Summary
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים במיוחד לשנות capsids אדנו-אתרים נבחרים על-ידי כימיה פשוטה. אדנו מסוככים את המומנט חלקיקים וקטורים העברת גנים retargeted יכול להיווצר ו החרקי המארח יכול להילמד.
Abstract
אדנו וקטורים הם כלי חזק virotherapy חיסון, oncolytic גנטית. עם זאת, הם נוטים אינטראקציות מרובות וקטור רצויה-מארח, במיוחד לאחר הלידה ויוו . זה קונצנזוס כי המגבלות שהוטלו על ידי אינטראקציות וקטור רצויה-המארח יכול רק להתגבר אם מתבצעים שינויים מוגדר של המשטח וקטור. שינויים אלה כוללים מיגון של החלקיקים של אינטראקציות בלתי רצויים פילוח לפי המבוא של ליגנדים חדש. המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא לאפשר לקורא להפיק ממוגן, אם רצונך בכך, retargeted וקטורים העברת גנים אדנו אנושי או וירוסים oncolytic. הפרוטוקול יאפשר לחוקרים לשנות את פני השטח של capsids וקטור אדנו על-ידי מצורף כימי מסוים של פולימרים סינתטיים, פחמימות, שומנים או אחרים moieties ביולוגי או כימי. היא מתארת את טכנולוגיה חדשנית של שינויים capsid גנטי וכימי משולב, אשר הוכחו כדי להקל על ההבנה, התגברות על מחסומים עבור משלוח ויוו אדנו וקטורים. תיאור מפורט של תגובות של צעדים חיוניים לביצוע תגובות כימיות ספציפיות עם וירוסים פעילים ביולוגית או וירוס-derived וקטורים מסופק. הטכנולוגיה שמתואר הפרוטוקול מבוסס על המבוא גנטי של ציסטאין (נעדר באופן טבעי) שאריות לתוך החשופים הממס לולאות של אדנו-derived וקטורים. אלה שאריות ציסטאין לספק כימיים תגובתיות ספציפי, זה יכול, לאחר הייצור של הווקטורים כדי titers גבוהה, תנוצל ספציפי מאוד ויעיל צימוד כימי קוולנטיות של מולקולות מתוך מגוון רחב של מחלקות חומר כדי וקטור חלקיקי. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים לבצע מגוון רחב של שונות (שאינה תיול מבוססת) שינויים כימיים של וקטור אדנו capsids. בסופו של דבר, זה סביר וקטורים העברה הזה שאינו אפוף ג'ין מבוסס-וירוס אחר ממה אדנו ניתן לשנות מן הבסיס של פרוטוקול זה.
Introduction
Adenoviruses (Ad), בני משפחת Adenoviridae, הם שאינו אפוף וירוסי דנ א של יותר מ-70 סוגים אשר עד כה מזוהה (http://hadvwg.gmu.edu). בהתאם hemaglutination מאפיינים, מבנה הגנום ותוצאות רצף, ניתן לחלק את סוגי 70 לספירה שבעת המינים (האנושית adenoviruses A עד G)1,2. הגנום האנושי מודעה בגודל של 38 kb, כמוס icosahedral nucleocapsid3. בשל שפע שלהם, capsid חלבון קללה, זה בסיס פנטון, סיבים כל מכונים capsid הגדולות חלבונים. שופע והגדול ביותר capsid חלבון קללה, זה יוצר היבטים capsid 20, שכל אחד מהם מורכב של 12 קללה, זה homotrimers4,5. פנטון, הממוקם בקצה כל icosahedral (קודקוד), מורכב pentamers של הבסיס פנטון ומייצג את הבסיס טינה קודקוד הבנוי של glycosylated סיב trimers5,6. ערך מקורי של תא לספירה מורכב בעצם שני שלבים עיקריים. ראשית, הידית סיבים נקשר לקולטן העיקרי. המודעה סוגי זנים A, C, E ו- F, זהו הקולטן coxsackie, אדנו (מכונית). אינטראקציה זו מביא את virion לתוך קרבה מרחבית את פני השטח של התא, ובכך להקל על אינטראקציות בין הסלולר אינטגרינים מוטיב RGD פנטון הבסיס, כתוצאה מכך גרימת תגובות הסלולר. שנית, להוביל לשינויים שלד התא הפנמה של virion ושל התחבורה ביותר אנדוזום7. בעת פירוק חלקי ב אנדוזום, virion הוא שוחרר אל הציטופלסמה und בסופו של דבר עובר את הגרעין לצורך שכפול.
בעוד המודעה יכולה להיות מועברת באופן מקומי (למשל., לקבלת חיסון גנטי), מערכתי משלוח דרך מחזור הדם כנדרש על onco-virotherapy פונה מספר מחסומים. בעוד במחזור הדם, virions מוזרק נתקלים מערכת ההגנה של מערכת החיסון של המחשב המארח, שמוביל נטרול מהיר של הווקטורים מבוסס-וירוס ובעיבוד וקטורים המבוסס על המודעה יעיל מאוד ביישומים מערכתית. יתר על כן, hepatotropism הטבעית של Ad מפריע משלוח מערכתית, חייבות להיפתר לנתב מחדש המודעה שלה התאים היעד החדש.
מקודד Germline נוגדנים IgM הטבעית של מערכת החיסון המולדת במהירות מזהה, לאגד מבנים מאוד חוזרות על פני8,virion9. אלה מכלולי המערכת החיסונית ואז להפעיל את המסלולים קלאסית וקלאסי של מערכת המשלים, שמוביל מהר המשלים בתיווך ניטרול של חלק גדול virions8. שביל השנייה וכתוצאה מכך הסרת העיקריים של Ad virions מתווכת על-ידי מקרופאגים10 , המשויך חריפה ולא הקרדיאלי תופעות לוואי11,12. במקרה של המודעה בפרט, Kupffer תאים המתגוררים הכבד לאגד ולהתחיל phagocytically Ad virions ויה נבלות ספציפי הקולטנים, ובכך לחסל אותם מן הדם13,14,15 . קולטנים ספציפיים נבלות גם זוהו תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSE תאים)16, ונראה LSE תאים גם תורמת וקטורית חיסול17, אלא באיזו מידה עדיין צריך הבהרה. יתר על כן, חלק מסוגי לספירה ווקטורים נגזר שלהם הם ביעילות מבודדות על ידי האדם אריתרוציטים18 שאליו הם לוחצים באמצעות מכונית או הקולטן המשלים CR119. ראוי לציין, מנגנון sequestering זה לא ניתן לחקור במערכת מודל העכבר כמו בניגוד אריתרוציטים אנושי, אריתרוציטים העכבר לא מבטא את המכונית.
