Summary
ここで説明したプロトコル具体的に単純な化学によって選定されたサイトでアデノ ウイルスのカプシドを変更することも可能。 にします。シールド アデノ ウイルス粒子のベクトルし、ターゲット遺伝子の転送ベクトルを生成することができます、ベクトル ホストの相互作用を学ぶことができます。
Abstract
アデノウイルスベクターは、遺伝的のワクチン接種と腫瘍溶解性 virotherapy の強力なツールです。しかし、彼らは体内納入後特に複数の好ましくないベクトル ホスト相互作用しやすいです。ベクトル表面の定義の変更が実行される場合、望ましくないベクトル ホスト相互作用によって課された制限できるだけコンセンサスを克服します。これらの変更には、不要なやりとりから粒子のシールドと、新しい配位子の導入によってターゲットが含まれます。ここで提示されたプロトコルの目標を生成するリーダーを有効にするのにはシールドし、必要な場合に再ターゲット ヒト アデノ ウイルス遺伝子の転送ベクトルまたは腫瘍溶解性ウイルス。プロトコルは、研究者が合成ポリマー、炭水化物、脂質、または他の生物学的または化学鎖の特定の化学吸着によるアデノ ウイルス ベクター カプシドの表面を変更する有効になります。アデノウイルスベクターの生体内での配信のための障壁の克服と理解を容易にするために示されている結合された遺伝物質と化学キャプシドの変更の最先端の技術を説明します。生物学的活性のウイルスやウイルス由来のベクトルで特定の化学反応を実行するための重要なステップの詳細とコメントの説明が提供されます。プロトコルに記載されている技術 (当然欠席) システインの遺伝子の導入に基づいているアデノ ウィルス由来のベクターの溶媒露出ループに残留。これらのシステイン残基が高価にベクトルの生産後、ベクトルにさまざまな物質のクラスから分子の共有結合化学結合を特定性の効率的な悪用されることができます、特定の化学反応性を提供します。粒子。重要なは、このプロトコルは、さまざまな異なるアデノ ウイルス ベクター カプシドの (非チオール ベースの) の化学修飾を行う簡単に適合できます。最後に、それは可能性が高いそのエンベロープを持たないウイルス遺伝子の転送ベクトル以外、アデノ ウイルスは、このプロトコルの基本から変更できます。
Introduction
アデノ ウイルス (Ad)、アデノ ウイルス、家族のメンバーは、エンベロープを持たない DNA ウイルスの 70 以上の種類の識別 (http://hadvwg.gmu.edu) がこれまでされています。Hemaglutination プロパティ、ゲノム構造および結果を配列する、に応じて 70年広告の種類は 7 種 (人間のアデノ ウィルス A g)1,2に分割できます。ヒトゲノム広告サイズ 38 kb し、正二十面体のヌクレオキャプシド3によってカプセル化されました。その豊富なのためのキャプシド蛋白質ヘクソン、ペントン ベース、および繊維すべてと呼ばれます主要キャプシド蛋白質。最も豊かで、最も大きいキャプシド蛋白質ヘクソンを形作る 20 キャプシドの面があり、それぞれ 12 ヘクソン homotrimers4,5で構成されます。ペントン、正二十面体の辺 (頂点) があるはペントン ベースのポリアクリルアミドゲルから成り、糖繊維スチレンダイマー5,6の組み込まれている頂点スパイク ベースを表します。ネイティブの広告のセルの入力は基本的に 2 つの主要な手順で構成されます。最初に、繊維ノブはプライマリの受容体に結合します。これは、広告の種類は、A、C、E、および F の種から、コクサッキー、アデノ ウイルス受容体 (車) です。この相互作用は、これにより細胞のインテグリンと RGD モチーフのペントンの基本とその結果誘導細胞応答の相互作用を促進する、細胞表面の空間的近接性に virion をもたらします。第二に、細胞骨格の変化は、ウイルス粒子とエンドソーム7への輸送の内面化に します。Virion のリリース、エンドソームの部分的な分解は、時に細胞質に und は最終的にレプリケーションのための核に移動します。
広告をローカルに配信することができますしながら (e.g。、遺伝的のワクチン接種のため)、新規 virotherapy の必要に応じて、血流を介して全身配信いくつかの障壁に直面しています。血流に循環しながら注入された粒子は宿主の免疫系、ウイルスのベクトルの高速中和に至ると広告ベースのベクトルを全身用に非常に非効率的なレンダリングの防衛システムを発生します。さらに、広告の自然 hepatotropism 全身配信と干渉し、広告をその新しい標的細胞にリダイレクトするのには解決する必要があります。
自然免疫系の自然な IgM 抗体を生殖エンコードは急速に認識し、ウイルス粒子8,9の表面に反復性の高い構造をバインドします。これらの免疫の複合体は、ウイルス粒子8の大部分の高速補体を介した中和に至る、補体系の古典と非古典的経路をアクティブにします。広告ウイルス粒子の主要除去 2 番目の経路はマクロファージ10によって媒介され、急性毒性と血行動態の副作用11,12に関連付けられています。広告の場合特に、クッパー細胞、肝臓に存在するのにバインドし、それにより特定スカベン ジャー受容広告ウイルス粒子を介してを取る phagocytically それらを排除し血液13,報14,15 から.特定のスカベン ジャー受容体は、肝類洞内皮細胞 (LSE 細胞)16、識別されているし、LSE 細胞はまた貢献するベクトル除去17がどの程度、まだ説明が必要みたい。さらに、いくつかの広告の種類とその派生の媒介はひと赤血球18 を介して車または補体受容体 CR119結合するによって効率的に隔離します。注記のうち、ひと赤血球とは対照的ようにマウス モデルにおけるこの隔離メカニズムを検討することはできません、マウス赤血球は車を表現しないでください。
