Summary
Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.
Abstract
Este artículo presenta métodos para la generación de coágulos de fibrina vitro y analizar el efecto de la proteína de amiloide beta (Aβ) en estructura y formación de coágulos por espectrometría y microscopía electrónica de barrido (SEM). Aβ, que forma agregados de amiloide neurotóxicos en enfermedad de Alzheimer (EA), se ha demostrado para interactuar con el fibrinógeno. Esta interacción de Aβ-fibrinógeno hace el coágulo de fibrina estructuralmente anormales y resistentes a la fibrinólisis. Inducida por Aß anormalidades en la coagulación de fibrina también pueden contribuir a aspectos cerebrovasculares de la patología de AD como microinfartos, inflamación, así como, angiopathy amiloideo cerebral (CAA). Dado el papel potencialmente crítico de déficit neurovascular en patología AD, desarrollo de compuestos que pueden inhibir o reducir la interacción de fibrinógeno Aβ tiene valor terapéutico prometedor. In vitro métodos por que fibrina formación de coágulos puede ser fácil y sistemáticamente evaluada son herramientas potencialmente útiles para el desarrollo de compuestos terapéuticos. Presentamos es un protocolo optimizado para generación en vitro del coágulo de fibrina, así como análisis del efecto de inhibidores de la interacción de Aß y el Aβ-fibrinógeno. El análisis de turbidez de coágulo es rápido, altamente reproducible y puede utilizarse para probar condiciones múltiples simultáneamente, permitiendo la proyección de un gran número de inhibidores de la Aβ-fibrinógeno. Éxitos compuestos a partir de esta proyección pueden ser evaluados además por su capacidad para mejorar inducida por Aß anormalidades estructurales de la arquitectura del coágulo de fibrina mediante SEM. La eficacia de estos protocolos optimizados se demuestra aquí con TDI-2760, un inhibidor de interacción recientemente identificado de Aβ-fibrinógeno.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa que lleva a deterioro cognitivo en pacientes ancianos, predominantemente surge de la expresión anormal beta-amiloide (Aβ), agregación y separación deteriorada, dando lugar a neurotoxicidad1, 2. a pesar de la Asociación bien caracterizada entre agregados de Aß y AD3, los mecanismos precisos subyacentes a la patología de la enfermedad no son bien entendidos4. Creciente evidencia sugiere que déficit neurovascular desempeñan un papel en la progresión y severidad de AD5, Aβ interactúa directamente con los componentes del sistema circulatorio6. Aβ tiene una interacción de alta afinidad con el fibrinógeno7,8, que también se localiza a los depósitos Aβ en pacientes con EA y ratón modelos9,10,11. Además, la interacción de fibrinógeno Aβ induce la formación anormal de coágulos de fibrina y estructura, así como resistencia a la fibrinolisis9,12. Una posibilidad terapéutica en el tratamiento de AD, es aliviar el déficit circulatorio mediante la inhibición de la interacción de Aß y fibrinógeno13,14. Por lo tanto, identificamos varios pequeños compuestos inhiben la interacción de fibrinógeno Aβ con proyección de alto rendimiento y química medicinal enfoques13,14. Para probar la eficacia de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aβ, hemos optimizado dos métodos para el análisis de en vitro la formación de coágulos de fibrina: coágulo turbidez análisis y exploración de la microscopia electrónica (SEM)14.
Análisis de turbidez de coágulo es un método sencillo y rápido para el seguimiento de la formación del coágulo de fibrina mediante espectroscopia UV-visible. Como el coágulo de fibrina se dispersa cada vez más formas, luz y aumenta la turbidez de la solución. Por el contrario, cuando Aß está presente, se altera la estructura del coágulo de fibrina, y se reduce la turbiedad de la mezcla (figura 1). El efecto de compuestos inhibitorios puede evaluarse el potencial restaurar coágulo turbidez de anormalidades inducidas por Aβ. Mientras que el análisis de turbidez permite un análisis rápido de varias condiciones, proporciona información limitada sobre el coágulo forma y estructura. SEM, en el que se revela la topografía de objetos sólidos por sonda de electrones, permite el análisis de la arquitectura 3D del coágulo15,16,17,18 y la evaluación de cómo la presencia de Aß y compuestos inhibitorios y/o altera esa estructura9,14. Tanto espectrometría y SEM son técnicas de laboratorio clásicas que se han utilizado para los varios propósitos, por ejemplo, espectrofotometría se utiliza para el control de la agregación amiloide19,20. Del mismo modo, SEM también se utiliza para analizar el coágulo de fibrina formado por el plasma de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y accidente cerebrovascular tromboembólico pacientes21,22,23. Los protocolos aquí presentados están optimizados para evaluar la formación del coágulo de fibrina de forma rápida y reproducible.