נוגדנים ספציפיים נגד לספירה שנוצר על ידי מערכת החיסון מסתגלת לאחר חשיפה לספירה עקב זיהומים הקודם עם המודעה או או לאחר המשלוח הראשון ביישומים מערכתית הרימו מכשול נוסף לשימוש יעיל של וקטורים לספירה, הם צריכים להיות התחמק ב משלוח מערכתית יעילה.
לבסוף, hepatotropism חזק המודעה בסוגים מסוימים (כולל Ad5) קשות מעכבת היישום של המודעה בטיפול מערכתי. זה tropism וכתוצאה מכך hepatocyte התמרה חושית הוא בזיקה גבוהה של virion המודעה כדי דם קרישה פקטור X (FX), מתווכת על ידי האינטראקציה של FX עם Ad קללה, זה חלבון20,21,22. FX מגשרת את virion כדי הפרין סולפאט glycans (HSPGs) על פני hepatocytes20,23,24,25. גורם מכריע עבור אינטראקציה זו נראה במידה מסוימת של N -, O-sulfation של HSPGs תאי כבד24, אשר היא נבדלת HSPGs על סוגי תאים אחרים. בנוסף מסלול זה בתיווך FX, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים עוד יותר מסלולים עדיין לא זיהו כי התוצאה ב- Ad התמרה חושית של hepatocytes26,27,28.
לאחרונה, הוכח כי FX לא רק מעורב hepatocyte התמרה חושית של Ad, אך גם על-ידי איגוד, שילדס virion החלקיק וירוס נגד ניטרול על ידי מערכת המשלים26. הפחתה של התמרה חושית hepatocyte על-ידי מניעת איגוד FX, לכן, ליצור תופעת לוואי בלתי רצויות של הגדלת לספירה ניטרול באמצעות מערכת החיסון המולדת.
ידיעה עמוקה של אינטראקציות מורכבות בין וקטורים ואורגניזמים מארח ולכן יש צורך לפתח וקטורים יעיל יותר עבור יישומים מערכתית לעקוף את המכשולים שהוטלו על ידי האורגניזם של המחשב המארח.
אסטרטגיה אחת שבה השתמשו במקור חלבונים טיפולית כבר מותאם לספירה וקטורים לפחות חלקית להתגבר על המחסומים שתואר לעיל. Antigenicity ו- immunogenicity של תרכובות טיפולית חלבון יכול להיות מופחת על ידי צימוד כדי פוליאתילן גליקול (PEG)29,30. לפיכך, המושבים קוולנטיות של פולימרים כגון פג או פולי [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) כדי capsid השטח ומגנים הווקטור של אינטראקציות וקטור לא רצויים-המארח. בדרך כלל, פולימר צימוד מטרות חדוה-אמין קבוצות מכל שאריות בצד ליזין המופצים באופן אקראי על פני capsid. וקטור חלקיקים בתמיסה, בשל אופיו הידרופילית משושמים המצורפת, מוקפים פגז מים יציבים זה מפחית את הסיכון של תאים חיסוניים הכרה או השפלה אנזימטיות. יתר על כן, וקטורים PEGylated לספירה הוצגו להתחמק ניטרול באמצעות אנטי-קללה, זה נוגדנים במבחנה , עכברים מראש לחסן ויוו31. בניגוד שינויים גנטיים capsid, צימוד כימי של פולימרים מתבצע לאחר ייצור, טיהור, ומאפשר לא רק לשימוש של מפיק קונבנציונאלי תאים וייצור של מניות וקטור כייל נוגדנים גבוה, אלא גם עבור בו זמנית שינוי של אלפי חומצות אמינו על פני capsid. עם זאת, מכוון amine מיגון מתרחשת באופן אקראי לאורך כל השטח capsid כולו, וכתוצאה מכך heterogeneities גבוהה, לא מאפשר שינוי של capsomers ספציפיים. יתר על כן, moieties פולימר גדול הדרושים עבור השפעות מועילות לפגום וירוס אתריים32.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, Kreppel et al. 33 הציג תפיסה geneti-כימית עבור וקטור re - ואני מבטל את המיקוד. Cysteines שהוכנסו גנטית capsid וירוס החשופים הממס ומעמדות כמו סיבים HI-לולאה33, חלבון התשיעי34, קללה, זה35,36. אמנם יכול להיות מיוצר לא-טבעי, ציסטאין מניבי וקטורים Ad-titers גבוהה בתאים נורמליים הפקה. חשוב, החדרת cysteines capsomers מסוימים, עמדות שונות בתוך capsomer יחיד מאפשר שינויים ספציפי מאוד של תיול moieties קבוצה ראקטיבית. גישה geneti-כימית זו הוכח כדי להתגבר על מכשולים רבים בעיצוב וקטור לספירה. השילוב של מבוסס-אמין PEGylation detargeting, המבוסס על תיול זיווג transferrin על הידית סיבים ש-HI-לולאה הוכח כדי בהצלחה ייעד מחדש ששינה לספירה וקטורים חשוכת-הרכב התאים33. מאז קללה, זה מעורב אינטראקציות בלתי רצויה ביותר (נטרול נוגדנים, הגורם דם FX), המבוסס על תיול שינוי אסטרטגיות הוחלו גם על קללה, זה. צימוד moieties פג קטן כדי HVR5 של קללה, זה מנע חלקיקי וקטור לספירה מגלי SKOV-3 תאים בנוכחות FX, ואילו moieties פג גדול גדל hepatocyte-התמרה חושית-14,-35. המודעה וקטור חלקיקים נשיאת מוטציות בהידית סיבים עיכוב רכב מחייב וב -HVR7 מעכבים קשירה של FX (ו cysteines ברינג שנוספו ב- HVR1 עבור מיקום ספציפי PEGylation) הראו להם להתחמק נוגדן, המשלים-בתיווך ניטרול, כמו גם נבלות קולטן בתיווך ספיגת ללא הפסד של infectivity. מעניין, למרות חוסר המגן FX טבעי, PEGylation שוב שיפור התמרה חושית של hepatocytes כפונקציה של גודל פג36. עם זאת, זה הוצג כי מיגון קוולנטיות יש השפעה על תהליכים תאיים לסחר בבני אדם. Prill et al. לעומת בלתי הפיכות נגד bioresponsive מגינים על סמך pHPMA והפגינו כי גם את מצב תשלום מיגון ולא שותף פולימר הייתה השפעה על כניסת התא אך השפיעה חלקיקים סחר את הגרעין. העסקת מגן bioresponsive עם pHPMA הטעון חיובית פולימרים שיתוף המותר עבור חלקיקים סחר את הגרעין, שמירה על חיסכון התמרה חושית גבוהה של המודעה המומנט במבחנה , ויוו37.
