти действия в химические вытяжки. - После 30 мин аккуратно помыть сгустков с ледяной натрия cacodylate буфера (0,1 М) дважды. Добавьте 2 мл буфера для каждой скважины, таким образом, что сгусток полностью погружены. Крышка хорошо с крышкой и оставить на 2 мин при комнатной температуре. Через 2 мин аккуратно удалите буфер с помощью пипетки 1 мл или узкие стволовых передачи пипетки. Повторите один раз.
- Исправьте сгустков с ледяной глутаровый (2%). Ведение хорошо пластины на льду, добавьте около 2-3 мл 2%-го раствора в каждой скважине. Убедитесь, что сгустки полностью погружены. Накрыть и оставить пластину на льду за 30 мин.
- После 30 мин аккуратно удалить глютаральдегид из каждой скважины и мыть сгустки, используя буфер cacodylate натрия (0,1 М), как описано выше (2 мин, дважды). Храните хорошо пластины на льду.
- Серийный обезвоживания, сушки критической точки и сгусток
- Обезвоживает сгустков в градуированных серии ледяной этанола моет, подготовленный на шаге 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% и again100%), за 5 мин. Для каждой серии этанола добавьте 2-3 мл, убедившись, что подводные сгустки. Накрыть крышкой и инкубировать на льду.
- После каждого шага этанола удалите этанола раствор с помощью пипетки 1 мл или одноразовые пипетки капельницы. Не полностью удалить этанола. Убедитесь, что поверхность сгусток не подвергается воздействию воздуха.
Примечание: Обезвоживания в абсолютного этанола (100%) должны выполняться дважды. - При сохранении образца, погруженной в окончательный 100% этанола, передачи критической точки сушилка (CPD)). Используйте держатель образца ДСП или держателя крышки выскальзования с шайбой для передачи слайды в камеру ДСП. Место по крайней мере одну шайбу между каждый слайд.
- Возьмите крышку слайд из ДСП камеры и смонтировать его на SEM заглушку с помощью углерода ленты.
- Распыления нанесения покрытий и обработки изображений
- Передать все образцы с SEM заглушки в камеру распыления покрытия.
- Распыления покрытия меньше, чем 20 Нм золото/Палладий или других проводящих материалов, таких как углерода, с помощью вакуумного распыления нанесения покрытий.
Примечание: Мы использовали 18 nm золота/Палладий покрытия. Распыления покрытия была выполнена для 45 s и скорость покрытие было 4 Å / s. распыления покрытием образцы являются стабильными, когда должным образом хранится в сухом месте при комнатной температуре в течение нескольких недель. SEM анализ может выполняться в любое время. - Получение изображений на сканирующий электронный микроскоп оснащен SE2 детектор на 4 кв.
Примечание: Размер пикселя изображения в этом изображении комплекс из 13 Нм-31 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В в vitro свертывания пробирного (мутность) фермент тромбин расщепляет фибриноген, что приводит к образованию фибринового сети24. Это образование сгустка фибрина вызывает рассеяния света, проходящего через решение, что приводит к увеличению мутность (рис. 1), спаде до конца периода чтения (рис. 2, зеленый). Когда фибриноген был инкубировали в присутствии Aβ42, помутнение раствора уменьшилось, с кривой, достигая максимальной высоты примерно половина, фибриногена только (рисунок 2A, синий). В недавней публикации ряд блокаторов агрегирования значения были синтезированы и оценены за их способность ингибировать значения фибриноген взаимодействия, выявления составных TDI-276014. В нашем исследовании мы использовали TDI-2760 блокировать взаимодействие значения фибриногена. Как сообщалось ранее, в присутствии TDI-2760, эффект значения была усовершенствована, как помутнение был выше, чем с значения только (рисунок 2A, красный). Эффект TDI-2760 не объясняется мутность фон как соединение не изменилась мутность сгусток фибрина когда значения отсутствовал (рисунок 2A, фиолетовый). В vitro свертывания пробирного мутность описанным здесь является быстрый и простой метод, который фибринового сгустка формирования и факторы, которые могут ослабить этот процесс можно наблюдать. GPRP, который известен вмешиваться полимеризации фибрина через вмешательство с фибрином мономера ручку отверстие взаимодействия18,25 может использоваться как позитивный элемент управления для assay мутность (рис. 2B). В соответствии с ранее докладов25, с наличием GPRP пептид, мутность сгусток фибрина был значительно сокращен по сравнению с сгустков фибрина с его отсутствием (Рисунок 2Б, синий против зеленый).