El siguiente protocolo proporciona las instrucciones para la preparación de una en vitro -coágulo de fibrina con o sin Aβ. También detalla los métodos para analizar el efecto de Aß en la formación de coágulos de fibrina y estructura. La eficacia de estos dos métodos para medir la inhibición de la interacción de fibrinógeno Aβ se demuestra usando TDI-2760, un compuesto inhibitorio pequeño14. Estos métodos, tanto individualmente como en conjunto, permiten análisis rápido y sencillo de en vitro la formación de coágulos de fibrina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación de Aβ42 y fibrinógeno para análisis
- Preparar Aβ42 monomérica de polvo liofilizado
- Caliente Aβ42 en polvo a temperatura ambiente y de la vuelta abajo a 1.500 x g por 30 s.
- Añada 100 μl de helada hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de polvo de Aβ42 e incubar durante 30 min en hielo.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar HFIP y realizar todos los pasos en una campana química. - Preparar 20 alícuotas μl y deje que el aire de películas secado en una campana química para películas de 2-3 h. puede almacenarse a-20 ° C.
- Reconstituir la película monomérica de Aβ42 en 10 μl de fresco de dimetilsulfóxido (DMSO) por agitación en un sonicador de baño durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 190 μl de 50 mM de tris (hidroximetil) aminometano (Tris) tampón (pH 7.4) y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Eliminar los agregados de la proteína por centrifugación a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min.
- Incubar el sobrenadante a 4 ° C para pasar la noche y al día siguiente Centrifugue la solución a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min descartar más agregados de la proteína.
- Medir concentración de Aβ42 bicinchoninic ensayo de ácido (BCA). Serie diluido purificada de albúmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/mL a 0,0625 mg/mL para producir un nivel de proteínas, añadir 10 μl de cada estándar en los pocillos de una placa multi-bien por triplicado. Diluir muestras Aβ 1:4 y añadir 10 μl a los pocillos por triplicado. Soluciones BCA, A y B de la mezcla y añada 200 μl a cada pocillo. Incubar durante 30 min a 37 ° C y leer en un lector de placas a 562 nm. Guardar la solución restante de Aβ en el hielo y utilizar esta preparación para análisis de turbidez y SEM.
- Preparar solución de fibrinógeno
- Mida 20 mg de polvo liofilizado de fibrinógeno en un tubo de 15 mL y volver a suspender con 2 mL de 20 mM como etano sulfónico ácido (HEPES) de tampón (pH 7.4).
- Incubar en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos.
- Filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a 4 ° C durante 30 minutos. Retomar la solución de 4 ° C y el filtro a través del filtro de la jeringuilla de 0.1 μm para eliminar agregados de fibrinógeno o fibrina de las preexistentes.
- Medir la concentración de fibrinógeno ensayo BCA. Siga las instrucciones del paso 1.1.8. Guardar la solución restante de fibrinógeno a 4 ° C y utilizar esta preparación para análisis de turbidez y SEM.
2. coágulo turbidez análisis
- A cada pocillo experimental de la placa de 96 pocillos, agregar 20 μl de solución de Aβ42 de 30 μm de paso 1.1.8 para que su concentración final es de 3,0 μm en 200 μL del tampón de. Añadir el mismo volumen de DMSO 5% en 50 mM de tampón Tris (pH 7,4) a buffer de control de pozos en la placa de 96 pocillos.