לסיכום, נתונים אלה מציינים כי, אפילו תחת ההנחה כי כל וקטור-מארח-האינטראקציות היו ידועים ונחשבים, שינויים משטח capsid מופרז חיוניים להתגבר על המכשולים הקשורים עם משלוח וקטור מערכתית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לבצע שינויים כימיים בייעודי לאתר של capsids וקטור אדנו מיגון ו/או retargeting של חלקיקים וקטור אדנו ווירוסים oncolytic המבוסס על אדנו. הרעיון של טכנולוגיה זו מחולקת לרמות באיור1. היא מאפשרת מיגון של אזורים מסוימים capsid של אינטראקציות בלתי רצויות על ידי קוולנטיות מצורף של פולימרים סינתטיים. באותו, הוא גם מספק אמצעי כדי לצרף ליגנדים ולשלב הגנה ומיקוד. באמצעות כימיה פשוטה, ניסויים תהיה אפשרות לשינוי covalently משטח וקטור אדנו עם מגוון רחב של מולקולות כולל פפטידים/חלבונים, פחמימות, שומנים, ומולקולות קטנות אחרות. יתר על כן, הפרוטוקול מספק קונספט כללי שינוי כימי של וקטורים נגזר וירוס פעילים ביולוגית תחזוקה של שלמות הביולוגי שלהם פעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בחלק זה, עבור geneti-כימית PEGylation של מודעה וקטור מתואר לפרטים פרוטוקול. כדי לאפשר זיווג מסוים moiety פג, וקטור Ad5 היה מראש גנטית שונה על-ידי היכרות עם משקע ציסטאין לתוך החלבון קללה, זה על הלולאה hypervariable 5 כפי שמתואר הפרסום הקודם36, יתד הופעל-maleimide המתחם משמש צימוד מורכב.
1. הכנה של מאגרי טיהור וקטור על ידי מעברי צבע שלב CsCL
- להכין 400 מ של מאגר אדנו (Ad-מאגר) על-ידי הוספת 50 מ מ HEPES (4.76 g של 400 מ"ל) ו- 150 מ מ NaCl (3.504 g של 400 מ"ל) מים מזוקק פעמיים (ddH2O). 350 מ של מאגר זה יש צורך להכין על גרסאות Ad-buffer שלוש הבאות.
- ת: משתנה התאם 150 מ ל Ad-מאגר ל pH 7.6 עם NaOH.
- חלופה ב': להוסיף ריכוז סופי של 10 מ מ TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] 50 מ ל ולהתאים אותו ל pH 7.2 עם HCl.
- C: משתנה ריכוז סופי של 0.5 מ מ TCEP (0.022 גרם) להוסיף 150 מ וכוונן אותו ל pH 7.2 עם HCl.
- להכין המאגרים ddH2O וכימיקלים אנליטית כיתה. השתמש 100 מ ל כל אחד של variant A, משתנה C כדי להכין המאגרים CsCl (ראה שלבים 1.2, 1.3; 50 מ ל כל אחד) הכרחי עבור מעברי הצבע שלב CsCl (ראה שלבים 3.2.6. ואת 3.2.18).
- הכנת המאגר הדרגתי של שלב CsCl (ρCsCl = 1.41 g/ס מ3) במאגר-Ad
הערה: מאגר זה יהיה צורך שתי וריאציות שונות:- שוקל aliquots שני של בדיוק 27.42 g של CsCl לתוך צינורות 50 מ.
- ΡCsCl = מאגר 1.41/TCEP: לפתור CsCl ב 40 מ של variant ג' הפרסומת-מאגר.
- ΡCsCl = מאגר 1.41: לפתור CsCl ב 40 מ של גרסה א' של Ad-buffer.
- בדוק, במידת הצורך, התאם את ה-pH עם HCl. מלא עד בדיוק 50 מ עם הווריאציה Ad-buffer המתאימים. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של הפרדה, מכריעים ריכוז CsCl המדויק ו- pH.
- לבדוק את הצפיפות (תוכן CsCl) במשקל של 1 מ"ל (1.41 g) כל מאגר הדרגתיות.
- הכנת המאגר הדרגתי של שלב CsCl (ρCsCl = 1.27 g/ס מ3) במאגר-Ad
הערה: מאגר זה הכרחי שתי וריאציות שונות:- שוקל aliquots שני של בדיוק 18.46 g של CsCl צינורות 50 מ.
- ΡCsCl = מאגר 1.27/TCEP: לפתור CsCl ב 40 מ של variant ג' הפרסומת-מאגר.
- ΡCsCl = מאגר 1.27: לפתור CsCl ב 40 מ של גרסה א' של Ad-buffer.
- בדוק, במידת הצורך, התאם את ה-pH עם HCl. לבסוף, למלא עד בדיוק 50 מ עם הווריאציה Ad-buffer המתאימים. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של הפרדה, מכריעים ריכוז CsCl המדויק ו- pH.
- לבדוק את הצפיפות (תוכן CsCl) במשקל של 1 מ"ל (1.27 g) כל מאגר הדרגתיות.
- לעקר כל מאגרי (Ad-buffers ו- CsCl שלב מעבר צבע מאגרים) על-ידי סינון (באמצעות מיקרומטר 0.45 רשת שינוי גודל הנקבוביות) לתוך בקבוקים סטרילי.
- לאחר עיקור, כדי למנוע חמצון של TCEP, עיתוני, כיסוי המאגרים המכילה TCEP עם ארגון על-ידי sparging המאגרים בגז ארגון כ 30 s. לטפל רק להשתמש בהתקנים סטרילי (למשל., סטרילי פיפטה טיפים) בשעת החלת על גז ארגון, וכן שימוש בקבוקים גדול מספיק כדי לאפשר לדג ארגון.
הערה: כל מאגרי צריך להיות מוכן טרי ומוגן בפני אור, ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים (במיוחד CsCl צעד מעבר צבע מאגרי צריך לשמור רק לכמה ימים).
