Summary
Vi presenterar en metod för att bedöma rumsliga omfattningen av skada/celldöd på artikulära ytan av intakt murina lederna efter applicering av kontrollerad mekanisk belastning eller effekter. Denna metod kan användas för att undersöka hur artros, genetiska faktorer och/eller olika lastning regimer påverkar sårbarhet i situ kondrocyter.
Abstract
Homeostas av ledbrosk beror på viabilityen av bosatt celler (kondrocyter). Tyvärr, mekanisk trauma kan inducera utbredd chondrocyte död, vilket kan leda till irreversibla fördelningen av gemensamt och uppkomsten av artros. Dessutom är underhåll chondrocyte bärkraft viktigt i osteokondrala transplantat förfaranden för optimal kirurgiska resultat. Vi presenterar en metod för att bedöma rumsliga omfattningen av skada/celldöd på artikulära ytan av intakt murina synovial lederna efter applicering av kontrollerad mekanisk belastning eller effekter. Denna metod kan användas i jämförande studier för att undersöka effekterna av olika mekaniska lastning regimer, olika miljöförhållanden eller genetiska manipulationer, samt olika stadier av brosk degeneration på kort - och/eller långsiktiga sårbarheten hos jordbaserad artikulära kondrocyter. Målet med det protokoll som infördes i manuskriptet är att bedöma rumsliga omfattningen av skada/celldöd på artikulära ytan av murina synovial lederna. Denna metod gör allt testa på helt intakt brosk utan att kompromissa med ursprungliga randvillkor. Dessutom tillåter det realtid visualisering av oerhört färgade artikulära kondrocyter och enda image-baserad analys av cell skada inducerad av tillämpningen av kontrollerade statisk och effekter lastning regimer. Våra representativa resultat visar att i friskt brosk bladsticklingar, rumsliga omfattning cell skada beror känsligt på belastning omfattningen och konsekvenserna intensitet. Vår metod kan lätt anpassas till undersöka effekterna av olika mekaniska lastning regimer, olika miljöförhållanden eller olika genetiska manipulationer på mekaniska sårbarhet av i situ artikulära kondrocyter.
Introduction
Ledbrosk (AC) är en bärande vävnad som täcker och skyddar ben i synovial lederna, som ger smidig gemensamma artikulation. Vävnaden homeostas beror på viabilityen av kondrocyter, den enda celltypen bosatta i AC. Dock kan av brosk exponering för extrema krafter som följd av trauma (t.ex., falls, fordonet olycka eller sport skador) eller posttraumatisk gemensamma instabilitet inducera chondrocyte död, leder till oåterkalleliga fördelning av gemensamt (artros) 1. Dessutom i osteokondrala ympning förfaranden som syftar till att reparera lokala defekter i skadade brosk, transplantat införande-associerade mekanisk trauma minskar chondrocyte livskraft och har negativa effekter på kirurgiska resultat2.
Brosk explant modeller används ofta att studera mottagligheten av artikulära kondrocyter till mekaniskt inducerad celldöd. Dessa modeller använder vanligtvis bladsticklingar från stora djur för att studera effekterna av lastning, miljöförhållanden och andra faktorer på cell sårbarhet3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Dock på grund av den stora storleken på infödda lederna kräver dessa modeller i allmänhet avlägsnande av en plugg från artikulära ytan av en intakt gemensam, att därigenom äventyra ursprungliga randvillkor. Dessutom kräver de generellt tillämpning av stora mekaniska laster att inducera cell skada. Alternativt, murina brosk explant modeller ger flera fördelar jämfört med större djurmodeller studera i situ kondrocyter mekaniska sårbarhet. Särskilt på grund av deras mindre dimensioner underlätta dessa modeller testning av helt intakt ledbrosk utan att ändra ursprunglig vävnad integritet. Dessutom, lastning av murina brosk sker över små kontaktytor så att chondrocyte död/skada kan induceras med små laster (< 1 N). Slutligen, mus genomet är lättmanipulerade, möjliggör testning av hur specifika gener påverkar mottagligheten av i situ kondrocyter för mekanisk skada.
