Summary
Vi præsenterer en metode til at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af intakt murine leddene efter anvendelsen af kontrolleret mekaniske belastninger eller virkninger. Denne metode kan bruges til at undersøge, hvordan slidgigt, genetiske faktorer og/eller forskellige lastning regimer påvirker i situ chondrocytter sårbarhed.
Abstract
Homeostase af ledbrusken afhænger levedygtigheden af hjemmehørende celler (chondrocytter). Desværre, mekanisk traume kan fremkalde udbredt Chondrocyt død, potentielt fører til uoprettelige fordeling af fælles og udbrud af slidgigt. Derudover er vedligeholdelse af Chondrocyt levedygtighed vigtigt i osteochondral graft procedurer for optimal kirurgisk resultater. Vi præsenterer en metode til at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af intakt murine synovial samlinger efter anvendelsen af kontrolleret mekaniske belastninger eller virkninger. Denne metode kan bruges i sammenlignende undersøgelser til at undersøge virkningerne af forskellige mekanisk belastning regimer, forskellige miljøforhold eller genetiske manipulationer, samt forskellige stadier af brusk degeneration på kort - og/eller langsigtede sårbarhed af in situ artikulære chondrocytter. Målet med protokollen blev introduceret i håndskriftet er at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af murine synovial samlinger. Vigtigst, denne metode giver mulighed for prøvning på fuldt intakt brusk uden at kompromittere indfødte randbetingelser. Desuden, det giver mulighed for real-time visualisering af vital farves artikulære chondrocytter og enkelt image-baseret analyse af celle skade induceret af anvendelsen af kontrolleret statisk og indvirkning lastning regimer. Vores repræsentative resultater viser, at sund brusk explants, den rumlige udstrækning af celle skade afhænger nænsomt belastning omfang og konsekvenser intensitet. Vores metode kan være let tilpasses til at undersøge virkningerne af forskellige mekanisk belastning regimer, forskellige miljøforhold eller forskellige genetiske manipulationer på den mekaniske sårbarhed af i situ artikulære chondrocytter.
Introduction
Ledbrusken (AC) er en bærende væv, der dækker og beskytter knoglerne i synovial samlinger, giver glat fælles artikulation. Væv homeostase er afhængig af levedygtigheden af chondrocytter, den eneste celletype bosat i AC. Men eksponering af brusk til ekstreme kræfter på grund af traumer (fx, falls, køretøj ulykke eller sport skader) eller på grund af post-traumatisk fælles ustabilitet kan fremkalde Chondrocyt død, fører til uoprettelige fordeling af fælles (slidgigt) 1. Desuden, i osteochondral podning procedurer med henblik på reparation lokale defekter i beskadigede brusk, graft indsættelse-associerede mekanisk traume reducerer Chondrocyt levedygtighed og har skadelige virkninger på kirurgisk resultater2.
Brusk eksplantat modeller er almindeligt anvendt til at studere modtagelighed af artikulær chondrocytter til mekanisk induceret celledød. Disse modeller bruger typisk explants fra store dyr for at studere virkningerne af lastning betingelser, miljømæssige forhold og andre faktorer på celle svaghed3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Men på grund af den store størrelse af de indfødte leddene, disse modeller generelt kræver fjernelse af et stik fra den artikulære overflade af et intakt fælles, dermed at kompromittere indfødte randbetingelser. Desuden, de generelt kræver anvendelsen af store mekaniske belastninger at fremkalde celle skade. Alternativt, murine brusk eksplantat modeller giver adskillige fordele i forhold til større animalske modeller i at studere i situ chondrocytter mekaniske sårbarhed. Især på grund af deres mindre dimensioner lette disse modeller test af fuldt intakt ledbrusken uden at ændre indfødte væv integritet. Derudover lastning af murine brusk opstår over lille kontakt områder sådan at Chondrocyt død/skade kan induceres med små belastninger (< 1 N). Endelig, mus genom er nemt manipuleres, gør det muligt for afprøvning af hvordan specifikke gener indvirkning i situ chondrocytter modtagelighed for mekanisk skade.