または全身用で最初の配信後に広告のいずれかにより、広告に以前感染症への暴露後免疫システムによって生成された特定のアンチ広告抗体を上げる広告ベクトルの有効活用にさらにバリアとで回避する必要があります。効率的に全身配信。
最後に、深刻な広告種類 (Ad5 を含む) の強い hepatotropism は、全身療法で広告のアプリケーションを妨げています。この親和性肝細胞伝達の結果は、血液凝固因子 X (FX) FX 広告ヘクソン タンパク質20,21,22との相互作用によって仲介する広告 virion の親和性の高さによるものです。FX は、ヘパリン硫酸糖鎖 (HSPGs) 肝細胞20,23,24,25面上に virion を橋します。この相互作用のための重要な要因は、他の細胞型の HSPGs とは異なるである肝細胞24HSPGs の N- と O-硫酸化の特定の範囲をするようです。この FX を介した経路に加えて、最近の研究は、さらに経路がまだ肝細胞26,27,28の Ad 変換の結果を識別を示唆します。
最近では、それによって示されている FX は、のみ、広告の肝細胞の情報伝達に関与していないが、virion シールド中性化に対するウイルス粒子のバインディングによっても補完システム26。FX の結合を防止することにより肝細胞伝達の減少したがって、だろう作成広告中和を介して増加の望ましくない副作用生得の免疫組織。
ベクトルおよびホストの有機体間の複雑な相互作用の深遠な知識に全身のアプリケーション ホストの有機体によって課された障害物を回避するためのより効率的なベクトルを開発が必要です。
治療用タンパク質もともと使用されている方法の 1 つは、少なくとも部分的に上記の記述の障壁を克服するために広告のベクトルに適応されています。抗原性と免疫原性治療用タンパク質化合物は、ポリエチレング リコール (PEG)29,30に結合によって削減できた。したがって、ペグなどポリ [n-(2-ヒドロキシプロピル) methacrylamid] ポリマーの共有カップリング (pHPMA) キャプシドに表面シールド不要なベクトル ホスト相互作用からベクトル。一般的に、高分子カップリングはキャプシド表面にランダムに配布される側のリジン残基の ε-アミン グループを対象します。ベクトル粒子溶液、添付のポリマーの親水性の性質のため免疫細胞認識や酵素分解のリスクを低減する安定した水シェルに囲まれています。また、ペグインターフェロン広告ベクトルは反ヘクソン抗体の in vitroとあらかじめ免疫マウス生体内で31で中性化を回避するために示されていた。遺伝キャプシドの変更と対照をなして生産と精製、従来プロデューサー細胞と高価ベクトル株式はまたの生産の使用のためだけではなくを同時にできるように後ポリマーの化学結合が実行されます。カプシドの表面にアミノ酸の何千もの変更。ただし、シールド アミン監督は、全体キャプシドの表面に、高い不均質媒質中の結果、特定の capsomers の変更を許可しない中でランダムに生じる。さらに、有益な効果に必要な大きいポリマー鎖は、ウイルス活性32を損ないます。
これらの制限は、Kreppelらを克服。33は、ベクトル re-とターゲット解除の geneti 化学概念を導入しました。システインは、繊維こんにちループ33、タンパク質 IX34、ヘクソン35,36などの溶媒露出位置ウイルス キャプシドに遺伝子導入されました。ただし、正常細胞の高価でない自然発生する、システインを含む広告ベクトルを生成できます。重要なは、特定の capsomers、1 つの capsomer 内の異なる位置のシステインの挿入チオール グループ反応鎖の非常に特定の変更ことができます。この geneti 化学的アプローチは、広告ベクター デザインで多数の障害を克服するために示されています。Detargeting、こんにちはループが正常に再ターゲットする車欠損細胞33広告ベクトルを変更証明されている繊維ノブにトランスフェリンのチオール系カップリングのアミン系 peg 修飾操作の組み合わせです。ヘクソンは (中和抗体、血液凝固因子 FX) 最も望ましくない相互作用に関与しているので、チオール ベースの変更戦略もヘクソンに適用されました。大規模な PEG 鎖増加肝細胞伝達14,35へと skov 氏 - FX の存在下で細胞を変換する Ad ベクトル粒子を防ぐヘクソンの HVR5 に小さな PEG 鎖を結合します。広告ベクトル粒子の突然変異を運ぶ車の結合を阻害する繊維ノブと FX (と peg 修飾操作位置固有の HVR1 で挿入軸受システイン) の HVR7 抑制結合抗体と補体の中性化を回避するために示されていた感染性を失うことがなくスカベン ジャー受容体を介したの取り込み。興味深いことに、にもかかわらず自然 FX シールドの欠如、peg 修飾操作再び改善肝細胞の伝達ペグのサイズ36の機能として。ただし、共有結合性シールド、細胞内輸送プロセスに影響があるにが示されました。プリルら。pHPMA に基づいており、シールドも共重合体の料金のどちらのモードはセルの入力に影響を与えたが、粒子が核に人身売買に影響を与えるかを実証のための生体機能盾と不可逆的な比較。ベクトルの in vitroとin vivoの37の正荷電の pHPMA 共重合体の粒子が広告の高い伝達効率を維持する核に人身売買の許可のための生体機能のシールドを採用します。
要約すると、これらのデータすべてベクトル ホスト間相互作用が知られているし、見なすことの仮定の下でも、過剰なキャプシド表面改質、全身・ ベクターに関連付けられているハードルを克服するために必要なことを示します。