Det övergripande målet för den metod som införts i detta manuskript är att kvantifiera och visualisera-i Real-Time-gång-den fysiska omfattningen i situ cell death/skada på grund av tillämpad mekanisk belastning på helt intakt mus brosk-på-ben explants in vitro. Den här metoden kräver noggrann dissektion av mus synovial lederna utan att äventyra chondrocyte livskraft, följt av mekanisk provning av oerhört färgade bladsticklingar använder en Mikroskop-monterad enhet som liknar en testplattform som vi nyligen utvecklat att kvantifiera murina brosk mekaniska egenskaper16. Under mekanisk provning, syns en stor del av den (intakta) artikulära ytan av dissekerade ben på en enda fluorescens Mikrograf, möjliggör snabb analys av cellernas viabilitet efter en belastning används. En liknande analys av surface cellviabilitet i murina brosk bladsticklingar har utförts tidigare, men utan samtidig tillämpning av belastning17. Potentiella tillämpningar av vår metod inkluderar jämförande studier för att undersöka sårbarhet artikulära kondrocyter till olika kontrollerade miljö- och mekaniska förhållanden, samt screening av behandlingar som syftar till att minska känsligheten av kondrocyter till mekanisk belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbetet godkändes av University of Rochester utskottet djur resurser.
1. lösningar
- Förbereda Hanks balanserad saltlösning (1 X HBSS) som innehåller kalcium, magnesium och ingen fenolrött. Justera pH till 7,4 genom att tillsätta små mängder av HCl eller NaOH.
- Justera osmolaritet till 303 mOsm genom tillsats av NaCl eller avjoniserat vatten. Använda bufferten under dissektioner, prov förberedelse och mekanisk provning.
2. dissektioner av distala lårbenet och proximala Humerus med helt intakt ledbroskskador
- Avliva musen enligt institutionella riktlinjer använder en CO2 inandning kammare följt av cervikal dislokation. Följ aseptisk teknik i hela.
Obs: Möss mellan 8 och 81 veckor gammalt någon stam och kön kan användas. - Använd följande kirurgiska verktyg för dissektioner: micro-sax (används för att göra snitt), standard dissekera sax (används för att skära ben), skalpell med #11 skalpell blade (används för styckning mjuk vävnad), JUVELERARAFFÄR tången (används för borttagning av mjuk vävnad) och standard pincett (används för peeling mjukdelar och hud).
- Följ instruktionerna nedan för dissektioner av distala lårbenet .
- Placera musen i ryggläge.
- Göra en liten (~ 5 mm) snitt i huden på den främre delen av knät.
- Förlänga snittet hela vägen runt knäet och dra tillbaka huden för att exponera knä skarven och ben muskler.
- Start från den proximala änden av lårbenet, Använd en skalpell blad (nr 11) för att skära längs distala riktning. Placera bladet mellan quadriceps muskel-senan och den främre sidan av femorala skaftet. Förlänga snittet mot och förbi patella och avsluta genom att skära genom mitten av den knäskålssenan, och tar därigenom bort enheten quadriceps muskel-senan.
- Start från den proximala änden av lårbenet, Använd en skalpell blad (nr 11) för att skära längs distala riktning. Placera bladet mellan hamstring muskler-senan och den bakre sidan av femorala skaftet. När snittet närmar sig knäleden, börja skära genom den mjuka vävnaden, undvika kontakt mellan skalpell och artikulära ytan på de distala kondyler av lårbenet. Avsluta snittet förbi knäleden.
- Dra tillbaka quadriceps och hamstring muskler att exponera lårbenet. Skär bort någon överflödig muskel på laterala och mediala sidorna av lårbenet.
- Skär vadmuskeln på den bakre sidan av proximala tibia och flip benet för att visualisera den bakre sidan av lårbenet.
- Utsätta de distala kondyler av lårbenet och bakre ytan av proximala tibia genom att ta bort överflödig vävnad runt knäleden.
- Skär de främre och bakre korsband ligament med en skalpell skära bort från de lårbenshals kondyler. Dra tibia från lårbenet och skär alla ligament för att separera underbenet från lårbenet.