2. צימוד Moieties: אחסון והכנה
הערה: Moeities משמש כדי cysteines להשתלב עליך לשאת קבוצות תיול-ריאקטיבי. תרכובות Maleimide מופעל יהוו חוב thioether יציב עם cysteines גנטית הציג. לחלופין, אורתופדיה-pyridyldisulfide (OPSS)-תרכובות מופעל יכול לשמש, המהווים bioresponsive דיסולפידי גשרים בין חלקיקים וקטור צימוד moiety. MalPEG lyophilized-750, כמו גם רוב ריאגנטים צימוד אחרים רגישים הידרוליזה ויש לאחסנו יבש בצורה של אבקות lyophilized ב-80 מעלות צלזיוס.
- כדי למנוע הצטברות של עיבוי מים על הפשרתו של הבקבוקונים, לאחסן את הבקבוקונים צינורות גדולים יותר (למשל., צינורות 50 מ ל) מלא כרית של חרוזים סיליקה ג'ל. מאחסנים צינורות אלה במיכל גדול יותר נאותה גם מלא כרית סיליקה ג'ל חרוז.
- לפני סגירת בחוזקה כל שפופרת, מיכל, חילופי אוויר עם גז ארגון. זו יכולה להיות מושגת על ידי הצבת מכולות שפופרות פתוח לתוך desiccator, ואחריו הסרה והחלפה האוויר בגז ארגון. מאז גז ארגון הוא כבד יותר, צינורות, מכולות מלאה בגז ארגון, כעת ניתן להציב לתוך אחד את השני, עם כל מכסה השמן סגור היטב.
- לאחסן מכולות ב-80 מעלות צלזיוס.
- כשהוא מפשיר, למקם את המכולות על גבי חרוזים סיליקה desiccator לאט לחממן עד לטמפרטורת החדר ואז לפתוח את המיכל.
- בעת ביצוע תגובה צימוד, טרי לפתור את כמות צימוד המצע צריך לתוך הממיס המתאים. הקפידו לא להוסיף יותר מ-10% מצמד פתרון כדי התגובה צימוד הסופי, בייחוד אם DMF או דימתיל סולפוקסיד משמש הממיס המצע צימוד.
3. הגברה, טיהור, שינוי כימי של וקטורים לספירה:
- הגברה של וקטורים לספירה
הערה: השלבים הבאים חייב להתבצע באמצעות ארון בטיחות על פי כללי הבטיחות הביולוגי המקומי.- Transfect ∆E1 לקוי שכפול Ad וקטור המכיל residue(s) ציסטאין גנטית הציג אחד (או כמה) לתוך תאים HEK 293 כפי שתואר על ידי Kratzer ו- Kreppel38.
- על פי פרוטוקול38, להגביר את הווקטור מאת reinfections סדרתית עד זיהום מפוח הסופי של 15-20 גדולים (15 ס מ) תא תרבות צלחות (כ 1-2 x 107 תאים/צלחת).
הערה: בצורה אופטימלית, שמנצלת האחרון צריך להיות מתוזמן כך התאים להראות מלא ציטופתי (CPE) בבוקרו של ביצועים לטיהור ושינוי (ראה איור 2). - לאחר השלב הסופי הגברה, תאים resuspended לספירה מאגר + 10 מ מ TCEP (גרסה ב') שיכול להיות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס; עם זאת, עבור תשואה אופטימלית של וקטור חלקיקים, מומלץ של מעקב מיידי של פירוק התא וטיהור וקטור ושינויים.
- שינוי כימי וטיהור של וקטורים לספירה
הערה: טיהור של וקטורים מתבצע לפי הפרוטוקול טיהור אדנו המתואר38אבל בתנאים שאינם מחמצן. תא קציר והמסה כמו גם וקטור טיהור וכימיקלים השינוי יכול להתבצע תוך יום אחד. הקציר ואת lyse התאים הנגועים לפי הפרוטוקול כפי שתוארה לעיל38.- לאסוף תאים על ידי גירוד לוחיות הרישוי העברת את תגובת שיקוע צינורות צנטריפוגה 200-500 מ.
- ספין הפתרון תא 10 דקות ב 400 x g.
- Resuspend בגדר תא מ ל 4 לספירה-מאגר + 10 מ מ TCEP (pH 7.2) (גרסה ב'), העברת צינור סטרילי 50 מ. אם התא תשואה נמוכה או רק CPE חלש הייתה בהשפעת, resuspend זה ב 2 מ"ל.
- להציל את הווקטור על ידי 3 מחזורים של קפוא (חנקן נוזלי) לבין הפשרת (בתוך אמבט מים 37 ° C).
- ספין 10 דקות ב-5000 g x ב 4 º C.
- בזמן, צריך שתוציאו להכין שתי שוות CsCl שלב מעברי צבע:
- ראשית, בתור שלב תחתון, להוסיף 3 מ"ל של ρCsCl3 1.41 g/cm ב Ad-buffer + 0.5 מ מ TCEP (pH 7.2, משתנה C) לתוך הצינורות ultracentrifuge. לסמן את רמת השלב התחתון ברכבת התחתית לפני טעינת השלב העליון.
- בזהירות מחסנית השלב העליון של 5 מ של 1.27 ρCsCl g/cm3 Ad-buffer + 0.5 מ מ TCEP (pH 7.2, משתנה C) על ידי לאט לאט pipetting את עוצמת הקול של 5 מ"ל לאורך דפנות הצינור אל השלב התחתון.
הערה: מאז במהלך צימוד ריכוז גבוה של TCEP יכול להגיב עם השאריות maleimide malPEG-750, להוביל צימוד מופחתת יעילות, טיהור מאת CsCl שלב מעבר צבע צריך לבצע כבר תחת ריכוז TCEP מופחת.
- לטעון את תגובת שיקוע על גבי המילוי ההדרגתי CsCl [גם במידה שווה לחלק את תגובת שיקוע על גבי שני מעברי צבע או, במקרה של תשואה נמוכה וקטור (ראה לעיל), לטעון את תגובת שיקוע על עמודה אחת בלבד], ומלא שני מעברי צבע באותה מידה לפסגה עם מאגר לספירה + 10 מ מ TCEP (pH 7 .2, משתנה B).
- להתאים את המשקל של הצינורות ההפוך כדי הבדל משקל 0.0 g.
- Ultracentrifuge עבור 2 h ב g x 176,000 ב 4 º C.