ここでは、シールドやアデノ ウイルスのベクトル粒子やアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ウイルスの再ターゲットのためのアデノ ウイルスのベクトルのカプシドの部位特異的化学修飾を実行するためのプロトコルを提供します。この技術のコンセプトは、図 1の通りです。それは、合成高分子のキャラクタリゼーション キャプシドの特定の領域の不要なやりとりからシールドができます。同時に、それはまた配位子を接続し、シールドとターゲットを結合するための手段を提供します。単純な化学を使用すると、実験者は共有結合ペプチドやタンパク質、炭水化物、脂質などの分子および他の小さい分子の多種多様なアデノ ウイルスのベクトル表面を変更することができます。さらに、プロトコルは、生物学的整合性と活動の維持の下で生物学的にアクティブなウイルス由来ベクトルの化学修飾の一般的な概念を提供します。
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Protocol
注: 以下では、ベクトルは詳細に記載されている広告の geneti 化学を peg 修飾操作するためのプロトコル。ペグ部分の特定の結合を有効にするには、Ad5 ベクトルはあらかじめ遺伝子以前の文書36およびマレイミド活性化 PEG の説明に従って可変ループ 5 でヘクソン タンパク質システイン残基を導入した変更化合物は、化合物のカップリングとして使用されます。
1. CsCL ステップ グラデーション ベクター精製バッファーの準備
- 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL) を追加することで 400 mL のアデノ ウイルス バッファー (広告-バッファー) の準備と 150 mM NaCl 3.504 g (400 mL) 二重蒸留水 (ddH2O)。このバッファーの 350 mL に必要な次の 3 つの広告-バッファー バリエーションを準備します。
- バリエーション a: 広告-バッファーの 150 mL の NaOH で ph 7.6 を調整します。
- バリアント b: は 50 mL に最終濃度 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] を追加し、塩酸で pH 7.2 にそれを調整します。
- バリアントの c: は、150 mL に 0.5 mM TCEP (0.022 g) の最終的な集中を追加し、塩酸で pH 7.2 に調整。
- DdH2O でバッファーを準備と分析グレード化学薬品。CsCl のバッファーを準備する変種 A と変種 C 各 100 mL を使用 (を参照してくださいステップ 1.2 と 1.3; 50 mL) CsCl ステップ グラデーションに必要な (3.2.6 の手順を参照してください。 と 3.2.18)。
- CsCl ステップ グラデーション バッファーの準備 (ρCsCl = 1.41 g/cm3) 広告バッファー内
注: 2 つの異なるバリエーションでこのバッファーを必要と。- CsCl の 50 mL チューブに正確 27.42 g の 2 つの因数の重量を量る。
- ΡCsCl = 1.41/TCEP バッファー: 40 ml 変形 C Ad バッファーの CsCl を解決します。
- ΡCsCl = 1.41 バッファー: 40 ml 変形 A 広告バッファーの CsCl を解決します。
- 、を確認し、必要に応じて、対応する広告バッファー バリアント正確 50 mL まで HCl。 塗りつぶしと pH を調整します。最高の分離結果を達成するために正確な CsCl 濃度と pH が重要です。
- 密度 (CsCl コンテンツ) を確認するには、各グラデーション バッファーの 1 mL (1.41 g) の重量を量るします。
- CsCl ステップ グラデーション バッファーの準備 (ρCsCl = 1.27 g/cm3) 広告バッファー内
注: このバッファーは、2 つの異なるバリエーションで必要です。- 2 因数 CsCl の 50 mL チューブに正確 18.46 グラムの重量を量る。
- ΡCsCl = 1.27/TCEP バッファー: 40 ml 変形 C Ad バッファーの CsCl を解決します。
- ΡCsCl = 1.27 バッファー: 40 ml 変形 A 広告バッファーの CsCl を解決します。
- チェック、そして必要に応じて、塩酸で pH を調整します。最後に、対応する広告バッファー バリアント正確 50 mL まで記入してください。最高の分離結果を達成するために正確な CsCl 濃度と pH が重要です。
- 密度 (CsCl コンテンツ) を確認するには、各グラデーション バッファーの 1 mL (1.27 g) の重量を量るします。
- すべてのバッファー (Ad バッファーおよび CsCl ステップ グラデーション バッファー) を滅菌ボトルに濾過 (0.45 μ m メッシュ細孔サイズを使用) で滅菌します。
- 滅菌後、TCEP の酸化を防ぐためには、飽和し、アルゴンガスを約 30 のバッファーをエアスパージング アルゴンと TCEP を含むバッファーをオーバーレイ s。世話を生殖不能のデバイスのみを使用する (e.g。、滅菌ピペットのヒント) アルゴン ガスとアルゴン脂身を許可するのに十分な大きさの使用のボトルを適用する場合。
注: すべてのバッファー新鮮で光から保護された準備されるべきし、数日間 4 ° C で保存できます (特に CsCl ステップ グラデーション バッファー数日間おくだけ)。