- Använder standard dissekera saxen, skär genom lårbenet på den proximala änden av benet (8 mm ovanför det tibiofemoralleden-femoral gemensamt) från den laterala sidan. Efter styckning benet, torka bort eventuella synliga benmärg på utsidan av benet att undvika eventuell förorening från benmärgsceller.
Obs: Skära från laterala sidan minskar risken för spricka förökning längs benet. - Ta bort omgivande mjukdelar (dvs, ligament och överflödig muskel) från lårbenet med JUVELERARAFFÄR tången och utsätta brosket på båda kondyler på den distala änden av lårbenet. Undvik kontakt mellan brosk och pincett.
- Följ instruktionerna nedan för dissektioner av humerus .
- Placera musen i ryggläge.
- Gör ett snitt (~ 5 mm) i huden på den bakre sidan av armbågen med mikro-sax, förlänga snittet runt armbågen och dra tillbaka huden för att utsätta musklerna i armen och axeln.
- Start från den proximala änden av humerus, Använd en skalpell blad (nr 11) för att skära längs distala riktning. Placera bladet mellan triceps muskel-senan och den bakre sidan av humerus. Förlänga skära mot den distala änden av humerus och avsluta genom att skära genom triceps senan.
- Sedan dra tillbaka knep mot den proximala änden av humerus tills överarmsbenets huvud är utsatt.
- Skär det connective silkespappret runt överarmsbenets huvud med hjälp av en skalpell blad (nr 11) utan att röra vid den artikulära ytan och avlägsna extremiteten (arm och skuldra) från kroppen. Regelbundet återfukta artikulära ytan av överarmsbenets huvud med HBSS.
- Koppla från humerus från armen genom första att bryta bort den proximala änden av ulna på den bakre sidan av armen med hjälp av pincetten och sedan skära bindväv runt den distala änden av humerus. Ta bort någon överflödig vävnad på humerus.
- Avskurna deltamuskeln ischii på den bakre sidan av humerus med standard dissekera sax.
- Placera dissekerade provexemplaren i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande HBSS buffert.
3. levande (Calcein AM) / döda (Propidium jodid) färgning protokoll
- Fläcken med calcein AM enligt följande.
- Göra en stamlösning av calcein AM genom att lägga till 12,5 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) till en injektionsflaska med 50 µg calcein AM, vilket resulterar i ett lager koncentration på 4 mg/mL (4.02 mM).
- Späd den lager calcein lösning 1: 400 i HBSS till en koncentration på 10 µg/mL (10,05 µM) av kalcium AM (till exempel Lägg till 1,25 µL av stamlösning till 500 µL av HBSS).
- Centrifugera utspädda färglösningen för 5 s vid 2000 x g för att säkerställa att alla färgämnet, som ibland kan sticka till väggarna i röret, blandar med bufferten. Ta inte bort supernatanten. Vortex lösningen att säkerställa korrekt blandning.
- Sätta dissekerade provexemplaret i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 500 µL utspädda färglösningen. Inkubera provet vid 37 ° C i 30 min i en thermomixer medan agitera vid 800 rpm. Kontrollera att rören täcks i aluminiumfolie att skydda från exponering för ljus.
- Över provet till calcein AM-fri HBSS buffert. Vid denna punkt, är preparatet redo för mekanisk provning.
- Förbered propidium jodid (PI) färgning lösning enligt följande.
- Förbereda PI färgning lösning genom att späda ut den köpta stamlösning (1 mg/mL, 1,5 mM) 1:25 i HBSS att nå 40 µg/mL (60 µM) av PI. Exempelvis lägga till 40 µL av stamlösning till 1000 µL av HBSS.
- Håll PI färgning lösning omfattas i aluminiumfolie för att skydda det från exponering för ljus. Använd färglösningen omedelbart efter mekanisk provning för att identifiera skadade celler (se avsnitt 4).
Obs: Man kan utföra PI färgningen före lastning samt att mer strikt bedöma kvaliteten på dissektionerna.
4. mekanisk provning protokoll
- Placera preparatet (lårbenet eller humerus) in i glas bilden av en anpassad Mikroskop-monterad mekanisk provning enhet så att den artikulära ytan på bakre lårbenshals kondyler eller överarmsbenets huvud sitter på glaset (figur 1).