Det overordnede mål med metoden indført i dette håndskrift er at kvantificere og visualisere i real-time-tid-den rumlige udstrækning af in situ celle død/skade som følge af anvendt mekaniske belastninger på fuldt intakt mus brusk på knogle explants in vitro. Denne metode kræver omhyggelig dissektion af musen synovial samlinger uden at kompromittere Chondrocyt levedygtighed, efterfulgt af mekanisk testning af vital farves explants ved hjælp af et mikroskop-monteret enhed, der svarer til en test-platform, som vi for nylig udviklet at kvantificere murine brusk mekaniske egenskaber16. Under mekanisk testning, er en stor del af (intakt) artikulær overfladen af dissekerede knoglen synlige på et enkelt fluorescens Mikrograf, muliggør hurtig analyse af cellernes levedygtighed efter en belastning er anvendt. En lignende analyse af overflade celle levedygtighed i murine brusk explants er blevet udført tidligere, men uden samtidige gennemførelsen af belastning17. Potentielle anvendelser af vores metode omfatter sammenlignende undersøgelser for at undersøge sårbarhed af artikulær chondrocytter til forskellige kontrollerede miljømæssige og mekaniske forhold, samt screening af behandlinger til formål at reducere følsomheden af chondrocytter til mekanisk belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde blev godkendt ved University of Rochester Udvalget om dyret ressourcer.
1. løsninger
- Forberede Hanks afbalanceret saltopløsning (1 X HBSS) der indeholder calcium, magnesium og ingen phenol rød. PH indstilles til 7.4 ved at tilføje små mængder af HCl eller NaOH.
- Justere osmolaritet til 303 mOsm ved at tilføje NaCl eller deioniseret vand. Bruge bufferen under dissektioner, prøvepræparation og mekaniske test.
2. dissektioner af distale Femur og proksimale Humerus med fuldt intakt ledbrusken
- Aflive mus efter institutionelle retningslinjer ved hjælp af et CO2 indånding kammer efterfulgt af cervikal dislokation. Følg aseptisk teknik i hele.
Bemærk: Mus mellem 8 og 81 uger gamle af enhver stamme og sex kan bruges. - Brug de følgende kirurgiske værktøjer til dissektioner: micro-saks (bruges til at gøre indsnit), standard dissekere saks (bruges til at skære knoglen), skalpel med #11 skalpel blade (bruges til skære bløde væv), juvelerens tang (bruges til fjernelse af bløde væv) og standard pincet (anvendes til peeling blødt væv og hud).
- Følg instruktionerne nedenfor for dissektioner i den distale femur .
- Placer musen i en liggende stilling.
- Lave en lille (~ 5 mm) snit i huden på den forreste del af knæet.
- Udvide snit hele vejen rundt i knæet og trække sig tilbage i huden til at udsætte knæ fælles og ben muskler.
- Med udgangspunkt i den proksimale ende af lårbenet, bruge en skalpel klinge (#11) til at skære langs den distale retning. Placer kniv mellem quadriceps muskler-senen enhed og den forreste side af femurdiafyse. Udvide skær over og forbi patella og slutte af med at skære igennem midten af patellar senen, derved fjerne quadriceps muskler-senen enhed.
- Med udgangspunkt i den proksimale ende af lårbenet, bruge en skalpel klinge (#11) til at skære langs den distale retning. Placer kniv mellem hamstring muskel-sene enhed og den bageste side af femurdiafyse. Når snittet tilgange knæleddet, begynde at skære igennem den bløde væv, at undgå kontakt mellem skalpel og den artikulære overflade på de distale condyles af lårbenet. Finish cut forbi knæleddet.
- Trække sig tilbage den quadriceps og forstrækning muskler til at udsætte lårbenet. Skåret væk eventuelle overskydende muskel i lateral og mediale siderne af lårbenet.
- Skære lægmusklen på den bageste side af den proksimale skinneben og flip ben for at visualisere den bageste side af lårbenet.
- Udsætte de distale condyles af lårbenet og posterior overfladen af den proksimale tibia ved at fjerne overskydende væv omkring knæleddet.
- Skær de forreste og bagerste korsbånd ledbånd ved hjælp af en skalpel, skære væk fra de femoralis condyles. Trække tibia fra lårbenet og skære alle ledbånd adskiller underbenet fra lårbenet.