- עם מלחציים, לתקן את הצינור ultracentrifugation אל דוכן, עזיבת האזור מסביב לסימן שלב ברמה נמוכה יותר נגיש. מקם את המנורה מתכווננת מעל הצינורית. מסביב לסימן, בגבול שבין השלבים העליון והתחתון, להקה ברורים (virions וקטור) צריך להיות גלוי (איור 3 אג-3).
- לאסוף את הווקטורים ניקב את הצינור עם מחט, השואף הלהקה וקטור לתוך מזרק. העברה וקטור שנאספו virions צינור 15 מ"ל.
הערה: להקות חלש יותר מעל הלהקה וקטור לספירה מכילים חלקיקים וקטור לא שלם, יש להימנע עבור השאיפה. שאריות תאים וירוק חלבון פלואורסצנטי (EGFP) של ביטוי EGFP Ad-וקטורים תאסוף בחלק העליון של ultracentrifuge צינור (ראה איור 3A ו- 3B). זה, השלבים הבאים עד מצמד (שלב 3.2.16) צריכה להתבצע במהירות, כמו הווקטורים עכשיו נבונה דיסולפידי מליטה בשל הריכוז הנמוך ביותר TCEP. - כדי לחשב את כמות המצע צימוד לצורך איגוד מלאה יעיל של המצע את כל שאריות ציסטאין בהכנת וקטור, למדוד OD260:
- על פי הפרוטוקול המתואר על ידי Kratzer ו- Kreppel38, מערבולת תערובת של 10 µL של virions וקטור שנאספו, µL 89 מאגר Ad µL 1 של 10% מרחביות. בדיקה ריק, מערבולת 99 µL Ad-מאגר ו- 1 µL של 10% מרחביות.
- כדי denature את virions, דגירה שניהם ב 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לקבוע OD260.
- לחשב את כייל וקטור פיזית לכל µL באמצעות המשוואה הבאה: OD260 x פקטור של דילול x מקדם נחוש מדעית להכחדה של המודעה (1.1 x 10 חלקיקים וקטור9 = 1 OD260 יחידות/µL). לכן, יתר נמדד260 של 1.36 של הווקטור מדולל 1:10, לחשב את: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = כ 1.5 x10 וקטור 10 חלקיקים/µL.
הערה: כייל הזה הוא רק הערכה גסה; עם זאת, מדויקת מספיק לחישובי stoichiometric המפורטות להלן.
- בהתאם החלבון השתנה על-ידי החדרת ציסטאין, לקבוע את כמות המצע צימוד (בגרמים) לתגובה צימוד יעילה, על פי המשוואה הכללית הבאה: כייל נוגדנים וירוס x נפח x מספר cysteines x עודף של moiety x מולקולרית משקל moiety / 6,022 x 1023 = גרם של צימוד המצע.
הערה: במשוואה: 1) וירוס כייל כייל/µL, נקבע על ידי OD260 כפי שתוארה לעיל, 2) נפח חשבונות עבור אמצעי האחסון ב- µL של דידו וקטור בשימוש התגובה צימוד, 3) מספר cysteines הוא מספר חלבונים אשר לתוכו ציסטאין שאריות הוצג לכל וקטור חלקיקים, 4) עודף של moiety היא הגורם של הדרושות עודף moiety לתגובה צימוד יעיל (50 x), ו- 5) חייב להיות הציג את המשקל המולקולרי של moiety דה (לא kDa). - טרי לפתור את הכמות של המתחם (או סכום ריאלי) הדרושים הממיס המתאים.
הערה: כמו מידת צימוד המצע צריך הוא נמוך, קשה לשקול אך יקר, לשקול את כמות מינימלית של תרכובת האפשר, להמיס בריכוז המתאים ליישום צימוד הריאקציה. - להעביר את הפתרון וקטור צינור בגודל המתאים (למשל, צינור 2 מ"ל), להוסיף את הכמות מחושבת מצמד פתרון מניות מתחם כדי וקטור.
- מערבבים בעדינות את הפתרון על-ידי סיבוב עילי לשעה בטמפרטורת החדר.
- למלא את הפתרון וקטור הנפח הכולל 6 מ עם Ad-buffer (pH 7.6, משתנה A).
הערה: שלב זה חייב להתבצע לפני הפתרון חל מעבר הצבע צעד כדי להבטיח כי הפתרון וקטור, אשר עדיין מכיל CsCl של מעבר הצבע בשלב הראשון, יש צפיפות מתחת 1.27 g/mL. - בשלב השני CsCl סימון, לטהר את הווקטור של moiety צימוד unreacted:
- להכין שתי שוות CsCl שלב מעברי צבע על-ידי ביצוע הפעולות הבאות עבור כל: שלב 1) התחתון: 3 מ"ל של 1.41 g/cm ρCsCl3 לספירה-מאגר (pH 7.6, משתנה A), 2) לסמן ברמה של שלב תחתון ברכבת התחתית לפני טעינת שלב העליון ולאחר שלב 3) העליון : 5 מ של 1.27 גרם/ס"מ ρCsCl3 לספירה-מאגר (pH 7.6, משתנה A).
הערה: לאחר צימוד התרחש, מאגרי ללא TCEP משמשים, אין קבוצות תיול חינם עכשיו צריך להיות נוכח על capsids וקטור. - לטעון את תגובת שיקוע על גבי המילוי ההדרגתי CsCl ומלא שני מעברי צבע באותה מידה לפסגה עם Ad-buffer (pH 7.6, משתנה A).
- להתאים את המשקולות של הצינורות ההפוך כדי הבדל משקל 0.0 g.
- להכין שתי שוות CsCl שלב מעברי צבע על-ידי ביצוע הפעולות הבאות עבור כל: שלב 1) התחתון: 3 מ"ל של 1.41 g/cm ρCsCl3 לספירה-מאגר (pH 7.6, משתנה A), 2) לסמן ברמה של שלב תחתון ברכבת התחתית לפני טעינת שלב העליון ולאחר שלב 3) העליון : 5 מ של 1.27 גרם/ס"מ ρCsCl3 לספירה-מאגר (pH 7.6, משתנה A).
- Ultracentrifuge עבור 2 h ב g x 176,000 ב 4 º C.
- זמן קצר לפני סוף ultracentrifugation, equilibrate עמודה PD-10 5 פעמים עם 5 מ של Ad-buffer (pH 7.6, משתנה A).