2. カップリング: ストレージと準備
注: システインに結合の使用 Moeities は、チオール反応性基を負担する必要があります。マレイミド活性化合物は遺伝子導入のシステインと安定チオエーテル結合を形成します。また、オルト-pyridyldisulfide (OPSS)-ベクトル粒子と結合部位のための生体機能ジスルフィドを形成する活性化合物を使用することができます。他のほとんどのカップリング試薬と同様に凍結乾燥 malPEG 750 加水分解に敏感、-80 ° C で凍結乾燥粉末の形で乾燥保存されている必要があります。
- バイアルの融解時に水を凝縮のビルドアップを防ぐためより大きい管のバイアルを保存 (e.g。、50 mL の管) シリカゲル ビーズのクッションでいっぱい。またシリカゲル ビーズ クッションで満ちている十分なより大きい容器にこれらの管を格納します。
- 各チューブとコンテナーをしっかりと閉じる前にアルゴンガスと空気を交換します。これは、乾燥器、取り外しとアルゴンガスと空気を交換後に開いてチューブと容器を配置することによって実現できます。アルゴンガスは空気より重いため、チューブと容器アルゴンガス中に埋められるし、各蓋を密閉で、お互いに今すぐ配置ことができます。
- -80 ° C でコンテナーを格納します。
- 融解とき、デシケータのシリカビーズにコンテナーを配置し、ゆっくりと室温まで暖める、コンテナーを開きます。
- カップリング反応を実行すると、適切な溶媒に必要な基質の結合の量を解決する新鮮な。DMF や DMSO はカップリングの基質の溶媒として使用される場合は特に最終カップリング反応にソリューションを結合の 10% 以上を追加しないように注意してください。
3. 増幅、浄化とベクターの化学修飾:
- ベクターの増幅
注: 次の手順は、ローカルの生物学的安全規則に従って安全キャビネットを使用して実行する必要があります。- HEK 293 細胞 Kratzer Kreppel のための38のとおりに 1 つ (または複数) の遺伝子導入されたシステイン residue(s) を含むレプリケーション欠乏 ∆E1 広告ベクトルを transfect します。
- 38プロトコルによると 15-20 大 (15 cm) 細胞培養皿 (約 1-2 107セル/プレート x) の最終的な分取感染まで順次再感染によってベクトルを増幅します。
注: 最適な最後の再感染する必要がありますタイムアウトになる細胞は浄化と変更のパフォーマンスの朝に完全細胞変性効果 (CPE) を示すので、(図 2参照)。 - -80 ° c; 最終増幅ステップ後広告バッファー + 10 mM TCEP (バリアントの B) で再停止されるセルを固定できます。ただし、ベクトル粒子の最適な収穫のためのセル換散およびベクトルの浄化と変更の即時フォロー アップを推奨します。
- ベクターの精製と化学修飾
注: ベクトルの精製で説明したアデノ ウイルスの浄化のプロトコルに従って実行されます。38しかし、非酸化性の条件。1 日でベクトルの精製と化学の変更を実行できるだけでなく、細胞の収穫および換散。収穫し、前に説明したプロトコルに従って感染した細胞を溶解させます。38.- 細胞を収集するには、プレートをこすると、200-500 mL の遠心分離管に上清を移します。
- 400 x g で 10 分間携帯ソリューションをスピンします。
- 4 mL 広告バッファー + 10 mM TCEP (pH 7.2) (バリアントの B) で滅菌 50 mL チューブへの転送細胞ペレットを再懸濁します。細胞収率が低い場合のみ弱い CPE を惹起、2 mL でそれを再懸濁します。
- (液体窒素) の凍結と融解 (37 ° C の水浴) の 3 つの周期によってベクトルを救出します。
- 4 ° C で 5,000 × g で 10 分間のスピンします。
- 遠心分離中に、は、次の 2 つの等しい CsCl ステップ グラデーションを準備します。
- まず、下の相として広告バッファー + 0.5 mM TCEP (pH 7.2, バリアント C) 遠心チューブに 1.41 g/cm3 ρCsCl の 3 mL を加えます。上部の段階をロードする前にチューブの下相のレベルをマークします。
- 慎重に下相に管壁に沿って 5 mL の容積を非常にゆっくりとピペッティングによる広告バッファー + 0.5 mM TCEP (pH 7.2, バリアント C) 1.27 g/cm 3 の ρCsCl の 5 mL の上部の段階をスタックします。
注: 以来結合中 TCEP の高濃度 malPEG 750 のマレイミド残基と反応でき、減らされた結合効率、既に TCEP 集中力の低下の下で実行する必要がありますステップ グラデーション CsCl による浄化に 。
- CsCl の勾配に上澄みを読み込む [いずれか均等に両方のグラデーションの上にまたは低収量 (上記参照) の場合は、上清を分割, 1 列だけに上清をロード] 広告バッファー + 10 mM TCEP (pH 7 の上に均等に両方のグラデーションを埋めると.2、バリアントの B)。
- 0.0 g の重量差に反対側のチューブの重量を調整します。
- 4 ° C で 176,000 の x g で 2 時間超遠心機
- クランプでアクセス可能な低い段階レベル マークの周りの領域を残して、スタンドに遠心管を修正します。チューブ上グースネック ランプを配置します。下部と上部の段階の間の国境でのマークの周り異なるバンド (ベクトル粒子) は目に見える (図 3 a-3 C) をする必要があります。
- 針でチューブを穿刺して注射器にベクトル バンドを目指すベクトルを収集します。15 mL チューブに集められたベクトル粒子を転送します。