Nota: El volumen exacto de Aβ42 en este paso no es importante. Para las preparaciones de baja concentración, puede utilizarse un volumen mayor y puede ajustarse el volumen de la solución de formación de coágulo. El volumen final debe seguir siendo 200 μl. - Si probando compuestos inhibitorios, diluir el compuesto a la concentración de trabajo como DMSO. Añadir compuesto o DMSO solo para un control de los pozos con Aβ42 y mezcla bien.
Nota: Solución de Aβ42 debe formar una gotita discreta en la parte inferior del pozo, el compuesto o DMSO se debe pipetearse directamente en el centro de la gota. - Diluir la solución de paso 1.2.4 búfer de formación de coágulo de fibrinógeno (20 mM de tampón HEPES (pH 7.4), 5 mM CaCl2y 137 mM NaCl) y añadir a Aβ42 pozos que contienen y el control de la placa de 96 pocillos. Ajustar el volumen de la solución de fibrinógeno para que su concentración final sea de 1.5 μm en total volumen de reacción de 200 μl. Pipetear la solución lentamente y no se formen burbujas. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min agitando en una plataforma giratoria.
Nota: El volumen de solución de fibrinógeno puede variar dependiendo de su concentración de stock, pero el volumen total en cada una debe ser 170 μl durante la incubación. - Preparar solución de trombina trombina comercialmente purificado polvo en ddH2O para hacer una solución madre de 50 U/mL de disolución. Diluir a la solución de trabajo de 5 U/mL en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) directamente antes de su uso.
- Después de 30 min de incubación, al mismo tiempo Añadir 30 μl de solución de trombina (5 U/mL) en las soluciones de fibrinógeno en la placa de 96 pocillos de paso 2.3 con pipeta multicanal. Adición de la trombina inmediatamente iniciará la formación de coágulos. Por lo tanto, añadir trombina directamente en el centro de la solución de fibrinógeno con cuidado para evitar la formación de burbujas.
Nota: La actividad de la trombina puede variar entre las condiciones experimentales, así como gran cantidad de trombina. La concentración correcta requerida para producir robusta coágulos deba determinarse empíricamente. - Leer la absorbancia del coágulo en vitro en un lector de placas inmediatamente después de la adición de trombina. Medir la absorbancia a 350 nm en el transcurso de 10 minutos, cada 30-60 s. realizar el ensayo completo a temperatura ambiente.
Nota: Algunos compuestos de inhibidor pueden alterar la absorbancia de la solución a 350 nm, en que caso la turbidez se puede medir a 405 nm.
3. microscopía electrónica de barrido
- Preparación de coágulo, fijación y lavado
- Lugar limpio siliconado círculo tapa portaobjetos (12 mm) en una placa bien de 12 o 24 pocillos usando fórceps.
- Preparación de fibrinógeno en el almacenador intermediario de la formación de coágulos. Consulte el protocolo paso 1.2 para más detalles.
- Para evaluar el efecto de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aß en la estructura del coágulo de fibrina, siga las instrucciones para la incubación como se describe para el ensayo de turbidez (paso 2). Siempre incluir pocillos de control que contienen fibrinógeno en ausencia de Aβ y de inhibidores.
- Pipetear 80 μl de la mezcla de fibrinógeno de paso 3.1.3 en las diapositivas de la cubierta. Extender suavemente la solución para que se distribuya uniformemente en la diapositiva de cubierta.
- Diluir la acción de la trombina (50 U/mL) en solución salina tamponada con HEPES 20 mM a una concentración final de 2,5 U/mL y agregar 20 μl directamente al centro de la solución de fibrinógeno sin mezclar.
Nota: Si es necesario, puede utilizarse una mayor concentración de trabajo de la trombina (5 U/mL). - Cubrir la placa de 12 pozos con una tapa de plástico y dejarla a temperatura ambiente durante 30-60 min.
- La coagulación de la reacción en marcha, preparar soluciones de deshidratación y fijación. Preparar el buffer de cacodilato de sodio (0,1 M, pH 7.4). Diluir la solución madre de glutaraldehído al 10% en buffer de cacodilato de sodio (0,1 M, pH 7.4) para hacer una solución de glutaraldehído del 2%. Mantener todas estas soluciones en el hielo. Debe utilizarse recién diluido glutaraldehído (2%) dentro de 1 semana, cuando se almacena correctamente en un refrigerador a 4 ° C.