- כפי שנעשה צעד 3.2.10, לתקן את הצינור ultracentrifugation לעמוד עוזב את האזור מסביב לסימן שלב ברמה נמוכה יותר נגיש. מקם את המנורה מתכווננת מעל הצינורית. שוב, סביב הגבול בין השלבים העליון והתחתון, להקה ברורים (virions וקטור) צריך להיות גלוי (איור 3C).
- לאסוף את הווקטורים על ידי ניקב את הצינור עם מחט השואף הלהקה וקטור לתוך מזרק, ולהעביר את הווקטור צינור 15 מ"ל. לטפל כדי לאסוף את virions של שני צינורות הדרגתיות יחד כמו הנפח הכולל 2.5 מ ל או פחות. אם אמצעי אחסון קטן יותר נאסף, מלא כדי להשיג את הנפח הכולל 2.5 מ עם מאגר לספירה (גרסה א').
- לטעון את 2.5 מ אל העמודה-PD equilibrated. למחוק את הזרימה דרך.
- להוסיף 3 מ"ל של מאגר לספירה (גרסה א') אל העמודה ולאסוף את הזרימה דרך (המכיל את virions וקטור מטוהרים).
- הוסף גליצרול (333 µL) בריכוז הסופי של 10%, לחלק aliquots מתאים (למשל, 400 µL כל), כוללים של aliquot של µL 20 לקביעת כייל נוגדנים על ידי מדידה260 OD.
- חנות הפתרון וקטור ב- 80 ° c
- לקבוע את כייל של וקטור על ידי מדידת OD260 של פתרון וקטור µL 20, µL 79 לספירה-מאגר (גרסה א') µL 1 10% למען חברה דמוקרטית כפי שמתואר בשלב ' ן 3.2.12. ריקים, להשתמש µL 79 לספירה-מאגר (גרסה א'), µL 10 של 10% גליצרול, 1 µL של 10% מרחביות.
- לחשב את וקטור כייל כמו: OD260 x פקטור של דילול x 1.1 x9 וקטור 10 חלקיקים/µL.
כפי שהוכנו בשלב 3.2.27, לחשב: OD260 x 5 x 1.1 x9 וקטור 10 חלקיקים/µL
4. אימות של צימוד על ידי מרחביות-דף:
הערה: אם נעשה שימוש תרכובות עם משקולות מולקולרית גבוהה מספיק כדי virions לספירה להשתלב, צימוד ניתנת לאימות כמקורית לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). זוגיות מוצלחת ואז יביא משמרת של הלהקה חלבון התואם החלבון virion לספירה ששונה, בהשוואה להחלבון של virion שלא שונתה המודעה (ראה איור 4).
- לפי כייל נוגדנים מחושב של וקטור (שלב 3.2.28), הפרד בין 1-2 x 10 חלקיקים וקטור10 מאת מרחביות-דף (8%).
- לפתח את הג'ל על-ידי מכתים כסף של ג'ל39 לגילוי חלבון חלש אפילו להקות:
- להכין מאגרי צביעת כסף (הסכומים הדרושים עבור 100 מ של מאגר מסומנים בסוגריים):
- הכנת מאגר 1 על ידי ערבוב מ 38 ל- ddH2O, 50% MeOH (50 מ"ל של 100 MeOH), 12% AcOH (12 מ ל 100% AcOH), ו 0.0185% HCHO (µL 50 של 37% HCHO).
- הכנת מאגר 2 על-ידי הוספת 50% EtOH (50 מ של 100% EtOH) 50 מ של ddH2O.
- הכנת מאגר 3 על-ידי הוספת 0.127 g/L נה2S2O3 (מ ג 12.744) עד 100 מ"ל של ddH2O.
- הכנת מאגר 4 על-ידי הוספת 2 g/L AgNO3 (0.2 גרם) ו- 0.0185% HCHO (µL 50 של 37% HCHO) עד 100 מ"ל של ddH2O.
- הכנת מאגר 5 על-ידי הוספת 60 g/L נה2CO3 (6 גרם), 0.0185% HCHO (µL 50 של 37% HCHO), ו- 2.5 mg/L נה2S2O3 (מ ג 0.256) ל- ddH2O כדי לקבל נפח סופי של 100 מ ל.
- הכנת מאגר 6 על ידי ערבוב מ 38 ל- ddH2O, 50% MeOH (50 מ של 100% MeOH), ו-12% AcOH (12 מ ל 100% AcOH).
- להכין מאגר 7 על-ידי ערבוב 60 מ של ddH2O, 30% MeOH (30 מ של 100% MeOH), ו- 10% גליצרין (10 מ"ל של גליצרין 100%).
- להכין מאגר 8 על ידי ערבוב 10% גליצרין (10 מ"ל של 100% גליצרין) עם 90 מיליליטר ddH2O.
- להכין מאגרי צביעת כסף (הסכומים הדרושים עבור 100 מ של מאגר מסומנים בסוגריים):
- ביצוע צביעת כסף
- לתקן את הג'ל במאגר 1 למשך 30 דקות.
- לשטוף את הג'ל במאגר 2 למשך 15 דקות.
- Pretreat את הג'ל במאגר 3 בשביל 1 דקות.
- לשטוף את הג'ל 3 פעמים ב- ddH2O 20 s.
- להפרות את הג'ל במאגר 4 למשך 20 דקות.
- לשטוף את הג'ל 2 פעמים ב- ddH2O 20 s.
- לפתח את הג'ל במאגר 5 עד להקות גלויים (10 s כדי 10 דקות).
- לשטוף את הג'ל 2 פעמים ב- ddH2O למשך 2 דקות.
- לעצור את פיתוח מאגר 6 במשך 5 דקות.
- חסוך את הג'ל במאגר 7 במשך 20 דקות.
- אחסן את הג'ל מאגר 8.
הערה: צימוד יעילות יכול להיקבע על ידי כימות densitometric של הלהקות ששונה ולא יבוצעו בהם שינויים של capsomere יישוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג דוגמאות אפקט ציטופתי (CPE) על תאים (HEK 293) 293 המציין ייצור וקטור מוצלחת. תאים צריך להראות מורפולוגיה (איור 2C) 40-48 שעות לאחר חיסון עם וקטור וירוס. Timepoint הנכון עבור קציר חיונית לא לאבד חלקיקי וירוס על ידי פירוק התא, מונע חמצון של קבוצות תיול הציג גנטית. אם וקטור חלקיקים המשתחררים לתוך האמצעי על ידי פירוק התא, תיולים גנטית הציג כמעט מיד להיות מחומצן, וזה יהפוך להיות קשה לטהר ולשנות אותם מבחינה כימית.