- Bruger standard dissekere saks, skære igennem lårbenet på den proksimale ende af knoglen (8 mm over den tibio-femorale fælles) fra den laterale side. Efter skæring knoglen, tørre væk enhver synlig marv på ydersiden af knogle til at undgå kontaminering fra knoglemarven cellerne.
Bemærk: Skære fra laterale side reducerer risikoen for knæk formering langs knoglen. - Fjerne omgivende bløde væv (dvs., ledbånd og overskydende muskel) fra lårbenet ved hjælp af juvelerens tang og udsætte brusk på begge condyles i den distale ende af lårbenet. Undgå kontakt mellem brusk og pincet.
- Følg instruktionerne nedenfor for dissektioner af humerus .
- Placer musen i en liggende stilling.
- Gøre et snit (~ 5 mm) i huden på den bageste side af albuen ved hjælp af mikro-saks, udvide indsnittet omkring albuen og trække sig tilbage i huden til at afsløre musklerne i arm og skulder.
- Med udgangspunkt i den proksimale ende af humerus, bruge en skalpel klinge (#11) til at skære langs den distale retning. Placer kniv mellem triceps muskel-sene enhed og den bageste side af humerus. Udvide cut mod den distale ende af humerus og slutte af med at skære igennem triceps senen.
- Derefter trække tilbage triceps mod den proksimale ende af humerus, indtil overarm hovedet er eksponeret.
- Skær bindevæv omkring overarm hovedet ved hjælp af en skalpel klinge (#11) uden at røre den artikulære overflade og fjern legemsdel (arm og skulder) fra kroppen. Periodisk fugte den artikulære overflade af overarm hovedet med HBSS.
- Afbryd humerus armen ved første brækker den proksimale ende af ulna på bageste side af armen ved hjælp af pincet og derefter skære bindevæv omkring den distale ende af humerus. Fjern alle overskydende væv på humerus.
- Afskåret til deltoid tuberositas på bageste side af humerus ved hjælp af standard dissekere saks.
- Placer de dissekerede underskriftsprøver ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende HBSS buffer.
3. levende (Calcein AM) / Dead (Propidium Iodid) farvning protokol
- Pletten med calcein AM således.
- Lave en stamopløsning af calcein AM ved at tilføje 12,5 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) i et hætteglas med 50 µg af calcein AM, hvilket resulterer i en bestand koncentration af 4 mg/mL (4,02 mM).
- Fortyndes bestand calcein løsning 1: 400 i HBSS at nå frem til en koncentration på 10 µg/mL (10.05 µM) af calcium AM (f.eks tilføje 1,25 µL af stamopløsningen til 500 µL af HBSS).
- Centrifugeres fortyndet Farvningsopløsningen for 5 Sørensen 2.000 x g at sikre, at alle af farvestoffet, som lejlighedsvis kan holde sig til væggene i røret, blander sig med bufferen. Fjern ikke supernatanten. Vortex løsning til at sikre korrekt blanding.
- Iværksætte en 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 500 µL af de fortyndede Farvningsopløsningen dissekeret modellen. Inkuber prøvemateriale ved 37 ° C i 30 min i en thermomixer mens agiterer på 800 rpm. Sørg for at rørene er omfattet af aluminiumsfolie til at beskytte mod udsættelse for lys.
- Overføre prøven til calcein AM-fri HBSS buffer. På dette tidspunkt, er modellen klar til mekanisk afprøvning.
- Forberede propidium Iodid (PI) farvning løsning som følger.
- Forberede PI farvning løsning ved at fortynde købt stamopløsning (1 mg/mL, 1,5 mM) 1:25 i HBSS at nå 40 µg/mL (60 µM) af PI. For eksempel tilføje 40 µL af stamopløsningen til 1000 µL af HBSS.
- Holde den PI farvning løsning er omfattet af aluminiumsfolie for at beskytte det mod udsættelse for lys. Bruge Farvningsopløsningen umiddelbart efter den mekaniske test til at opdage sårede celler (Se afsnit 4).
Bemærk: Man kan udføre PI farvning før pålæsningen samt at mere nøje vurdere kvaliteten af dissektioner.
