Summary
Мы представляем метод для оценки пространственных масштабов вреда/смерти клетки на поверхности суставной нетронутыми мышиных суставов после применения контролируемых механических нагрузок и воздействий. Этот метод может использоваться для изучения, как остеоартрит, генетические факторы и/или различных загрузки схемы влияет на уязвимость в situ хондроцитов.
Abstract
Гомеостаз суставного хряща зависит жизнеспособность клеток-резидентов (хондроцитов). К сожалению механическая травма может вызвать широкое хондроцитов смерти, потенциально ведет к необратимым разбивка Объединенной и начала остеоартрита. Кроме того поддержание жизнеспособности хондроцитов важно остеохондральные трансплантата процедур для оптимального хирургических исходов. Мы представляем метод для оценки пространственных масштабов вреда/смерти клетки на поверхности суставной нетронутыми мышиных синовиальных суставов после применения контролируемых механических нагрузок и воздействий. Этот метод может использоваться в сравнительных исследований изучить последствия различных механических загрузки схемы, различных экологических условий или генетических манипуляций, а также различные стадии дегенерации хряща на кратко - и долгосрочные Уязвимость в situ суставной хондроцитов. Цель Протокола, введена в рукопись является для оценки пространственных масштабов вреда/смерти клетки на поверхности суставной мышиных синовиальных суставов. Важно отметить, что этот метод позволяет, испытания на полностью нетронутыми хряща без ущерба для собственного граничных условий. Кроме того она позволяет в реальном времени визуализации жизненно окрашенных суставной хондроцитов и единого анализа на основе изображения клетки травмы, вызванные применение контролируемых статические и влияние загрузки схемы. Наш представитель результаты показывают, что в здоровых хрящей эксплантов, пространственные масштабы повреждения клеток зависит от чутко масштабы и влияние интенсивности нагрузки. Наш метод может быть легко адаптирована для изучения последствий различных механических загрузки схемы, различных экологических условий или различных генетических манипуляций на механические уязвимость в situ суставной хондроцитов.
Introduction
Суставной хрящ (AC) является несущей ткани, которая покрывает и защищает кости в синовиальной суставов, обеспечивая плавный артикуляции совместных. Гомеостаз ткани зависит от жизнеспособности хондроцитов, тип единственной ячейки, проживающих в переменного тока. Однако воздействие хряща крайних сил из-за травмы (например, водопад, несчастного случая или спортивных травм транспортного средства) или из-за посттравматического совместной нестабильности может вызвать смерть хондроцитов, приводит к необратимым разбивка суставов (артроз) 1. Кроме того, в остеохондральные прививки процедуры, которые направлены на ремонт локальных дефектов в поврежденный хрящ, трансплантат вставки связанных механической травмы уменьшает хондроцитов жизнеспособности и оказывает негативное воздействие на результаты хирургического2.
Хрящ экспланта модели обычно используется для изучения подверженность суставной хондроцитов механически индуцированной клеточной смерти. Эти модели обычно используют эксплантов от крупных животных для изучения последствий загрузки условий, экологических условий и других факторов на ячейку уязвимости3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Однако из-за большого размера родной суставов, эти модели, как правило, требуют удаления вилки от суставной поверхности неповрежденной сустава, тем самым подрывая родной граничных условий. Кроме того они, как правило, требуют применения больших механических нагрузок заставить клетки травмы. Кроме того мышиных хряща экспланта модели предоставляют несколько преимуществ над более крупных животных моделей в изучении механические уязвимость в situ хондроцитов. В частности из-за их небольших размеров, эти модели облегчить тестирование полностью нетронутыми суставного хряща, не изменяя родной ткани целостности. Кроме того, Загрузка мышиных хряща происходит более мелких зон контакта, таким образом, что хондроцитов смерти/травмы может быть наведено с небольшой нагрузкой (< 1 N). Наконец геном мыши легко манипулировать, позволяя тестирование влияния как конкретных генов восприимчивости в situ хондроцитов механической травмы.