Obs: Fäst en 10 mm lång trä applikator (diameter = 2 mm) till den distala delen av humerus med cyanoakrylat lim innan du placerar den på enheten för att stabilisera preparatet på den plana ytan. För en detaljerad beskrivning av den mekaniska testplattform se kompletterande fil 1: avsnitt 1. - Återfukta preparatet med HBSS och placera enheten med preparatet på fluorescens Mikroskop.
- Bild artikulära kondrocyterna färgas med calcein AM (excitation/utsläpp våglängder = 495/515 nm) innan (baslinje) tillämpningen av belastningen under ett fluorescens Mikroskop med en 4 X torka linsen (NA = 0,13). Justera inställningarna för förvärvet för att optimera bildkvaliteten.
- Gäller mekaniska laddar ovanpå preparatet så att ledbrosket komprimeras mot skyddsglaset.
- För statisk belastning, tillämpa föreskrivna statisk belastning (t.ex., 0,5 N) ovanpå preparatet (lårbenet eller humerus). Håller lasten i 5 min och sedan ta bort den.
- För effekt, applicera en föreskriven krockenergin (t.ex., 1 mJ) på preparatet genom att släppa en cylindrisk provkropp av känd vikt (t.ex., 0,1 N) från föreskriven höjd (t.ex., 1 cm). Släpp den belastning 5 s efter få effekt.
Obs: Vikten på Slaganordningen (mg) och föreskriven höjd (h) kan omvandlas till påverkan energi (E) med hjälp av följande ekvation: E = mgh.
- Inkubera förlagan i PI färgning lösning för 5 min i rumstemperatur.
- Bild artikulära kondrocyterna färgas med calcein AM och PI (excitation/utsläpp våglängder = 535/617 nm) i fluorescens Mikroskop (figur 2).
5. dataanalys
- Kvantifiera området i skadade/döda celler på grund av den tillämpa mekanisk belastning regimen.
- Öppna micrographs av artikulära ytan förvärvade före och efter tillämpningen av mekanisk belastning i ImageJ18.
- Kombinera bilder i en stack.
- Ange omfattningen av bilderna baserat på bildens upplösning.
- Använda verktyget Polygon för att definiera det område där cellerna blev calcein-negativa (förlust av grön fluorescens) och PI-positiv (förstärkning av röd fluorescens). Dessa celler anses vara skadade eller döda.
- Bestäm arean för skadade/döda celler med verktyget mätning .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sex olika tillämpas lastning protokoll (statisk belastning: 0,1 N, 0,5 N och 1 N för 5 min; och effekterna lastning: 1 mJ, 2 mJ och 4 mJ) reproducibly inducerad kvantifierbara lokaliserade områden i femur och humerus brosk som erhållits från 8-10-vecka-gammal BALB/c möss (skada på cellen (Se figur 2). Ännu viktigare, mättes den rumsliga utsträckning av chondrocyte skada på artikulära ytan snabbt och enkelt i ImageJ. Representativa resultat visar att artikulära kondrocyter mekaniska sårbarhet påverkades av belastning omfattningen och konsekvenserna intensitet. I synnerhet förvärrat högre belastning magnituder och högre effekt stödnivåer betydligt den rumsliga utsträckning cell skada både lårben och överarmsben (figur 3).