4. mekaniske prøvningsprotokol
- Placere modellen (lårben eller humerus) på glas dias i et brugerdefineret mikroskop-monteret mekaniske test enhed, således at den artikulære overflade på den bageste femoralis condyles eller overarm hovedet sidder på glasset (figur 1).
Bemærk: Fastgøre en 10 mm lange træ applikator (diameter = 2 mm) til den distale side af humerus brug af ren lim. før du placerer det på enheden for at stabilisere modellen på en flad overflade. For en detaljeret beskrivelse af den mekaniske test platform Se supplerende fil 1: afsnit 1. - Hydrat modellen med HBSS og placere enheden med modellen på et fluorescens mikroskop.
- Billede af artikulær chondrocytter farves med calcein AM (excitation/emission bølgelængder = 495/515 nm) før (baseline) anvendelse af belastning under et fluorescens mikroskop med en 4 X tørre linse (NA = 0,13). Justere indstillingerne erhvervelse for at optimere billedkvaliteten.
- Anvende mekaniske ladning oven på modellen således at ledbrusken er komprimeret mod dækslet glas.
- Statisk ladning, anvende en foreskrevne statisk belastning (f.eks.0,5 N) på toppen af prøven (lårben eller humerus). Hold belastning i 5 min og derefter fjerne den.
- For virkningen, Anvend en foreskrevne indvirkning energi (fx, 1 mJ) på modellen ved at droppe en cylindrisk Slaglegemet kendte vægt (f.eks.0,1 N) fra en foreskrevne højde (f.eks., 1 cm). Frigive belastning 5 s efter kollisionen.
Bemærk: Vægten af slaganordningen (mg) og den foreskrevne højde (h) kan omdannes til indvirkning energi (E) ved hjælp af følgende ligning: E = mgh.
- Inkuber modellen i PI farvning løsning for 5 min ved stuetemperatur.
- Billede af artikulær chondrocytter farves med calcein AM og PI (excitation/emission bølgelængder = 535/617 nm) under et fluorescens mikroskop (figur 2).
5. dataanalyse
- Kvantificere område af såret/døde celler på grund af den anvendte mekaniske belastning regime.
- Åbn micrographs af den artikulære overflade erhvervet før og efter udbringning af mekanisk belastning i ImageJ18.
- Kombinere billederne i en stak.
- Angive omfanget af billeder baseret på billedopløsningen.
- Brug værktøjet Polygon til at definere det område, hvor cellerne blev calcein-negativ (tab af grønne fluorescens) og PI-positive (gevinst af røde fluorescens). Disse celler er anset for at være sårede eller døde.
- Bestemme området af såret/døde celler ved hjælp af værktøjet måling .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks forskellige anvendes lastning protokoller (statisk belastning: 0,1 N, 0,5 N og 1 N til 5 min; og indvirkning lastning: 1 mJ, 2 mJ og 4 mJ) reproducerbar induceret kvantificerbare lokaliserede områder af celle skade i femur og overarm brusk opnået fra 8-10 uger gamle BALB/c mus ( Figur 2). Vigtigere, måltes den rumlige udstrækning af Chondrocyt skade på den artikulære overflade til hurtigt og nemt i ImageJ. Repræsentative resultater viser, at den mekaniske sårbarhed af artikulær chondrocytter var påvirket af belastning omfang og konsekvenser intensitet. Navnlig forværret højere belastning størrelser og højere effekt intensiteter betydeligt den rumlige udstrækning af celle skade både i lårben og humeri (figur 3).