注: Ad ベクトル バンド上弱いバンド不完全なベクトル粒子を含んでいるし、誤嚥を避けるべきであります。細胞の残骸と緑の EGFP 発現ベクター蛍光タンパク質 (EGFP) は、超遠心機の上の部分で収集管 (図 3 a 3 bを参照)。これと次の手順 (ステップ 3.2.16) を結合まで行わなければならないスピーディー、ベクトル、ジスルフィド結合低 TCEP 濃度のために賢明な今。 - カップリング基板のシステイン残基がすべてベクトル準備する基板の効率的な完全なバインドに必要な量を計算するには、OD260を測定します。
- Kratzer と Kreppel38、渦収集ベクトル粒子の 10 μ L の混合物、広告バッファーの 89 μ L、1 μ L 10 %sds のによって記述されているプロトコルによると。空白のプローブ、広告バッファーの渦 99 μ L と 10 %sds の 1 μ L。
- ビリオンを変性するには、56 ° C 10 分の両方を孵化させなさい。
- OD260を決定します。
- 次の方程式を使って μ L あたり物理ベクトル力価を計算: OD260 x 広告の経験的に断固消散係数 x 希釈率 (× 109ベクトル粒子 1.1 = 1 OD260単位/μ L)。したがって、ベクトルの 1.36 の測定の OD260の 1:10 の希釈を計算する: 1.36 x 10 x 1.1 × 109 = 約 1.5 倍の 1010ベクトル粒子/μ L。
注: この抗体は、大まかな推定ただし、次のように記載されている化学量論の計算のために十分に正確です。
- システインの導入によって変更されたタンパク質によって結合基板 (グラム) で次の一般的な方程式によるとの高効率結合反応の量を決定する: ウイルス価ボリューム x システインの数 x 部の過剰 x x分子の重量部の/6,022 x 1023グラムの基板を結合を =。
注: この式で: 1) ウイルス力価は上記のカップリングの反作用で使用される熱望のベクトル μ L のボリュームのボリューム 2) アカウントのように OD260によって決定されますの価/μ L、3) システインの数は、蛋白質の数、システイン残渣はベクトル粒子、4 あたり導入されました) 部の過剰部分余分な効率的なカップリング反応 (50 倍)、5 必要な要因である) 部分の分子量は Da (ない kDa) として導入される必要があります。 - 新鮮な化合物の量を解決 (または容量) 適当な溶剤で必要とされます。
注: 必要なカップリングの基質の量は低重量を量りにくい、高価な複合の可能な限りの最小限の重量を量る、カップリング反応への応用のための適切な濃度で溶解します。 - ベクトル ソリューションを適切なサイズのチューブ (2 mL チューブなど) に転送し、ベクターに複合原液を結合の計算量を追加します。
- そっと部屋の温度で 1 時間のオーバーヘッドの回転によってソリューションをミックスします。
- 6 mL の合計容積広告バッファー (pH 7.6, バリアント A) にベクトル ソリューションを埋めます。
注: まだ最初のステップのグラデーションから CsCl を含む、ベクトル ソリューションの密度が 1.27 g/mL 以下であることを確認するステップのグラデーションにソリューションを適用する前に、この手順を実行する必要があります。 - 2 番目 CsCl のバンディング ステップで未反応の結合部位からベクトルを浄化します。
- ごとに次の手順を実行することによって 2 つの等しい CsCl ステップ グラデーションを準備: 1) 下相: 広告-バッファー (pH 7.6, バリアント A) で 1.41 g/cm3 ρCsCl 3 mL 2) マーク上部の段階、3) 上部段階をロードする前にチューブの下相のレベル: 広告-バッファー (pH 7.6, バリアント A) で 1.27 g/cm3 ρCsCl 5 mL。
注: 結合は起こった後 TCEP なしバッファーとして使用されます、無料のチオール グループが今ないことベクトル カプシドに。 - CsCl 勾配に上澄みをロードし、広告バッファー (pH 7.6, バリアント A) と上部に均等に両方のグラデーションを入力します。
- 0.0 g の重量差に反対側の管の太さを調整します。
- ごとに次の手順を実行することによって 2 つの等しい CsCl ステップ グラデーションを準備: 1) 下相: 広告-バッファー (pH 7.6, バリアント A) で 1.41 g/cm3 ρCsCl 3 mL 2) マーク上部の段階、3) 上部段階をロードする前にチューブの下相のレベル: 広告-バッファー (pH 7.6, バリアント A) で 1.27 g/cm3 ρCsCl 5 mL。
- 4 ° C で 176,000 の x g で 2 時間超遠心機
- 遠心の終了直前に Ad バッファー (pH 7.6, バリアント A) 5 mL で 5 回 PD 10 列を平衡します。
- 3.2.10 のステップで行って、低い段階レベル マーク周辺のアクセスを残して立って遠心管を修正します。チューブ上グースネック ランプを配置します。再び、境界線の下部と上部の段階の間、異なるバンド (ベクトル粒子) が表示されます (図 3) をする必要があります。
- 針でチューブを穿刺して、注射器にベクトル バンドを目指すベクトルを収集し、ベクトルを 15 mL チューブに転送します。両方の勾配管 2.5 mL の総数として一緒に以下のウイルス粒子を収集するために世話をします。小さいボリュームが収集された場合広告バッファー (A のバリアント) を 2.5 mL の総数を取得する入力します。