Метод, представленный в этой рукописи Общая цель заключается в количественном определении и визуализации в реальном времени-пространственного экстента в situ клеток смерть/травмы вследствие прикладной механических нагрузок на полностью нетронутыми мыши хряща на кости эксплантах в пробирке. Этот метод требует тщательного вскрытия мыши синовиальной суставов без ущерба для жизнеспособности хондроцитов, следуют механические испытания жизненно окрашенных эксплантов с помощью микроскопа монтируется устройство похоже на тестирование платформы, которую мы недавно разработали для количественного определения механических свойств мышиных хряща16. Во время механические испытания, значительная часть (нетронутыми) суставной поверхности расчлененных кости видны на одном флуоресценции Микрофотография, позволяя быстрый анализ жизнеспособности клеток после нагрузки применяется. Аналогичный анализ жизнеспособности поверхности клеток в мышиных хряща эксплантов была выполнена ранее, но без одновременного применения нагрузки17. Потенциальные применения нашего метода включают сравнительные исследования для изучения уязвимости суставной хондроцитов различных контролируемых экологических и механических условий, а также проверки процедур, направленных на уменьшение чувствительности хондроцитов к механическим нагрузкам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работы был одобрен Комитетом Рочестерского Университета по ресурсам животных.
1. решения
- Подготовить Хэнка сбалансированного солевого раствора (1 X HBSS) содержит кальций, магний и не красный фенола. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, добавляя небольшое количество HCl или NaOH.
- Отрегулируйте осмолярности до 303 мОсм, добавляя NaCl или обессоленной воды. Используйте буфер во время вскрытия, подготовка образца и механические испытания.
2. вскрытия дистальной бедренной кости и проксимального отдела плечевой кости с полностью нетронутыми суставного хряща
- Усыпить мыши согласно институциональных руководящих принципов, с помощью CO2 ингаляции палата следуют шейки матки дислокации. Следуйте асептической техники во всем.
Примечание: Может использоваться мышь между 8 и 81 недель любого штамма и секс. - Используйте следующие хирургические инструменты для вскрытия: микро ножницы (используется для разрезов), стандартная рассечения ножницы (используется для резки костей), скальпеля с #11 лезвие скальпеля (используется для резки мягких тканей), щипцы ювелира (используется для удаления мягких ткани) и стандартные щипцы (используется для пилинг кожи и мягких тканей).
- Для вскрытия дистальной бедренной кости следуйте приведенным ниже инструкциям.
- Поместите указатель мыши в лежачем положении.
- Сделайте небольшой (~ 5 мм) разрез в коже на передней части колена.
- Расширить разрез весь путь вокруг колена и потяните кожу подвергать коленного сустава и ноги мышц.
- Начиная с конца проксимального отдела бедренной кости, используйте лезвие скальпеля (#11) для резки в дистальном направлении. Поместите лезвие между блоком мышцы сухожилия четырехглавой и передней стороне бедра вала. Расширить разрез направлении и за коленной чашечки и закончить, проходящем через середины коленного сухожилия, тем самым удаляя блока мышц сухожилия четырехглавой мышцы.
- Начиная с конца проксимального отдела бедренной кости, используйте лезвие скальпеля (#11) для резки в дистальном направлении. Поместите лезвие между блоком подколенного сухожилия мышц сухожилия и задняя сторона бедренная вала. Как только вырезать подходы коленного сустава, начните резки через мягкие ткани, избегая контакта между скальпель и суставной поверхности на дистальном мыщелков бедренной кости. Закончите вырезать мимо коленного сустава.
- Тяните обратно четырехглавой мышцы и мышцы подколенного сухожилия подвергать бедренной кости. Отрежьте любые излишки мышцы боковые и медиальной стороны бедра.
- Вырезать икроножных мышц на задней стороне проксимального отдела голени и флип ноги, чтобы визуализировать в задней части бедра.
- Разоблачить дистальной мыщелков бедра и задней поверхности проксимальной голени, удалив избыток ткани вокруг коленного сустава.
- Вырежьте передней и задней крестообразной связки с помощью скальпеля, резка от мыщелков бедренной кости. Вытяните голени от бедренной кости и вырезать все связки, чтобы отделить нижнюю ногу от бедра.