Figur 1 : Skematisk fremstilling af den brugerdefinerede mekaniske prøvningsanordningen. (en) samlet enhed med cylindrisk Slaglegemet bruges til at anvende ordineret mekaniske belastninger og/eller indvirkning energi til en model. Enheden er vist uden et eksemplar. (b) skematisk gengivelse af eksperimentet. Kontrolleret statisk (f.eks.0,1 N) og/eller virkninger (f.eks., 1 mJ) indlæsning kan anvendes på toppen dissekeret modellen, sådan at ledbrusken er komprimeret mod dækslet glas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant Mikrograf af den artikulære overflade efter skadevoldende mekanisk belastning. Repræsentative Mikrograf af artikulær overflade på (en) den distale collum condyles og (b) overarm hovedet efter skadevoldende mekanisk belastning (virkninger [1 mJ] og statisk ladning [1 N], henholdsvis). Grønne celler farves afgørende chondrocytter med intakte cellemembraner mens røde kerner angive sårede celler med permeabilized cellemembraner. (c) zoome i udsigt over området i såret/døde celler (gul konturer) på den artikulære overflade af overarm hovedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Areal af såret/døde celler. Område af såret/døde celler på den artikulære overflade af de distale femoralis condyles (en, b) og overarm hovedet (c, d) efter (en, c) statisk (0,1 N, 0,5 N og 1 N, n = 6 pr. gruppe) og (b, d) effekt (1 mJ, 2 mJ og 4 mJ; n = 6 pr. gruppe) indlæsning. Alle brusk på bone prøver blev indhentet fra BALB/c 8-10 uger gamle hunmus. Data er mean + standardafvigelse; parentes angiver Statistisk signifikans på α = 0,05 bestemmes af variansanalyse (ANOVA) test med Tukey post hoc sammenligninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderne beskrevet ovenfor blev med held ansat til at visualisere levedygtige og såret/døde i situ artikulære chondrocytter fra mus leddene efter foreskrevne mekaniske belastninger eller virkninger. Navnlig, vi var i stand til at analysere den mekaniske sårbarhed af chondrocytter inden for fuldt intakt ledbrusken fra to forskellige synovial samlinger: knæleddet (distale lårben) og skulder (humeri). Vores repræsentative resultater viser, at den rumlige udstrækning af celle skade på den artikulære overflade nænsomt afhænger belastning omfang og konsekvenser intensitet (figur 3). Vigtigere, fremmer brug af denne metode undersøgelser af de cellulære reaktion på mekanisk belastning under fysiologisk relevante forhold. Det vil sige, det giver mulighed for afprøvning af ledbrusken på en intakt fælles under fysiologiske og suprafysiologiske belastninger (Se supplerende fil 1: afdeling 2).
I betragtning af den stejle indlæringskurve i at udføre dissektioner af murine synovial samlinger og udfordringer i at bevare levedygtige i situ chondrocytter ved baseline, nogle protokol ændring og fejlfinding kan være påkrævet. Den største risiko for skadelige artikulære chondrocytter under dissektion opstår under trin 2.3.5 gennem 2.3.10 og 2.4.5 gennem 2.4.7. For at minimere celledød skade under dissektioner, bør forskeren undgå enhver kontakt mellem kirurgiske værktøjer (f.eks., skalpel når skære væv eller juvelerens tang, når du fjerner det bløde væv) og den artikulære overflade af modellen . Dog inducerer rørende den artikulære overflade med en handske lille celle skade/død. For at forbedre baseline cellernes levedygtighed, kan det også være nødvendigt at reducere mængden af bløde væv fjernes fra fælles. Derudover vil bruger finere værktøjer generelt reducere dissektion-induceret celledød. I sidste ende, at strengt bekræfte fravær af dissektion-associerede skader af artikulær chondrocytter ved baseline, det er tilrådeligt at plette prøver med både permeabilitet farvestoffer (calcein AM og PI, før pålæsningen) især mens forskeren er at blive bekendt med dissektion procedure (jf. supplerende fil 1: afsnit 3).
I betragtning af den lille størrelse af musen fælles og den genetiske manipulability af mus genom, giver murine modeller flere fordele i forhold til store dyremodeller for at studere sårbarhed af artikulær chondrocytter til mekanisk belastning. Dog til forfatternes viden, har ingen undersøgelser tidligere gennemført for at kvantificere skade/død i situ artikulære chondrocytter på grund af mekanisk belastning af intakt murine brusk. Efterforskere bruger typisk explants fjernet fra leddene i store dyremodeller for at undersøge omfanget af celledød på grund af mekanisk skade3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. derimod musemodeller lette 1) visualisering af næsten hele den artikulære overflade på en given knoglen; og 2) analyser af efter lastning eller post indvirkning Chondrocyt levedygtighed i intakte fuger uden at kompromittere indfødte randbetingelser. Endvidere, mens komprimeret, mus prøver generere betydeligt mindre kontakt områder i forhold til store dyremodeller; Derfor er understreger markant højere end i store dyremodeller for en given belastning størrelsesorden. Dermed kan celle skade være fremkaldt af mindre belastninger. Derudover murine modeller lette forskning på brusk degeneration og navnlig slidgigt, som denne sygdom kan være let induceret i mus gennem genetisk19,20,21, 22, kosten23,24 eller kirurgisk manipulationer25,26,27,28. Derudover opstår spontan slidgigt i flere mus stammer herunder BALB/c og C57BL/629,30.