- 平衡の PD 列に 2.5 mL をロードします。流れを破棄します。
- 列に広告バッファー (A のバリアント) の 3 mL を追加し、(精製されたベクター ウイルス粒子を含む) の流れを収集します。
- 最終濃度 10% を取得して適切な因数 (例えば400 μ L 各)、分割グリセロール (333 μ L) を追加し、OD260測定による力価測定 20 μ L の因数が含まれます。
- -80 ° C でベクター ソリューションを格納します。
- OD260 20 μ L ベクトル ソリューション、Ad バッファー (A のバリアント)、79 μ、1 μ L の 10% SDS 3.2.12 の手順で説明されているように測定することによりベクトルの力価を決定します。空白、広告バッファー (A のバリアント)、10% グリセロール、10 μ、1 μ L の 10 %sds の 79 μ L を使用します。
- としてベクトル力価を計算: OD260 x 109ベクトル粒子/μ L × 1.1 倍希釈のファクター。
3.2.27 の手順で準備として計算: OD260 x 5 109ベクトル粒子/μ L × 1.1 ×
4. SDS-PAGE による結合度の検証:
注: 広告ウイルス粒子に結合の十分に高分子量の化合物を使用している場合カップリングはポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で確認できます。成功した結合する必要があります変更されていない広告ウイルス粒子中のタンパク質と比較して、変更された広告ウイルス粒子タンパク質に対応する蛋白質バンドのシフトの結果、(図 4を参照)。
- ベクトル (ステップ 3.2.28) の計算力価によると 1-2 × SDS ページ (8%) で 1010ベクトル粒子を分離します。
- 銀染色法も弱いタンパク質のバンドを検出するゲル39でゲルを開発します。
- 銀染色 (100 mL のバッファーに必要な量は括弧で示される) のバッファーを準備します。
- DdH2O、50% の 38 mL を混合することによって 1 のバッファーを準備メタノール (メタノール 100 の 50 mL) 12% 中 (100% の 12 mL 中)、0.0185% ホルムアルデヒド (37% の 50 μ L HCHO)。
- 50% を追加することによって 2 のバッファーを準備エタノール (100 %50 mL EtOH) ddH2O を 50 mL に
- DdH2O を 100 mL に 0.127 g/L の Na2S2O3 (12.744 mg) を追加することによって 3 のバッファーを準備します。
- 2 g/L アグノ3 (0.2 g) および 0.0185% 加えることによってバッファー 4 を準備ホルムアルデヒド (37% の 50 μ L HCHO) ddH2O. 100 mL に
- 60 グラム/L の Na2CO3 (6 g)、0.0185% を追加することによってバッファー 5 を準備ホルムアルデヒド (37% の 50 μ L HCHO) と 2.5 mg/L の Na2S2O3 (0.256 mg) を ddH2O 100 mL の最終的なボリュームを取得します。
- DdH2O、50% の 38 mL を混合することによって 6 のバッファーを準備 MeOH (100 %50 mL メタノール)、および 12% 中 (100% の 12 mL 中)。
- DdH2O、30% の 60 mL を混合することによって 7 のバッファーを準備メタノール (100 %30 mL メタノール)、および 10% グリセリン (100% グリセリン 10 mL)。
- DdH2O. 90 mL で 10% グリセリン (100% グリセリン 10 mL) を混合することによってバッファー 8 を準備します。
- 銀染色 (100 mL のバッファーに必要な量は括弧で示される) のバッファーを準備します。
- 銀染色を行う
- 30 分のバッファー 1 のゲルを修正します。
- 15 分間 2 バッファーでゲルを洗浄します。
- 1 分 3 バッファーでゲルを前処理します。
- DdH220 O でゲルを 3 回洗って s。
- 20 分の 4 バッファーでゲルを含浸します。
- DdH2O 20 のためのゲルを 2 回洗う s。
- バンドが表示されるまでバッファー 5 でゲルを開発 (10 秒 10 分)。
- DdH2O 2 分間の 2 回、ゲルを洗ってください。
- 5 分用のバッファー 6 の開発を停止します。
- 20 分間 7 バッファーでゲルを節約します。
- 8 バッファーでゲルを格納します。
注: 結合効率は、対象となる capsomere の変更されたバンドのデンシトメトリーの定量化による決定できます。
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Representative Results
図 2は、成功ベクトル生産を示します 293 の (HEK 293) 細胞の細胞変性効果 (CPE) の例を示します。セル型ウイルスベクター接種後 40 〜 48 時間形態 (図 2) が表示されます。収穫のための右の timepoint は、セル換散によってウイルス粒子を失っていないと遺伝子導入のチオール基の酸化を防止するため重要です。ベクトル粒子は、セル換散によって媒体に公開された場合、導入したチオール、すぐに酸化と浄化し、化学的に変更することは困難となります。