- Diluir etanol absoluto (100%) en agua bidestilada (etanol 80%, 50% y 20%). Mantenga las soluciones de etanol y etanol absoluto (100%) sobre el hielo.
PRECAUCIÓN: tenga cuidado al manejar el cacodilato de sodio y glutaraldehído, realice estos pasos en una campana química. - Después de 30 minutos, lave suavemente los coágulos con buffer de cacodilato de sodio helada (0,1 M) dos veces. Añadir 2 mL de la solución a cada pocillo que el coágulo está totalmente sumergido. Cubra la placa bien con una tapa y dejar reposar 2 min a temperatura ambiente. Después de 2 minutos, retire con cuidado el búfer utilizando una pipeta de 1 mL o pipeta de tallo estrecho. Repetir una vez.
- Fijar los coágulos con helada glutaraldehido (2%). Mantener la placa bien en el hielo, añadir unos 2-3 mL de glutaraldehído al 2% a cada pocillo. Asegúrese de que los coágulos son completamente sumergidos. Tapar y dejar la placa en el hielo durante 30 minutos.
- Después de 30 min, suavemente Quite el glutaraldehído de cada bien y lavar los coágulos con buffer de cacodilato de sodio (0,1 M) como se describe anteriormente (2 minutos, dos veces). Mantenga la placa bien en el hielo.
- Deshidratación serie de coágulo y el secado de punto crítico
- Deshidratar los coágulos en una serie gradual de etanol helada lavados preparados en el paso 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% y again100%) durante 5 minutos. Para cada serie de etanol, agregue 2-3 mL, asegurándose de que los coágulos son sumergidos. Cubrir e incubar en hielo.
- Después de cada paso del etanol, retirar la solución de etanol con una pipeta de 1 mL o gotero pipeta desechable. No retire completamente el etanol. Asegúrese de que la superficie del coágulo no se expone al aire.
Nota: Deshidratación en etanol absoluto (100%) debe realizarse dos veces. - Manteniendo la muestra sumergida en etanol 100% final, transferir a un secador de punto crítico (CPD). Utilice un portamuestras CPD o un titular de tapa deslizante con una arandela para la transferencia de las diapositivas en la cámara CPD. Coloque al menos una arandela entre cada diapositiva.
- Sacar la corredera de cubierta de la sala CPD y montarlo en un trozo de SEM con cinta de carbón.
- Farfulle la capa y la proyección de imagen
- Transferir todas las muestras con trozo de SEM a la cámara de recubrimiento sputter.
- Farfulle la capa menos de 20 nm de oro/paladio o de otros materiales conductores, tales como carbón, usando un recubridor sputter vacío.
Nota: Hemos utilizado 18 nm de la capa de oro/paladio. El recubrimiento sputter se realizó 45 s y la velocidad de la capa fue de 4 Å / s. Farfullar revestido muestras son estables cuando se mantiene correctamente en un ambiente seco a temperatura ambiente durante semanas. Análisis de SEM se pueden realizar en cualquier momento. - Adquisición de imágenes en un microscopio equipado con el detector de SE2 a 4 kV.