Figur 1 : Schematisk framställning av anpassade mekaniska provanordningen. (en) samman enhet med cylindriska Slaganordningen används för att applicera föreskrivna mekanisk belastning och/eller effekt energier med en förlaga. Enheten visas utan ett exemplar. (b) schematisk representation av experimentet. Kontrollerad statisk (t.ex., 0,1 N) eller effekt (t.ex., 1 mJ) lastning kan appliceras ovanpå dissekerade preparatet så att ledbrosket komprimeras mot skyddsglaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa Mikrograf av artikulära ytan efter skadevållande mekanisk belastning. Representativa Mikrograf artikulära ytan på (en) den distala lårbenshals kondyler och (b), överarmsbenets huvud efter skadevållande mekanisk belastning (inverkan [1 mJ] och statiska lastning [1 N], respektive). Gröna celler är oerhört färgade kondrocyter med intakt cellmembranen medan röda kärnor ange skadade celler med permeabilized cellmembran. (c), zoomad-i vyn av området av skadade/döda celler (gula konturer) på artikulära ytan av överarmsbenets huvud. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Område av skadade/döda celler. Området av skadade/döda celler på artikulära ytan av de distala lårbenshals kondyler (a, b) och överarmsbenets huvud (c, d) efter (en, c) statisk (0,1 N, 0,5 N och 1 N; n = 6 per grupp) och (b, d) inverkan (1 mJ, 2 mJ och 4 mJ; n = 6 per grupp) lastning. Alla brosk-på-ben exemplar erhölls från honmöss BALB/c 8-10 veckor gamla. Data är medelvärdet + standardavvikelse; parentes betecknar statistisk signifikans vid α = 0,05 bestäms av variansanalys (ANOVA) testet med Tukey post hoc jämförelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som beskrivs ovan användes framgångsrikt att visualisera livskraftiga och skadade/dead i situ artikulära kondrocyter från mus lederna efter föreskrivs mekaniska belastningar eller effekter. I synnerhet kunde vi analysera kondrocyter inom helt intakt ledbrosk mekaniska sårbarhet från två olika synovial lederna: de knäleden (distala lårbenet) och axel (överarmsben). Våra representativa resultat visar att den rumsliga utsträckning cell skada på artikulära ytan känsligt beroende på belastning omfattningen och konsekvenserna intensitet (figur 3). Ännu viktigare, underlättar utredningar av cellulära svar till mekanisk belastning fysiologiskt relevanta villkor av denna metod. D.v.s. det möjliggör testning av ledbrosk på en intakt gemensamma under fysiologiska och suprafysiologiska laster (se kompletterande fil 1: avsnitt 2).
Med tanke på den brant inlärningskurvan utföra dissektioner av murina synovial lederna och utmaningar för att bevara livskraftiga i situ kondrocyter vid baslinjen, vissa protokoll ändring och felsökning kan krävas. Den största risken för skadliga artikulära kondrocyter under dissektion uppstår under steg 2.3.5 via 2.3.10 och 2.4.5 genom 2.4.7. För att minimera skada/celldöd under dissektioner, bör forskaren undvika kontakt mellan kirurgiska verktyg (t.ex., skalpell när skära vävnaden eller i JUVELERARAFFÄR tången när du tar bort den mjuka vävnaden) och artikulära ytan av preparatet . Dock inducerar att röra vid den artikulära ytan med en handske lite skada/celldöd. För att förbättra baslinjen cellernas viabilitet, kan det också vara nödvändigt att minska mängden av mjuk vävnad tas bort från leden. Dessutom kommer att använder finare verktyg allmänt minska dissektion-inducerad celldöd. Ytterst noggrant bekräfta avsaknaden av dissektion-associerade skador av artikulära kondrocyter vid baslinjen, är det tillrådligt att färga exemplaren med båda permeabilitet färgämnen (calcein AM och PI, före lastning) särskilt medan forskaren är bekanta dig med dissektion förfarandet (se kompletterande fil 1: avsnitt 3).
Med tanke på den lilla storleken på mus gemensamma och den genetiska manipulability mus genomets, ger murina modeller flera fördelar gentemot stora djurmodeller studera sårbarhet för artikulära kondrocyter mekanisk belastning. Till författarnas kunskap, har dock inga studier tidigare bedrivits för att kvantifiera skada/dödsfall av i situ artikulära kondrocyter på grund av mekanisk belastning av intakt murina brosk. Utredarna använder vanligtvis bladsticklingar bort från lederna i stora djurmodeller för att undersöka omfattningen av celldöd på grund av mekanisk skada3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. däremot musmodeller underlätta 1) visualisering av nästan hela artikulära ytan på en given ben; och 2) analyser efter lastning eller efter inverkan chondrocyte bärkraft i intakt leder utan att kompromissa med ursprungliga randvillkor. Dessutom även komprimerad, generera mus exemplar väsentligen mindre kontakt områden jämfört med stora djurmodeller; Därför är betonar dramatiskt högre än i stora djurmodeller för en given Last magnitud. Därför kan cell skada induceras av mindre laster. Dessutom murina modeller underlätta forskning om brosk degeneration och, särskilt, artros, som denna sjukdom kan enkelt induceras hos möss genom genetiska19,20,21, 22, dietary23,24 eller kirurgiska manipulationer25,26,27,28. Dessutom uppstår spontana artros i flera mus stammar inklusive BALB/c och C57BL/629,30.