- С помощью стандартных рассечения ножницы, рассекала бедренной кости в проксимальном конце кости (8 мм выше tibio бедренного сустава) с боковой стороны. После резки кости, вытереть каких-либо видимых костного мозга на внешней стороне кости, чтобы избежать возможного загрязнения из клеток костного мозга.
Примечание: Резка с латеральной стороны уменьшает риск распространения трещины вдоль кости. - Удаление окружающих мягких тканей (то есть, связок и избыток мышц) от бедра с использованием щипцы ювелира и разоблачить хряща на обоих мыщелков на дистальном конце бедра. Избегайте контакта между хряща и пинцет.
- Для вскрытия плечевой кости следуйте приведенным ниже инструкциям.
- Поместите указатель мыши в лежачем положении.
- Сделать надрез (~ 5 мм) в коже на задней стороне локтя с помощью микро ножницы, расширить надрез вокруг локоть и потяните кожу подвергать мышц руки и плеча.
- Начиная от проксимального конца плечевой кости, используйте лезвие скальпеля (#11) для резки в дистальном направлении. Поместите лезвие между блоком мышц сухожилие трицепс и в задней части плечевой кости. Расширить разрез сторону дистального конца плечевой кости и закончить, проходящем через трицепс сухожилия.
- Затем потяните назад трицепс в конце проксимального отдела плечевой кости до тех пор, пока головку плечевой подвергается.
- Вырезать соединительной ткани вокруг плечевой головки с помощью лезвием скальпеля (#11) без касатьться суставной поверхности и удалить конечности (руки и плеча) из организма. Периодически увлажняют суставной поверхности плечевой головки с HBSS.
- Отсоедините плечевой кости от руки, первый облом проксимальный конец локтевой на задней стороне рукоятки с помощью щипцов, а затем резки соединительной ткани вокруг дистального конца плечевой кости. Удалите любые излишки ткани на плечевой кости.
- Отрежьте дельтовидной бугра на задней стороне плеча, с использованием стандартных рассечения ножницы.
- Поместите расчлененных абразивной в трубу microcentrifuge 1,5 мл, содержащих HBSS буфера.
3. жить (Флуорексон AM) / Dead (пропидий йодидом) пятная протокол
- Пятно использованием Флуорексон AM следующим образом.
- Сделайте Стоковый раствор Флуорексон AM, добавив 12,5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флаконе 50 мкг Флуорексон утра, в результате в складе концентрации 4 мг/мл (4.02 мм).
- Разбавьте 1: 400 акций Флуорексон решение в HBSS достичь концентрации 10 мкг/мл (10,05 мкм) кальция AM (например, мкл 1,25 Стоковый раствор для 500 мкл HBSS).
- Центрифуга разбавленный раствор окрашивания для 5 s на 2000 x g обеспечить что все краски, которые могут иногда прилипнет к стенкам трубки, смешивается с буфером. Не удалить супернатант. Вихрь решение для обеспечения надлежащего перемешивания.
- Положите расчлененных образца в 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл разбавленного раствора окрашивание. Инкубируйте образца при 37 ° C на 30 мин в thermomixer во время агитацию на 800 об/мин. Убедитесь, что трубы покрыты алюминиевой фольги для защиты от воздействия света.
- Передача образца в Флуорексон HBSS AM-бесплатная буфер. На данный момент образца готова для механических испытаний.
- Подготовьте пропидий йодидом (PI) пятная решение следующим.
- Подготовьте окрашивание раствора путем разбавления приобретенных Стоковый раствор (1 мг/мл, 1,5 мм)-1:25 в HBSS до 40 мкг/мл (60 мкм) Пи Пи. Например добавьте 40 мкл Стоковый раствор 1000 мкл HBSS.
- Держите PI, окрашивание раствора в алюминиевой фольги, чтобы защитить его от воздействия света. Используйте окрашивание решение немедленно после механических испытаний для обнаружения потерпевшего клетки (см. раздел 4).
Примечание: Можно выполнить, окрашивание Пи до погрузки, а также для того, чтобы более строго оценивать качество вскрытия.