Nota: El tamaño de píxel de la imagen en esta imagen la Coloque de 13 nm-31 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En el en vitro la coagulación prueba (turbidez), la trombina enzima hiende fibrinógeno, dando por resultado la formación de la fibrina red24. Esta formación de coágulo de fibrina causa dispersión de la luz que pasa a través de la solución, dando por resultado mayor turbidez (figura 1), estancamiento antes de finalizar el período de lectura (figura 2, verde). Cuando el fibrinógeno se incuba en presencia de Aβ42, disminución de la turbidez de la solución, con la curva alcanza una altura máxima de aproximadamente la mitad del fibrinógeno sólo (figura 2A, azul). En una publicación reciente, una serie de inhibidores de la agregación de Aβ se sintetizado y evaluado por su capacidad para inhibir la interacción de fibrinógeno de Aβ, identificar el compuesto TDI-276014. TDI-2760 hemos utilizado en nuestro estudio para bloquear la interacción de fibrinógeno de Aβ. Como se informó anteriormente, en presencia de TDI-2760, el efecto de Aβ se mejoró, como la turbiedad fue mayor que con Aβ solo (figura 2A, rojo). El efecto de TDI-2760 no aparece ser debido a la turbidez de fondo como el compuesto no cambió la turbiedad del coágulo de fibrina al Aß estaba ausente (figura 2A, púrpura). El en vitro coagulación análisis de turbidez descrito aquí es un método rápido y sencillo por que coágulo de fibrina formación y factores que pueden atenuar ese proceso pueden ser observados. GPRP, que se sabe para interferir con la polimerización de la fibrina por interferir con las interacciones18,25 de fibrina monómero orificio de la perilla se puede utilizar como control positivo para el análisis de turbidez (figura 2B). Consistente con los anteriores informes25, con la presencia de péptido GPRP, la turbiedad de coágulo de fibrina se redujo significativamente en comparación con la formación del coágulo de fibrina con su ausencia (figura 2B, azul vs verdes).
Siguiendo el mismo protocolo y condiciones como el análisis de turbidez descrito, coágulos de fibrina se prepararon en presencia y ausencia de Aβ o TDI-2760. Los coágulos luego se procesaron para microscopía electrónica por fijación, deshidratación, secado de punto crítico y recubrimiento sputter de oro (figura 1). Fibrinógeno en presencia sólo de la trombina y CaCl2 forma una malla de fibrina, con hilos alargados e intercaladas de fibrina, así como paquetes más grandes (Figura 3A). Cuando Aβ estaba presente, los hilos de fibrina se convirtió en más finos, con varios grupos pegajosos/agregados que indica anormalidades estructurales inducidas por Aβ (figura 3B). De acuerdo con los resultados de análisis de turbidez, TDI-2760 restauró parcialmente la estructura del coágulo de fibrina de cambios inducidos por Aβ, como matas menos estaban presentes (figura 3 C). Junto con el análisis de turbidez, SEM revela la extensión y calidad de los cambios inducidos por el Aβ para formación de coágulo de fibrina, así como la efectividad de un compuesto inhibitorio, TDI-2760.
Figura 1 : Representación esquemática del análisis del coágulo de fibrina por el análisis de turbidez y SEM. El esquema muestra los pasos involucrados en el análisis del coágulo de fibrina y el efecto de Aβ en turbiedad del coágulo de fibrina y topografía estructural. Las barras de escala de las imágenes de SEM (abajo izquierda) son 2 μm y el aumento es de 10, 000 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Medición del efecto Aβ42 en in vitro formación del coágulo de fibrina por análisis turbidez. (A) fibrinógeno fue incubado en presencia y ausencia de Aβ42. Formación del coágulo fue inducida por la trombina, lo que resulta en mayor turbidez de la solución (verde). En presencia de Aβ42, el coágulo de fibrina se estructuró anormalmente, dando por resultado disminuido turbidez (azul). El compuesto TDI-2760 o DMSO se incubaron con la solución de fibrinógeno, con y sin Aβ42. TDI-2760 había restaurado disminución Aβ42-inducida de turbidez (rojo) sin alterar la formación del coágulo normal (púrpura). (B) también se midió la turbidez de un inhibidor de la fibrinólisis conocido, GPRP como control positivo para este ensayo. El fibrinógeno fue incubado en presencia y ausencia de 1,5 μm GPRP y la turbidez medido después de la adición de la trombina. Similar a Aβ42, la turbiedad de la formación del coágulo de fibrina se redujo significativamente en presencia de GPRP (azul y verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de micrografías electrónicas de anormalidades inducidas por Aβ arquitectura