איור 3 מראה להקות CsCl למופת. מטרת מקוטע CsCl רצועות לפני שינוי כימי הוא להסיר את הלכלוך הסלולר חלקיקי וירוס. השינוי עצמו יכול מכן יתקיים CsCl. רצועות השני לאחר שינוי כימי משמש כדי להסיר את עודף של צימוד (unreacted) moiety. הערה, שינוי מוצלח של הוירוס תואריהל במעבר הצבע, דורש ניתוח מולקולרית, ממוקם באופן אידיאלי על ידי עמודים מרחביות.
איור 4 מציג דוגמאות טיפוסיות של capsid מוצלחת שינויים. רוב moieties מצמידים capsomeres ספציפיים תשנה את התנהגות זורמים capsomeres המתאימים בדף-מרחביות. על ידי השוואה ישירה עם פקד שלא שונתה, ההצלחה של צימוד יכול לאמת ולאחר ניתוח densitometric יכול לעזור לקבוע הכולל צימוד יעילות (האחוזים של באנד שהוסטו, ללא כל צירוף capsomere שונה).
איור 1: שינויים capsid גנטי וכימי משולב של capsids וקטור אדנו לאפשר קוולנטיות מצורף של מיגון פולימרים והיעדים ליגנדים. ציסטאין שאריות מוצגים גנטית capsid שנבחר, החשופים הממס לולאות של capsids וקטור אדנו לצייד את החלקיקים וקטור עם תגובתיות כימיים חדשים. הווקטורים יכול להיות מיוצר באמצעות תאים מפיק קונבנציונאלי ופרוטוקולים. לאחר הייצור, שאריות שהוצג גנטית ציסטאין במיוחד, covalently שינוי עם צימוד תיול-תגובתי moieties (ליגנדים, מיגון פולימרים, פחמימות, מולקולות קטנות, צבעי פלורסנט, וכו '.). עבור צימוד, תרכובות maleimide מופעל (אשר יוצרים קשרים יציבים thioether עם משטח חלקיקים וקטור) או נגזרות pyridyldisulfide (המהווים bioresponsive דיסולפידי גשרים) יכול להיות מועסק. לאחר צימוד, הווקטורים כבר טהור על ידי מקוטע CsCl פסים כדי להסיר moieties צימוד עודף unreacted. . פג, פוליאתילן גליקול (מיגון פולימר); L, ליגנדים (הנגזר מתוך מגוון רחב של חומר הלימודים); -SH, תיול הפונקציונליות של משקעי ציסטאין הציג גנטית. באמצעות טכנולוגיה זו, מספר מוגדר של מולקולות יכול להיות covalently מצמידים את capsids וקטורית, בחירה מדויקת של אתר צימוד הוא ריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אפקט ציטופתי במהלך הייצור וקטור. תאים מפיק קונבנציונאלי (כאן, 293-HEK תאים) יכול לשמש לייצור של הווקטורים מהונדסים לפני שינוי כימי. המראה של CPE מציין את הטוב ביותר timepoint למסוק את התאים. (א) תאים שעתיים לאחר זיהום, (ב) תאים 24 שעות לאחר זיהום ותאים (ג) 40 שעות לאחר ההדבקה לפני הקטיף. גודל ברים = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תוצאות למופת של מעברי צבע CsCl. מעברי צבע CsCl (A, B) לפני ואחרי שינוי כימי (ג). (א) וקטור אדנו הוא רצועת על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות CsCl מקוטע. השלב העליון יופיע בירוק מאז הווקטור המוצג דובים hCMV יזם-מונחה ביטוי קלטת עבור EGFP. Virion וקטור הוא רצועת בתור להקה הלבנה בשליש התחתון של הצינור. שתי הלהקות קטנים יותר (מעל) נובעים חלקיקים לא שלמים, אשר לא ייאספו. (ב) ציסטאין מניבי Ad EGFP להביע וקטור לפני שינוי כימי. (ג) וקטור זהה לאחר השינוי. הלהקה בשליש התחתון של הצינור שנאספו וטיהרו לפי עמודה desalting. סימן עט ב B ו- C תוויות על הגבול של שתי הצפיפויות ומאפשר זיהוי המיקום של הלהקה וקטור זה ייאסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: עמודים מרחביות שהוכתמו SiIver כדי להעריך את יעילות צימוד. סמן MW בנתיב 1. וקטור עם cysteines מוחדרים פנטון capsomeres הבסיס, קללה, זה הושאר שלא שונתה (ליין 2) או שונה עם מופעל maleimide פג (פוליאתילן גליקול) עם משקל מולקולרי של 5 kDa (ליין 3). קללה, זה והן פנטון בבסיס התערוכה משמרת במהלך מרחביות-דף, המציין שינוי מוצלח של > 90% מונומרים לכל capsid. וקטור עם משקע ציסטאין, קללה, זה הושאר יבוצעו בהם שינויים (ליין 4), שונה עם 5 kDa פג (ליין 5), או עם 20 kDa פג (ליין 6). יצוין, כי השינוי גדול יותר של הלהקה קללה, זה נובע משקל מולקולרי גבוה יותר של kDa 20 פג, בהשוואה ל- kDa 5 פג (ליין 5). הג'ל מדגים ירידה לפרטים והיעילות של האיחוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היעילות שבה cysteines גנטית הציג יכול להיות מבחינה כימית שונה בדרך כלל 80-99%, משתנים מסוימים להשפיע על יעילות זו. קודם כל, זה בעל חשיבות עליונה כי cysteines גנטית הציג אינם עוברים חמצון מוקדמת. בעת היותו מוגן בסביבה תוך צמצום של התאים מפיק, זה חובה לספק סביבה שאינם חמצוני לאחר שחרור חלקיקים וקטור מתאי מפיק ובמהלך שינוי כימי. למטרה זו, הפחתת ריאגנטים יכול לשמש בריכוזים מ 0.1-10 מ מ, יש צורך להשתמש ריאגנטים תוך צמצום שאינן מכילות קבוצות תיול, אשר ברצון להגיב עם תרכובות לפעיל על-maleimide. שנית, בעת שימוש תרכובות maleimide מופעל, pH במהלך התגובה צימוד לא יעלה 7.35, מאז pH של יותר מ 7.4 יכול להקטין יחודיות של התגובה. שלישית, בכל מקרה, מאגרי ללא אמין (למשל, HEPES, PBS) אמור לשמש את התגובה. ראוי לציין, ציסטאין מניבי וקטור חלקיקים יכולים להיטהר על-ידי CsCl זוגי פסים כמו שמתואר ולאחר מכן מאוחסנים גליצרול HEPES/10% לפני שינוי כימי. במקרה זה, 0.1-1 מ מ TCEP צריך להיות ריאגנט תוך צמצום, או עדיף, יש לאחסן את הווקטורים באווירה ארגון. ארגון מלא צנצנות פלסטיק עם העפעפיים יכול לשמש למטרה זו. בנוסף, שינוי יעילות מושפעת הקוטר hydrodynamic של המתחם מצמידים את capsids ואת האתר שאליו זה משולב. Capsomeres רבים שיכול לשרת כמו מטרות השינוי geneti-כימי מסוים נמצאים capsid trimers (סיבים, קללה, זה) או pentamers (פנטון הבסיס). לכן, בהתאם למיקום של ציסטאין גנטית הציג, מולקולה moiety מצמידים מונומר אחד עלול sterically לעכב את צימוד של מולקולה נוספת כדי מונומר השכן. זה להתייחס בעת בחירת אתרים אידיאליים עבור שינויים capsid geneti-כימית.