После же протокол и условий как assay мутность, описанных выше в присутствие и отсутствие значения и/или TDI-2760 были подготовлены сгустков фибрина. Сгустки были затем обработаны для электронной микроскопии фиксации, обезвоживания, сушки критической точки и золото распыления покрытия (рис. 1). Фибриноген в присутствии только тромбина и CaCl2 сформировал фибрина сетку, с удлиненной и вставными нитей фибрина, а также большие пучки (рис. 3A). Когда значения присутствовал, нитей фибрина стал тоньше, с несколько липкие сгустки/агрегатов, указывающее значения индуцированные структурные аномалии (рис. 3B). В соответствии с результатами анализа мутности, TDI-2760 частично восстановлены структуры сгусток фибрина из значения индуцированных изменений, как меньше сгустки были представлены (рис. 3 C). Вместе с assay мутность SEM показывает степень и качество значения индуцированных изменений сгустков фибрина, а также эффективность тормозной подворье, TDI-2760.
Рисунок 1 : Схематическое представление фибринового сгустка анализа мутности пробирного и SEM. Схема показывает шаги, участвующих в анализе сгусток фибрина и эффект значения на мутность сгусток фибрина и структурных топографии. Масштаб бары SEM изображений (внизу слева) 2 мкм и увеличение составляет 10, 000 X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Измерение эффекта Aβ42 в пробирке сгустков фибрина, мутность пробирного. (A) фибриноген был инкубировали в наличие и отсутствие Aβ42. Сгустков было вызвано тромбиновое, что приводит к увеличению помутнение раствора (зеленый). В присутствии Aβ42 аномально построен фибринового сгустка, что приводит к снижению мутность (синий). Составные TDI-2760 или ДМСО инкубировали с раствор фибриногена, так и без Aβ42. TDI-2760 восстановлен Aβ42-индуцированной снижение мутности (красный) без изменения нормальной сгустков (фиолетовый). (B) мутность Ингибитор фибринолиза известный, GPRP был также измеряется как позитивный элемент управления для этого анализа. Фибриноген был инкубировали в присутствии и отсутствии 1,5 мкм GPRP и мутность, измеренная после добавления тромбина. Подобно Aβ42, мутность сгустков фибрина был значительно сокращен в присутствии GPRP (синий и зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сканирование электронной микроскопии значения индуцированной аномалий фибринового сгустка архитектуру. Сканирование электронной микроскопии фибринового сгустка структуры полученных из очищенного фибриногена (A), фибриноген + Aβ42 (B), фибриноген + Aβ42 + TDI-2760 (C). Сгустков был инициирован добавления тромбина и CaCl2 к смеси. Структурный анализ показала, что сгустки, сформированные в присутствии Aβ42, тоньше и аномально скомканным по сравнению с фибриноген сама по себе. TDI-2760, который известен для ингибирования Aβ42-фибриноген взаимодействия, частично исправлены Aβ42 индуцированных структурных аномалий фибринового сгустка. Шкалы бар-1 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь методы обеспечить воспроизводимость и быстрым средством оценки фибринового сгустка формирования в пробирке. Кроме того простота системы делает толкование как значения влияет на сгустков фибрина и структура довольно прямо вперед. В предыдущей публикации этой лаборатории было показано, что эти анализы могут использоваться для проверки соединения для их способностью ингибировать значения фибриноген взаимодействия13,14. С помощью этих двух анализов, серии синтезированных соединений были проанализированы для способностью ингибировать значения фибриноген взаимодействия. На самом деле сгусток мутность assay может использоваться для сузить бассейн хит соединений для тех которые имеют терапевтический потенциал, поскольку не все соединения, которые могут препятствовать значения фибриноген взаимодействия можно также восстановить сгустков фибрина.
Есть несколько аспектов анализа мутности, которые могут потребовать устранения неполадок или ограничить использование этой техники. Основным ограничением является, что могут быть некоторые различия между экспериментов, которые могут затруднить интерпретацию результатов. Некоторые из этого сорта должен быть из-за активность тромбина. Для устранения неполадок для активность тромбина, пользователи могут проверить несколько концентрации тромбина для деятельности сгустков до начала экспериментов с значения и испытания соединений. В экспериментальных условиях, представленные здесь значения, в отсутствие фибриноген, не увеличивают помутнение раствора выше фоновых уровней указанием, которые наблюдали что мутность кривые обусловлены полимеризации фибрина. Однако значения подверженных агрегации пептида и более высокую концентрацию раствора при хранении при комнатной температуре или 37 ° C (несколько часов) для очень длительного времени значения могут образовывать фибриллярного агрегаты, которые могут привести к повышенной мутности. Если проанализировать эффект значения решение, которое было сохранено для длительных периодов времени при комнатной температуре или теплее, агрегации статус решения может определяться просвечивающей электронной микроскопии. В протоколе, описанные здесь свежеприготовленные значения и фибриногена решения используются, который следует устранить проблемы агрегирования. Однако для обеспечения качества этих препаратов они были оценены, просвечивающей электронной микроскопии. Кроме того при использовании новой партии коммерческого значения пептида, степень олигомеризации и количество олигомеров должна определяться просвечивающей электронной микроскопии. Потому что там может быть много-много вариаций пептид качества и соотношение преформированных агрегатов и мономерных значения, который несомненно влияет на стоимость олигомеризации. Желательно, чтобы проверить концентрацию раствора (метод BCA) значения до инкубации для олигомеризации. Чтобы свести к минимуму эти различия, мы стараемся, используя минимум 0,1 мг/мл Aβ раствора для формирования реакции олигомера.