del coágulo de fibrina. Análisis de micrografías electrónicas de la estructura del coágulo de fibrina obtienen de fibrinógeno purificado (A), fibrinógeno + Aβ42 (B), fibrinógeno + Aβ42 + TDI-2760 (C). Formación del coágulo se inició mediante la adición de trombina y CaCl2 a la mezcla. El análisis estructural reveló que coágulos formados en presencia de Aβ42 son más delgados y anormalmente agrupadas en comparación con el fibrinógeno por sí mismo. TDI-2760, que es conocido por inhibir la interacción de fibrinógeno de Aβ42, parcialmente corregido la anormalidad estructural de Aβ42 inducida del coágulo de fibrina. Barra de escala es 1 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los métodos descritos aquí proporcionan un medio rápido y reproducible de evaluación fibrina coágulo formación en vitro. Además, la simplicidad del sistema hace que la interpretación de cómo Aß afecta la formación de coágulos de fibrina y la estructura relativamente sencilla. En publicación anterior de este laboratorio, se comprobó que estos ensayos pueden utilizarse para probar compuestos por su capacidad para inhibir la interacción de fibrinógeno Aβ13,14. Usando estos dos análisis, una serie de compuestos sintetizados fueron analizados para que la capacidad de inhibir la interacción de fibrinógeno de Aβ. En realidad, el análisis de turbidez de coágulo puede utilizarse para reducir el pool de golpeados compuestos a los que tienen potencial terapéutico, como no todos los compuestos que pueden inhibir la interacción de fibrinógeno Aβ también pueden restaurar la formación de coágulos de fibrina.
Hay algunos aspectos de la prueba de turbidez que requieren solución de problemas o limitar los usos de esta técnica. La limitación principal es que puede haber algunas variaciones entre los experimentos que pueden complicar la interpretación de los resultados. Parte de esta variación es debido a la actividad de la trombina. Para solucionar el problema para la actividad de la trombina, los usuarios pueden probar múltiples concentraciones de trombina para la actividad de formación de coágulos antes de comenzar la experimentación con compuestos de Aß y prueba. Bajo las condiciones experimentales presentadas aquí, Aβ, en ausencia de fibrinógeno, no aumenta la turbidez de la solución por encima de niveles de fondo indicando que observar curvas de turbiedad son debido a la polimerización de la fibrina. Sin embargo, Aβ es un péptido de agregación-propensa y una mayor concentración de la solución Aβ cuando está guardado por un tiempo muy largo a temperatura ambiente o 37 ° C (varias horas) puede formar agregados fibrilares que pueden resultar en mayor turbidez. Si analizando el efecto de una solución de Aß que ha sido almacenada durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente o más, el estado de agregación de la solución puede determinarse por microscopía electrónica de transmisión. En el protocolo descrito aquí, se utilizan soluciones recién preparadas de Aß y el fibrinógeno, que debería eliminar los problemas de agregación. Sin embargo, para asegurar la calidad de estos preparados han sido evaluados por microscopía electrónica de transmisión. Además, cuando utilice un nuevo lote de péptido Aβ comercial, el grado de Oligomerización y la cantidad de oligómeros debería ser evaluado por microscopía electrónica de transmisión. Porque puede haber variación de lote a lote en péptido calidad y proporción de agregados preformados y Aß monomérico, que sin duda afecta a la tasa de Oligomerización. Es aconsejable comprobar la concentración de solución Aβ (método de BCA) antes de la incubación para la Oligomerización. Para minimizar estas variaciones, hemos intentado usar por lo menos 0.1 mg/mL de solución de Aβ para la reacción de formación del oligómero.
Porque este ensayo también es sensible a pequeños cambios ambientales como la temperatura y el movimiento, las lecturas de turbidez de diferentes experimentos deben no analizarse juntos. Esto significa que el número de condiciones que puede compararse es limitado por el número de pozos que la trombina se puede simultáneamente agregar a con una pipeta multicanal (es decir., 12). Los usuarios también deben ser conscientes que viscosidad o color en los búferes y compuestos de prueba puede conducir a una turbiedad alta fondo, oscurecimiento de la señal del coágulo de fibrina y dificulta la interpretación del experimento. Sin embargo, si todos los controles incluidos en cada experimento, debe ser posible determinar fácilmente si la señal de fondo está alterando la absorbancia de turbidez.