4. механические испытания протокол
- Место образца (бедренной и плечевой кости) на стекло слайд пользовательских Микроскоп монтируется механические испытания устройства, таким образом, чтобы суставной поверхности на задней мыщелков бедренной или плечевых голова сидит на стекле (рис. 1).
Примечание: Закрепите 10 мм длинные деревянные аппликатор (диаметр = 2 мм) в дистальной части плечевой кости с помощью Цианакрилатный клей перед установкой его на устройство для стабилизации образца на плоской поверхности. Для подробного описания механического тестирования платформы увидеть дополнительный файл 1: раздел 1. - Гидрат образца с HBSS и поместите устройство с образца на флуоресцентным микроскопом.
- Изображение, суставной хрящевые клетки окрашивали Флуорексон AM (волны возбуждения/выбросов = 495/515 нм) до (базовый уровень) применение нагрузки под флуоресцентным микроскопом с 4 X сухого объектива (NA = 0,13). Настройте параметры приобретения для оптимизации качества изображения.
- Применение механических погрузки поверх образца таким образом, что суставного хряща сжимается против покровным стеклом.
- Для статической нагрузкиприменяются предписанные статической нагрузки (например, 0,5 N) поверх образца (бедренной и плечевой кости). Держите нагрузки на 5 мин и затем удалите его.
- Для воздействияприменять предписанные воздействия энергии (например, 1 МДж) образца, сбрасывая цилиндрических ударного известных веса (например, 0,1 N) с установленной высоты (например, 1 см). Выпуск загрузки 5 s после удара.
Примечание: Вес ударного элемента (мг) и предписанные высота (h) могут быть преобразованы в энергии удара (E), используя следующее уравнение: E = mgh.
- Проинкубируйте образцы в PI, окрашивание раствора для 5 мин при комнатной температуре.
- Изображение, суставной хрящевые клетки окрашивали Флуорексон утра и PI (волны возбуждения/выбросов = 535/617 Нм) под флуоресцентным микроскопом (рис. 2).
5. анализ данных
- Определить области ранения/мертвые клетки из-за режима применяются механические нагрузки.
- Откройте микроскопии суставной поверхности, полученные до и после применения механической нагрузки в ImageJ18.
- Объединяйте изображения в стек.
- Установите масштаб изображений, основанный на разрешение изображения.
- Используйте инструмент « многоугольник » для определения области, где клетки стал Флуорексон отрицательной (потеря зеленой флуоресценцией) и PI-позитивные (усиление красной флуоресценцией). Эти клетки считаются потерпевшего или мертвых.
- Определите области ранения/мертвые клетки, с помощью инструмента измерения .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шесть различных применяемых загрузки протоколы (статической нагрузки: 0,1 N, 0,5 N и 1 N 5 мин; и влияние загрузки: 1 МДж, 2 МДЖ и 4 МДж) можно воспроизвести индуцированной количественной оценке локализованных участков клетки травмы в бедренной и плечевой хряща, полученные от 8-10-недельных (мышей BALB/c Рисунок 2). Важно отметить, что пространственные масштабы хондроцитов травмы на суставной поверхности была измерена быстро и легко в ImageJ. Представитель результаты показывают, что механические уязвимость суставной хондроцитов был затронут масштабы и влияние интенсивности нагрузки. В частности более высокие величины нагрузки и более высокой интенсивности воздействия значительно усугубили пространственного экстента клетки травмы бедра и Электрошокер (рис. 3).