I vår representativa data använde vi livskraft (live/dead) fläckar för att kvantifiera skadan/celldöd 5 min efter borttagning av mekanisk belastning. Vi erkänner att dessa experiment inte får diskriminera skadade celler (celler med tillfälligt brusten membran) från döda celler (celler med permanent spricker membran). Det vill säga celler som är calcein negativa och PI positiva-indikerar att membranet var tidigare permeabilized-maj reparation membranen över tiden skalar allt från några sekunder till flera minuter31. I själva verket i en separat uppsättning experiment, vi har bestämt att fraktionen av ”skadade” celler som överlever mekanisk trauma är små (~ 5%) men betydande (se kompletterande fil 1: avsnitt 4). Live/dead färgning är därför ett direkt mått på membran integritet som inte är alltid tecken på cellernas viabilitet. PI-positiva och calcein-negativa celler definieras särskilt mest lämpligt som ”skadade”, där skada definieras som en (potentiellt tillfälliga) förlust av plasmamembranet integritet på grund av mekanisk trauma. Vi erkänner också att våra representativa uppgifter sannolikt återspeglar bara omedelbar (nekrotisk) celldöd. Imaging exemplar vid senare tidpunkter (t.ex., 48 h efter avlägsnande av belastning) bör möjliggöra kvantifiering av både nekrotisk och apoptotisk celldöd.
Flera begränsningar måste beaktas när du använder dessa metoder. I vår rättegång experiment för detta manuskript brukade vi 8-10 veckor-gamla honmöss BALB/c demonstrerar funktionerna i testa plattformen (figur 3). Men på grund av märkbara förändringar i cell densiteten i lårbenet hos äldre möss, Last-inducerad cell skadebedömningen blir mer utmanande (även om det är genomförbart) i äldre lårbenet (framgång = 40%). Däremot inga märkbara förändringar i cell densiteten på överarmsben observerades hos 61-81-vecka-gammal C57BL/6 möss (se kompletterande fil 1: avsnitt 5), och därmed gör testplattform användbar för åldrarna 8-81 veckor. En annan begränsning är att metoden användes för att analysera den rumsliga utsträckning cell skada endast på artikulära ytan av lårbenshals kondyler och överarmsbenets huvud. Metoden kan dock ytterligare utvidgas till att analysera djup-beroende fysiska omfattning cell skada genom användning av laserscanning konfokalmikroskopi. Observera att den senare metoden skulle kräva användning av dyrare utrustning, bild förvärv längre och mer involverade och tidskrävande analys. Slutligen, även om kontakt mellan ledbrosket och skyddsglaset var fysiologiskt relevanta för möss32,33, varierades inte detta läge. Dock tillåter vår testplattform variant av kontakt platsen om den lårbenet eller humerus är greppas med en roterande armatur.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en in vitro- murina skada modell som möjliggör tillämpningen av kontrollerad mekanisk belastning och/eller påverkan på artikulära ytan av intakt ledbroskskador. Denna modell möjliggör visualisering av fluorescently märkt artikulära kondrocyter i realtid och snabb single image-baserad analys av skada/celldöd. Ännu viktigare, kan effekterna av olika mekaniska lastning regimer, olika miljöförhållanden eller olika genetiska manipulationer på kort- eller långfristiga chondrocyte bärkraft testas med hjälp av denna metod. Vår plattform ger således ett verktyg för att förhöra grundvetenskapliga frågor och skärmen terapeutiska mål relaterade till kondrocyter mekaniska sårbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Richard Waugh och Luis Delgadillo för generösa användningen av deras pH-mätare och osmometer. Författarna vill dessutom tacka Andrea Lee för att bidra till den inledande utvecklingen av mekaniska tester systemet. Denna studie har finansierats av NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