כדי להקל על פתרון בעיות, כמה בעיות שעלולות להתעורר כאשר בעקבות הפרוטוקול המתואר. התשואות וקטור הראשון, נמוך (מתחת חלקיקי וקטור 10,000 בכל הפקה תא) עלולה לגרום מזיהום שיוצרת מפיק תאים. באופן אידיאלי, 100-300 MOI אמור לשמש עבור הזיהום של מפיק תאים. אנא שימו לב כי שתי כמויות וקטור גבוהה מדי, נמוך מדי עבור inoculum לייצר תשואות שיוצרת. הוא אידיאלי כדי המעבר המפיק תאים יום לפני זיהום. להקות השני, smeary במעברי צבע CsCl יכול להופיע. הסיבה בתדירות הגבוהה ביותר smeary הופעת להקות במעברי צבע CsCl היא pH של הפתרונות CsCl זה חומצי מדי. הפחתת הכימית TCEP הוא חומצי מאוד, יש לנקוט כדי להתאים את ה-pH לפני טעינת וקטור אל מעבר הצבע, מאז אדנו וקטורים להתפרק בקלות בסביבה חומצית. צימוד השלישי, נמוך יעילות (< 80% צימוד) הם התוצאה בתדירות הגבוהה ביותר של וקטור טמא ההכנות ו/או חמצון מוקדמת של קבוצות תיול על פני וקטור. ניתן להבחין זיהומים מרחביות-דף, צביעת כסף. במקרה זיהומים משמעותית להתרחש, וקטור הייצור צריך להפעיל מחדש. בנוסף, היעילות צימוד נמוך יכולה להיגרם על ידי תיולים חינם-וקטור בהתגובה. לכן, מומלץ לא להשתמש ß-mercaptoethanol או dithiothreitol כמו הפחתת ריאגנטים, שכן שניהם מכילים קבוצות תיול חינם. ראוי לציין, כדי לבחור אתרים נגישים הממס כדי להציג את שאריות ציסטאין שניתן בקלות לשנות, מבנים קריסטל אמור לשמש; אחרת, cysteines לא ניתן להנגיש השותף צימוד. חמצון מוקדמת של תיולים על פני וקטור ניתן להימנע על ידי שימוש המחמירים של ארגון ו/או TCEP.
לבסוף, לחישובים שגויים stoichiometric גם יכול להוביל צימוד נמוך יעילות. הדוגמה הבאה נועדה להדגים את הנוסחה כלליים שהוצגו לעיל, וכדי להקל על החישובים stoichiometric. בדוגמה, ציסטאין אחד מוחדרים של קללה, זה capsomere. כייל החלקיקים וקטור לאחר CsCl הראשון שלב טיהור הדרגתיות נקבע 1.5 x 10 חלקיקים וקטור10 לכל µL, וכן צימוד moiety, malPEG-750 משמש. כל וקטור capsid מכילה קללה, זה 720 חלבונים (240 trimers), אז כייל של cysteines לכל µL לכן מסכם 720 x 1.5 x 1010 = 1.08 x cysteines13 10/µL.... על מנת לשנות 1.5 מ של וקטור חלקיקים, סך של 1.62 x 1016 cysteines חייב להיות הגיבו את moiety צימוד. כדי להגיע צימוד יעיל, 50 x עודף טוחנת בשואת מתחם הכולל של ציסטאין שאריות מומלץ: 1.62 x 1016 x 50 = 8.1 x 1017 מולקולות של malPEG-750 יש צורך כמה ביעילות של 1.5 x 1016 cysteines של 1.5 מ של וקטור פתרון מטוהרת על-ידי מעבר הצבע בשלב הראשון של CsCl. MalPEG-750 תערוכות משקל מולקולרי של 750 Da; לפיכך, 6.022 x 1023 מולקולות של malPEG-750 שוקל 750 גרם. לכן, עבור זיווג יעיל 1.62 x שאריות ציסטאין16 10 mL 1.5 של וקטור פתרון עם עודף 50 x של malPEG-750, 8.1 x 10 מולקולות17 של malPEG-750 = (750 x 8.1 x 1017) / (6,022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 מ ג malPEG-750 נדרשים.
השיטה הציג משלים ועולה השיטה של וקטור PEGylation. וקטור קונבנציונאלי, מכוון אמין PEGylation אינו מאפשר בייעודי לאתר המצורף של מיגון או פילוח moieties, ואילו הטכנולוגיה geneti-כימית צימוד המובאת כאן ניתן לצרף בדיוק moieties וקטור אדנו משטחים תפקידים מוגדרים, במספרים עותק מוגדרים. לכן מתאים גם הגנה וגם פילוח של חלקיקים וקטור אדנו.
ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש גם על PEGylation מכוון amine המקובלת של וקטורים לספירה שהוזכרו לעיל. במקרה זה, תוך צמצום הכימית TCEP יכול להיות מושמט מן המאגרים. עבור חישובים stoichiometric, מספר קבוצות amine נגיש לכל חלקיק יכול להיחשב 18,000, טיפוסי טוחנת הקיצוניות של צימוד אמין-תגובתי moieties קיפול 20-100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