Рисунок 1 : Схематическое представление пользовательских механических испытаний устройства. () собранный устройство с цилиндрической ударного элемента, используемое для применения предписано механических нагрузок и/или воздействия энергии для образца. Устройство отображается без образца. (b) схематическое представление эксперимента. Контролируемые статические (например, 0,1 N) и/или воздействия (например, 1 МДж) загрузки может быть применен на верхней части расчлененных образца таким образом, что суставного хряща сжимается против покровным стеклом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель Микрофотография суставной поверхности после вредные механические нагрузки. Представитель Микрофотография суставной поверхности на () дистальной бедренной мыщелков и (b) головку плечевой после вредные механические нагрузки (влияние [1 МДж] и статические нагрузки [1 N], соответственно). Зеленые клетки жизненно запятнаны хондроцитов с нетронутыми мембран клеток, в то время как красные ядра указывают потерпевшего клетки с permeabilized клеточных мембран. (c) Zoomed представление области ранения/мертвые клетки (желтый контуров) на суставной поверхности плечевой головки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Площадь ранения/мертвых клеток. Площадь пострадавших/мертвые клетки на суставной поверхности дистальной бедренной мыщелков (а, б) и плечевых головы (c, d) после (, c) статические (0,1 0,5 N и 1 N N; n = 6 для каждой группы) и (b, d) влияние (1 МДж, 2 МДЖ и 4 МДж; n = 6 для каждой группы) загрузки. Все образцы хряща на кости были получены от самок мышей BALB/c 8-10 недель. Данные являются mean + стандартное отклонение; скобки обозначают статистическую значимость при α = 0,05, определяется дисперсионный анализ (ANOVA) тест с Тьюки пост Специального сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Визуализировать жизнеспособных и погибших и раненых в situ суставной хондроцитов от мыши суставов после того, как предписано механических нагрузок и воздействий успешно использовались методы, описанные выше. В частности, мы были в состоянии анализировать механические уязвимость хондроцитов в полной сохранности суставного хряща из двух разных синовиальных суставов: коленного сустава (дистальной части бедра) и плеча (электрошокер). Наш представитель результаты показывают, что пространственные масштабы повреждения клеток на поверхности суставной чутко зависит масштабы и влияние интенсивности нагрузки (рис. 3). Важно отметить, что использование этого метода облегчает исследования клеточного ответа для механической загрузки физиологически соответствующих условиях. То есть, это позволяет тестирование суставного хряща на нетронутыми совместной под физиологические и supraphysiological загружает (см. дополнительный файл 1: раздел 2).
Учитывая крутой кривой обучения в выполнении Анатомирование мышиных синовиальной суставов и вызовы в сохранение жизнеспособной в situ хондроцитов на базовой линии, некоторые модификации протокола и устранение неполадок может потребоваться. Наибольший риск повреждения суставного хондроцитов во время вскрытия происходит во время действия 2.3.5 через 2.3.10 и 2.4.5 через 2.4.7. Для сведения к минимуму вреда/смерти клетки во время вскрытия, исследователь должен избегать любых контактов между хирургические инструменты (например, скальпель при резке ткани или щипцы ювелира, когда удаление мягких тканей) и суставной поверхности образца . Однако Касаясь суставной поверхности с перчаткой индуцирует мало вреда/смерти клетки. С целью улучшения базовых жизнеспособность клеток, она также может быть необходимо уменьшить количество мягких тканей, удалены из сустава. Кроме того используя тонкие инструменты обычно снизит рассечение индуцированной клеточной смерти. В конечном счете, строго подтвердить отсутствие связанных рассечение повреждения суставного хондроцитов на базовом, желательно пятно образцы с обеих проницаемость красители (Флуорексон утра и Пи, перед погрузкой) особенно в то время, как исследователь ознакомление с процедурой диссекции (см. дополнительный файл 1: раздел 3).
Учитывая небольшой размер мыши сустава и генетические manipulability генома мыши, мышиных моделях предоставляют несколько преимуществ над крупных животных моделей для изучения уязвимости суставной хондроцитов для механической загрузки. Однако к знаниям авторов, исследования не ранее были проведены для количественного определения вреда/смерти в situ суставной хондроцитов вследствие механической загрузки нетронутыми мышиных хряща. Следователи обычно используют эксплантов удалены из суставов крупных животных моделей для изучения степени клеточной смерти из-за механических повреждений3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. В отличие от модели мыши облегчить 1) визуализация почти весь суставной поверхности на данной кости; и 2) анализ жизнеспособности после загрузки или после воздействия хондроцитов нетронутыми суставов без ущерба для собственного граничных условий. Кроме того в то время как сжатый, мыши образцов генерировать существенно меньше зон контакта по сравнению с больших животных моделей; Таким образом подчеркивает существенно выше, чем в крупных животных моделей для заданной нагрузки величиной. Следовательно клетки травмы может быть вызвана меньшие нагрузки. Кроме того мышиных моделях облегчения исследований по дегенерации хряща и, в частности, артроз, как эта болезнь может быть легко наведено в мышей через генетических19,20,21, 22, диетических23,24 или хирургические манипуляции25,26,27,28. Кроме того спонтанного артроза происходит в нескольких мыши штаммов, включая BALB/c и C57BL/629,30.