図 3は、模範的な CsCl バンドを示しています。化学修飾は、ウイルスの粒子から細胞の残骸を削除する前に、不連続 CsCl バンディングの目的。その後、改変自体は CsCl で起こることができます。化学修飾の後 2 番目のバンディング (未反応) 結合部位の過剰を削除するのに役立ちます。ノートでは、ウイルスが正常に変更グラデーションでは見られない、さらに理想的で SDS ページの分子分析が必要です。
図 4は、成功したキャプシド変更の典型的な例を示します。特定型に結合されたほとんどの部分は、SDS ページのそれぞれの型の実行動作を変更します。変更されていないコントロールとの直接比較によってカップリングの成功が確認でき、デンシトメトリー分析は全体的な判断を助けることができる結合効率 (変更された capsomere のシフト、シフトのバンドの %)。
図 1: アデノ ウイルス ベクター カプシドの結合された遺伝物質と化学キャプシド変更により、ポリマーをシールドと配位子をターゲットの共有結合します。システイン残基は遺伝子ベクトル粒子の新しい化学反応を装備するアデノ ウイルス ベクター カプシドの選択、溶媒露出キャプシド ループで紹介しています。ベクトルは、従来プロデューサー細胞およびプロトコルを使用して作り出すことができます。生産後、チオール反応性結合部位 (リガンド、ポリマー、炭水化物、低分子化合物、蛍光染料などをシールド) で遺伝子導入されたシステイン残基を具体的に共有変更します。カップリング、マレイミド活性化合物 (ベクトル粒子表面に安定したチオエーテル結合を形成) または pyridyldisulfide 誘導体 (形作る二硫化物橋のための生体機能) を使用できます。結合後、ベクトルは未反応の余分な結合部分を削除するようにバンディング不連続 CsCl により精製しました。ペグ、ポリエチレング リコール (シールド ポリマー);L は、配位子 (さまざまな物質のクラスから派生した);-SH、遺伝子導入されたシステイン残基のチオール機能。この技術を使用すると、ベクトル カプシドに共有結合分子の定義された数に結合できるし、結合サイトの正確な選択が可能です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ベクトル生産中に細胞変性効果。化学修飾する前に遺伝子組み換えベクターの生産の従来のプロデューサー セル (ここでは、HEK 293 細胞) を使用できます。CPE のセルを収穫する最高の timepoint を示します。(A) セル (C) 細胞 (B) 細胞感染後 24 時間、感染後 2 時間、収穫前に感染後 40 時間です。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: CsCl 勾配の模範的な結果。CsCl 勾配 (A, B) の前に、(C) 化学修飾の後。(A) アデノ ウイルスのベクトルは、不連続 CsCl 密度勾配遠心によるバンドです。上部の段階は EGFP のクマ、hCMV のプロモーターに駆動される式カセットを示すベクトルからグリーンに見えます。ベクター ウイルス粒子は、管のより低い三番目の 1 つ、白いバンドとしてバンドです。(上記参照) の 2 つのより小さいバンドは収集してはならない不完全な粒子に由来します。(B) 化学修飾する前にシステイン軸受広告の EGFP 発現ベクター。(C) 変更後同じベクトル。管のより低い三番目のバンドは収集され脱塩カラムで精製します。B と C でペンのマークはラベルを 2 つの密度の境界線と収集されるベクトル バンドの場所を識別することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 結合効率を評価するために SDS-PAGE SiIver ステンドします。1 レーンの MW のマーカー。基本、型ペントンにシステインを持つベクターを導入してヘクソンが変更されていない (2 車線) に残されたまたは 5 kDa (3 車線) の分子量のマレイミド活性化 PEG (ポリエチレング リコール) と変更されました。ヘクソンとペントン基本は、SDS-PAGE、キャプシドあたりモノマーの > 90% が正常に変更を示す中にシフトを展示します。ヘクソンのシステイン残基を持つベクトルが残っていた (4 車線) をそのまま、5 kDa ペグ (5 車線)、または 20 kDa ペグ (6 車線) を変更します。ヘクソン バンドの大きなシフトが 5 kDa ペグ (レーン 5) と比較して 20 kda ペグ、高分子量のためであることに注意してください。ゲルは、特異性およびカップリングの効率を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
効率で遺伝子導入されたシステインを化学的に変更できますが通常 80-99% と、この効率に影響を与える特定の変数。まず、それは遺伝子導入のシステインに早期酸化が行われていないことが重要です。プロデューサー細胞の還元環境で、セキュリティで保護しながら、ベクトル粒子化学修飾の間に、プロデューサー細胞を解放した後非酸化的環境を提供するためには必須です。このため、濃度 0.1 〜 10 ミリメートルで使用できる還元剤、チオール グループは、マレイミド活性化合物と容易に反応するだろうかを含まない還元試薬を使用する必要があります。第二に、マレイミド活性化合物を使用する場合カップリング反応中に pH を超えない 7.35、pH 7.4 は、反応の特異性を減らすことができるより大きいの以来。第三に、いずれの場合も、アミン無料バッファー (例えばHEPES、PBS) は、反応に使用する必要があります。注記のうち、システイン軸受ベクトル粒子はダブル CsCl として記述されていた、[HEPES/10% グリセロール化学変更前のストアド バンディングによって精製できます。