El análisis de turbidez proporciona información acerca de si la formación del coágulo de fibrina se ve obstaculizada por Aβ y además si inhibidor compuestos pueden paliar este efecto. Sin embargo, no revelan cómo la estructura del coágulo de fibrina se altera en respuesta a Aβ o compuestos del golpe. Esta pregunta puede ser abordada por SEM, como esto permite la visualización directa de la arquitectura del coágulo. SEM es una técnica bien establecida y se utiliza rutinariamente para la visualización de estructura del coágulo de fibrinógeno purificado o de plasma. Sin embargo, el proceso de preparación de coágulo tradicionales para el análisis de SEM puede ser complicado y desperdiciador de tiempo. Además, pequeñas diferencias en los protocolos entre diferentes grupos de investigación pueden hacer difícil replicar resultados24. Para tratar estos temas se desarrolló este protocolo optimizado, con el cual el efecto de Aβ para inducir más finos filamentos de fibrina y agregados de la proteína pueden observarse (figura 3). Como se observa en el análisis de turbidez, TDI-2760 alivia el efecto de Aβ, restaurando la estructura típica de los paquetes de fibrina (figura 3).
Hay unos pasos en la preparación de la muestra de la SEM, que también puede exigir la resolución de problemas. Cuando se utiliza a concentraciones muy bajas de fibrinógeno (0.5 μm o menos), los coágulos no pueden fijarse firmemente a la diapositiva de cristal y puede ser dañado/lavado lejos durante los pasos de fijación/lavado. Si utilizando bajas concentraciones de fibrinógeno, el tiempo de formación del coágulo, entre la adición de la trombina y la fijación, se puede aumentar hasta varias horas, como esto puede aumentar la estabilidad del coágulo. También, los usuarios deben evitar el uso alta resistencia fosfato buffer o tamponada fosfato salino para los análisis de SEM y turbiedad como los iones fosfato pueden interferir con el proceso de formación de coágulo mediada por calcio. Si utiliza cualquier otra sal alta que contiene tampón para la formación de coágulos y el análisis de SEM, después de la fijación, pasos de lavado debe realizarse también con ddH frío2O.
Análisis de SEM de muestras no conductoras tales como coágulos de fibrina requiere revestimiento con partículas cargadas por ejemplo, oro, paladio, plata o carbón. Grueso de capa es un factor importante en la proyección de imagen de SEM, ya que es posible que una capa muy gruesa de metal puede enmascarar la topografía superficial de la ultra estructura del coágulo de fibrina. En este protocolo, fina capa de oro/paladio (menos de 20 nm) se utilizan para el recubrimiento sputter. Para lograr menos de 20 grueso nm, la pulverización se realizó para 45 s con un índice de capa de 4 Å / s. Esta fina capa (18 nm) no aparece para enmascarar las características superficiales de ensamble de la fibrina. Sin embargo, si trata de enmascarar la ultra estructura del coágulo, revestimiento de carbono puede utilizarse como alternativa al oro/paladio, como dejará menos "islotes" de las moléculas de la capa sobre el material.
Mientras que el enfoque aquí ha sido en la interacción de fibrinógeno de Aβ, este protocolo puede ser modificado fácilmente para analizar la interacción de otras proteínas o compuestos con el coágulo de fibrina. Siguiendo estas instrucciones, los investigadores deberían ser capaces de reproducir en vitro la formación de coágulos de fibrina y realizar análisis con estos análisis aerodinámico coágulo-turbidez y protocolos de SEM. Como se muestra aquí con el inhibidor previamente publicado compuesto TDI-2760, estos métodos proporcionan información valiosa con respecto a la formación de coágulos de fibrina que puede aplicarse a otros estudios in vitro e in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Autores agradecen Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso y Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nueva York para la síntesis de inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aß y sus valiosas sugerencias. Autores también agradecen a los miembros del laboratorio de Strickland para el debate útil. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH NS104386 de Alzheimer Drug Discovery Foundation y fondo de desarrollo terapéutico de Robertson para H.A., NIH grant NS50537, el Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundación de la familia Rudin y John A. Herrmann de S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