В наших репрезентативных данных мы использовали жизнеспособности (live/мертвых) пятна для количественного определения вреда/смерти клетки 5 мин после удаления механические нагрузки. Мы признаем, что эти эксперименты не могут проводить дискриминацию потерпевшего (клетки с временно нарушение плодной оболочки) от мертвых клеток (клетки с постоянно разрывов мембраны). Это, клетки, которые являются Флуорексон негативные и Пи позитивные-, указав, что мембрана ранее permeabilized мая ремонт их мембран со временем весы, начиная от секунд до нескольких минут31. В самом деле, в отдельный набор экспериментов, мы определили, что фракция «потерпевшего» клеток, которые выживают механической травмы мал (~ 5%) но существенный (см. дополнительный файл 1: раздел 4). Таким образом окрашивание жить/мертвые мера прямых целостности мембраны, что не всегда свидетельствует о жизнеспособности клеток. В частности PI-позитивных и негативных Флуорексон клетки наиболее надлежащим образом определены как «потерпевшее», где ущерб определяется как (потенциально временная) потеря целостности плазматической мембраны из-за механической травмы. Мы также признаем, что наши репрезентативных данных скорее всего отражает только непосредственные (Некротический) клеточной смерти. Изображений образцов позднее момента времени (например, 48 ч после удаления нагрузки) следует включать количественную оценку как некротические и смерть клетки apoptotic.
Некоторые ограничения необходимо учитывать при использовании этих методов. В наши Пробные эксперименты для этой рукописи мы использовали 8-10-недель старый самок мышей BALB/c для демонстрации возможностей тестирования платформы (рис. 3). Однако, вследствие заметного изменения в плотности клеток в бедра старых мышей, оценки нагрузки индуцированной клетки травмы становится более сложным (хотя это возможно) в старых бедра (показатель успеха = 40%). В отличие от этого, без заметных изменений в плотность клеток на электрошокер наблюдались в 61-81-week-old мышей C57BL/6 (см. дополнительный файл 1: раздел 5), тем самым делая полезно для тестирования платформы в возрасте 8-81 недель. Другое ограничение состоит в том, что метод использовался для анализа пространственных степень повреждения клеток только на суставной поверхности мыщелков бедренной и плечевой головы. Однако этот метод может быть продлен для анализа пространственных степени зависящих от глубины повреждений клеток посредством использования confocal микроскопия скеннирования лазера. Обратите внимание, что последний метод требует использования более дорогостоящего оборудования, длиннее время приобретения изображения и более участвующих и времени анализа. Наконец хотя расположения контактов между суставного хряща и Стекло покровное физиологически актуален для мышей32,33, это место было не разнообразны. Однако наша платформа тестирования позволяет для изменения расположения контактов, если охватил бедренной и плечевой кости с вращающейся арматурой.
В заключение мы разработали в vitro мышиных травмы модель, которая позволяет применение контролируемых механических нагрузок и/или воздействия на суставная поверхность нетронутыми суставного хряща. Эта модель позволяет визуализации дневно обозначенные суставной хондроцитов в в реальном времени и быстрый единый образ основанный анализ гибели/повреждения клеток. Важно отметить, что последствия различных механических загрузки схемы, различных экологических условий или различных генетических манипуляций на хондроцитов кратко - или долгосрочной жизнеспособности может испытываться с использованием этой методологии. Таким образом наша платформа предоставляет средство допросить вопросы фундаментальной науки и экран терапевтических целей, связанных с механической уязвимость хондроцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ричарда УО и Луис Delgadillo за щедрое использование их рН метр и осмометре. Кроме того авторы хотели бы поблагодарить Андреа ли за вклад в развитие первоначальной механической системы тестирования. Это исследование финансировалось NIH Р30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