Потому что этот assay также чувствителен к небольшие изменения среды, такие как температура и движения, мутность чтений из различных экспериментов не должны быть проанализированы вместе. Это означает, что количество условий, которые можно сравнить ограничено количество скважин что тромбина можно быть одновременно добавляется с многоканальные пипетки (т.е., 12). Пользователи также должны быть осведомлены, что вязкость или цвет в буферы и тест соединения может привести к высокой фоновой мутность, заслоняя сигнал от сгусток фибрина и затрудняет интерпретацию эксперимента. Однако если все элементы управления включены в каждом эксперименте, можно легко определить, если фон сигнала меняет мутность поглощения.
Мутность assay предоставляет сведения о ли значения препятствуют образованию фибринового сгустка и Кроме того если ингибитор соединений может уменьшить этот эффект. Однако это не показать, как изменяется структура фибринового сгустка в ответ на значения или хит соединений. Этот вопрос может решаться по SEM, как это позволяет для прямого визуализация архитектуры сгусток. SEM является устоявшейся методики и регулярно используется для визуализации структуры сгусток из очищенного фибриноген или плазмы. Однако процесс подготовки традиционных сгусток SEM анализа может быть сложным и трудоемким. Кроме того небольшие различия между различными исследовательскими группами в протоколы могут сделать это сложно воспроизвести результаты24. Для решения этих проблем был разработан этот оптимизированный протокол, с которым эффект значения побудить тоньше нитей фибрина и clumps белка может наблюдаться (рис. 3). Как видно с assay мутность, TDI-2760 снимает эффект значения, восстановление типичная структура фибрина связки (рис. 3).
Есть несколько шагов в подготовке образца SEM, который также может потребоваться устранение неполадок. При использовании очень низкие концентрации фибриногена (0,5 мкм или менее), сгустки не могут быть прочно прикреплены к слайд стекла и может быть повреждено/мыть прочь во время фиксации/стиральные шаги. При низкой концентрации фибриногена, время формирования сгустка, между добавлением тромбина и фиксации, может быть увеличен до нескольких часов, как это может увеличить стабильность сгусток. Кроме того пользователям следует избегать использования высокопрочных фосфатного буфера или фосфатный буфер для мутность и SEM анализов, как ионы фосфата может вмешиваться в процесс формирования кальция опосредованной сгусток. При использовании любых других высоких соли, содержащие буфер для сгустков и SEM анализа, после фиксации, мытье шаги должны также быть выполнена с холодной ddH2O.
SEM анализ непроводящих образцов таких сгустков фибрина требует покрытия с заряженными частицами, например, золота, палладия, серебра или углерода. Толщина покрытия является важным фактором в SEM изображений, как это возможно, что очень толстые металлическое покрытие может маскировать топографии поверхности ультра структура фибринового сгустка. В этом протоколе, тонкие покрытия золото/Палладий (менее 20 Нм) используются для распыления покрытия. Для достижения менее 20 Нм толщиной, распыление было сделано для 45 s с коэффициентом покрытия 4 Å / s. Это тонкое покрытие (18 Нм) не появляются для маскировки особенности поверхности Ассамблеи фибрина. Однако если обеспокоены маскировки ультра структура сгусток, углеродное покрытие может использоваться как альтернатива золото/палладия, как он оставит меньше «островки» покрытие молекул на материале.
В то время как основное внимание здесь уделялось взаимодействия значения фибриногена, этот протокол может быть легко изменен для анализа взаимодействия других белков или соединения с фибринового сгустка. Следуя этим инструкциям следователи должны быть в состоянии воспроизвести в vitro сгустков фибрина и выполнить анализ с этими обтекаемый сгусток мутность пробирного и SEM протоколы. Как показано здесь с ранее опубликованной ингибитор составные TDI-2760, эти методы предоставляют ценную информацию относительно сгустков фибрина, которые могут быть применены для дальнейшего исследования в пробирке и в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Masanori Кавасаки, Кадзуёси Асо и Майкл Фоли от Tri-институциональные терапии Discovery институт (TDI), Нью-Йорк для синтеза ингибиторов фибриноген значения взаимодействия и их ценные предложения. Авторы также поблагодарить членов Стрикленд лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана NIH Грант NS104386, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера и Робертсон терапевтического фонда развития для Х.А., низ Грант NS50537, Tri-институциональные терапии Discovery институт, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера, Фонд семьи Рудин и Джон а. Херрманна по с.с.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