この場合、0.1-1 mM TCEP がする必要があります使用される還元剤または好ましくは、ベクトルは、アルゴン雰囲気に保存すべき。蓋付きのプラスチックの容器をアルゴンガス充填は、この目的のため使用できます。さらに、修正効率は、カプシドとはつながれるサイトと結合した化合物の流体力学的直径によって影響されます。特定の geneti 化学修正のためのターゲットとして使用できる多くの型は、スチレンダイマー (繊維、ヘクソン) またはポリアクリルアミドゲル (ペントン基本) としてキャプシドに存在。したがって、遺伝子導入のシステインの位置は、によって 1種のモノマーに結合部位を有する分子は、隣接のモノマー分子の別の結合を立体妨げる可能性があります。これは、geneti 化学キャプシドの変更のための理想的なサイトを選択するとき考慮必要があります。
トラブルシューティングを容易にするには、いくつかの問題は記述されているプロトコルに従うときに生じる。プロデューサー細胞の準の伝染から (以下プロデューサー セルあたり 10,000 ベクトル粒子) ベクターで最初に低収量があります。理想的には、プロデューサーの細胞の感染 100 300 MOI を使用ください。接種の両方の高すぎるとあまりにも低ベクトル量が最適な収率を生成することに注意してください。プロデューサー細胞感染前日通路に最適です。CsCl の勾配で 2 番目、べたつくのバンドが表示されます。CsCl の勾配でバンドのべたつく出現の最も頻繁な理由は、CsCl ソリューションの pH があまりにも酸性です。還元剤 TCEP は非常に酸性、アデノウイルスベクターは酸性の環境で容易に崩壊するので、グラデーションにベクトルをロードする前に pH を調整には注意が必要があります。第三に、低結合効率 (カップリングの < 80%)、不純なベクトルの準備の最も頻繁な結果またはベクトル表面上のチオール グループの早期酸化です。不純物は、SDS-PAGE と銀染色により検出できます。重要な不純物が発生する場合は、ベクトル生産を再起動してください。さらに、低結合効率は無料の非ベクトル チオール反応によって引き起こされることができます。したがって、還元剤、無料のチオール グループが含まれる両方として β-メルカプトエタノールやジチオトレイトールを使用しないことが勧めします。ノートでは、容易に変更することができます、システイン残基を導入する溶剤がアクセス可能なサイトを選択するの結晶構造を使用する必要があります;それ以外の場合、システイン結合パートナーにアクセスできない場合があります。ベクトル表面にチオールの早期酸化は、アルゴンまたは TCEP の厳格な使用によって回避できます。
最後に、化学量論的計算に誤りは、低結合効率につながることができます。次の例は、上に示した一般的な式を説明し、化学量論的計算を容易にするものです。例では、1 つのシステインはヘクソン capsomere に導入されました。最初 CsCl ステップ グラデーション浄化後のベクトル粒子の力価は、malPEG 750 を使用 1.5 × μ L、あたり 1010ベクトル粒子と結合部位が決定されます。各ベクトル キャプシド 720 ヘクソン蛋白質 (240 スチレンダイマー)、720 x 1.5 x 10 μ L あたりシステインの力価の和にしたがってよう10 1013システイン/μ L × 1.08 を =。ベクトル粒子、1.62 x 10 の合計の 1.5 mL を変更するために16システインは結合部位と反応する必要があります。効率的なカップリングは、カップリングのシステイン残基の合計に化合物のモル過剰 x 50 お勧め: 1.62 x 1016 50 = 8.1 x 10 x17分子 malPEG 750 のカップルの 1016システイン x 1.5 に効率的にする必要があります。最初の CsCl のステップのグラデーションにより精製したベクトル溶液 1.5 mL。MalPEG 750 750 Da の分子量の展示します。したがって、malPEG 750 1023分子 x 6.022 750 g の重量を量る。したがって、16システイン残基が 10 malPEG-750、750 malPEG 1017分子 x 8.1 の 50 x 過剰なベクトル溶液 1.5 mL x 1.62 の高効率結合の = (750 × 8.1 × 1017)/(6,022 x 1023) = 1 x 10-3g = 1 mg malPEG 750 が必要。
提案手法を補足し、ベクトル peg 修飾操作法を超えています。従来、アミン指示ベクトル peg 修飾操作できませんのシールドや、鎖をターゲット サイト固有の添付ファイルに対して、アデノ ウイルスのベクトルに鎖を正確に付ける紹介 geneti 化学結合技術を使用できます。定義された位置で、定義されているコピー番号の表面。したがって、シールドとアデノ ウイルスのベクトル粒子のターゲットの両方に適しています。
このプロトコルは、注記のうちを従来アミン監督 peg 修飾操作上記広告ベクトルのため使用できます。その場合は、バッファーから還元試薬 TCEP を省略できます。化学量論的計算に粒子ごとにアクセス可能なアミン グループの数は、18,000 と考えることが、アミン反応性結合基の典型的なモルの行き過ぎは 20-100 倍。
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Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
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