I vores repræsentative data brugte vi levedygtighed (live/dead) pletter for at kvantificere celle skade/død 5 min efter fjernelse af mekanisk belastning. Vi anerkender, at disse forsøg ikke kan diskriminere sårede celler (celler med midlertidigt bristet membraner) fra døde celler (celler med permanent bristninger membraner). Der er celler, der er calcein negative og PI positive-har tilkendegivet, at membranen har tidligere permeabilized-maj reparation deres membraner over tid skalerer spænder fra sekunder til flere minutter31. Faktisk i et separat sæt af forsøg, vi har fastslået, at brøkdel af "såret" celler, som overlever mekanisk traume er lille (~ 5%) men signifikant (Se supplerende fil 1: afsnit 4). Live/døde farvning er derfor en direkte måling af membran integritet, der ikke er altid udtryk for cellernes levedygtighed. Især er PI-positive og calcein-negative celler mest passende defineret som "såret", hvor skade er defineret som en (eventuelt midlertidigt) tab af plasma membran integritet på grund af mekanisk traume. Vi anerkender også, at vores repræsentative data sandsynligvis afspejler kun umiddelbare (nekrotisk) celledød. Imaging enheder på senere tidspunkter (f.eks.48 h efter fjernelsen af belastningen) bør aktiverer kvantificering af både nekrotisk og apoptotisk celledød.
Flere begrænsninger skal overvejes, når du bruger disse metoder. I vores forsøg forsøg for dette manuskript brugte vi 8-10 uger gamle BALB/c hunmus for at demonstrere mulighederne for den test platform (figur 3). Men mærkbare ændringer i celle tæthed i lårben i ældre mus, vurdering af belastning-induceret celle skade bliver mere udfordrende (om muligt) i ældre lårben (succesrate = 40%). Derimod ingen mærkbare ændringer i celle tæthed på humeri blev observeret i 61-81-uge-forhenværende C57BL/6 mus (Se supplerende fil 1: afsnit 5), hvilket gør den teste platform nyttig for aldre 8-81 uger. En anden begrænsning er, at metoden blev brugt til at analysere den rumlige udstrækning af celle skade kun på den artikulære overflade af collum condyles og overarm hovedet. Metoden kan dog yderligere udvides til at analysere dybde-afhængige rumlige udstrækning af celle skade gennem brug af laser scanning Konfokal mikroskopi. Bemærk at den sidstnævnte metode ville kræve brug af dyrere udstyr, image erhvervelse længere og mere involveret og tidskrævende analyser. Endelig, selvom lokationen kontakt mellem ledbrusken og dække glas var fysiologisk relevante for mus32,33, denne placering var ikke varieret. Men vores test platform giver mulighed for variation af lokationen kontakt hvis lårben eller humerus er grebet med en roterende anker.
Afslutningsvis har vi udviklet en in vitro- murine skade model, der giver mulighed for anvendelse af kontrollerede mekaniske belastninger og/eller virkninger på den artikulære overflade af intakt ledbrusken. Denne model giver mulighed for visualisering af fluorescently mærket artikulære chondrocytter i realtid og hurtig enkelt image-baseret analyse af celledød skade. Vigtigere, kan virkningerne af forskellige mekanisk belastning regimer, forskellige miljøforhold eller forskellige genetiske manipulationer på kort - og/eller langsigtede Chondrocyt levedygtighed testes ved hjælp af denne metode. Således, vores platform indeholder et værktøj til at afhøre grundlæggende videnskab spørgsmål og skærmen terapeutiske mål relateret til mekaniske sårbarheden af chondrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Waugh og Luis Delgadillo for den generøse brug af deres pH-meter og osmometer. Derudover vil forfatterne gerne takke Andrea Lee for at bidrage til den indledende udvikling af den mekaniske test system. Undersøgelsen blev finansieret af NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
