Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En sebrafisk Embryo modell for In Vivo visualisering og Intravital analyse av biomateriale-assosiert Staphylococcus aureus infeksjoner

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

Studien beskriver en sebrafisk embryoet modell for i vivo visualisering og intravital analyse av biomateriale-assosiert infeksjoner over tid basert på fluorescens mikroskopi. Denne modellen er en lovende utfyller pattedyr dyr modeller som musen modeller for å studere biomateriale-assosiert infeksjoner i vivo.

Abstract

Biomateriale-assosiert infeksjoner (BAI) er en viktig årsak til svikt i biologisk materiale/medisinske enheter. Staphylococcus aureus er en av de store patogener i BAI. Aktuelle eksperimentelle BAI pattedyr dyr modeller som musen modeller er kostbare og tidkrevende, og derfor ikke egnet for høy gjennomstrømning analyse. Dermed er romanen dyremodeller som komplementære systemer for å undersøke BAI i vivo ønsket. I denne studien, vi som mål å utvikle en sebrafisk embryoet modell for i vivo visualisering og intravital analyse av bakteriell infeksjon i nærvær av biologisk materiale basert på fluorescens mikroskopi. I tillegg ble provosert macrophage svaret studert. Dette vi brukte lysstoffrør protein-uttrykke S. aureus og transgene sebrafisk embryo uttrykke fluorescerende proteiner i deres makrofager og utviklet en prosedyre for å injisere bakterier alene eller sammen med mikrosfærer i muskelen vev av embryo. For å overvåke bakteriell infeksjon progresjon i live embryoer over tid, utviklet vi en enkel men pålitelig metode for mikroskopiske scoring av fluorescerende bakterier. Resultatene fra mikroskopiske scoring viste at alle embryoer med mer enn 20 colony-forming enheter (CFU) av bakterier gitt et positivt fluorescerende signal av bakterier. For å studere mulige effekter av biologisk materiale på infeksjon, bestemt vi CFU tallene av S. aureus med og uten 10 µm mikrosfærer polystyren (PS10) som modell biologisk materiale i embryoene. Dessuten, vi brukte ObjectJ prosjektfilen "Sebrafisk-Immunotest" i ImageJ for å kvantifisere fluorescens intensiteten av S. aureus infeksjoner med og uten PS10 over tid. Resultatene fra begge metoder viste høyere antall S. aureus i infiserte embryoer med mikrosfærer enn i embryoer uten mikrosfærer, som indikerer en økt infeksjon mottakelighet i nærvær av biomateriale. Derfor viser studien potensialet i sebrafisk embryoet modellen å studere BAI metoder utviklet her.

Introduction

En rekke medisinske enheter (referert til som "biologisk materiale") brukes stadig mer i moderne medisin gjenopprette eller erstatte menneskekropp del1. Implantering av biologisk materiale predisponerer imidlertid en pasient til infeksjon, kalt en biomateriale-assosiert infeksjon (BAI), som er en stor komplikasjon av implantater i kirurgi. Gule stafylokokker og gule epidermidis er to vanligste bakterielle arter ansvarlig for BAI2,3,4,5,6. Implantert biologisk materiale form en overflate som er utsatt for bakteriell biofilm formasjon. Videre kan lokale immunrespons være sinnsforvirret av de implanterte biologisk materiale, forårsaker redusert effektivitet bakteriell klaring. Den første klarering av infisere bakterier utføres av infiltrere nøytrofile, som har sterkt redusert bakteriedrepende kapasitet i nærvær av et innsatt eller implantert biomateriale7. Videre drepe makrofager infiltrere vevet etter første tilstrømningen av nøytrofile vil phagocytose gjenværende bakterier, men ikke kan effektivt dem intracellulært, på grunn av vanvittig immun signalering som følge av kombinerte tilstedeværelsen av den biomateriale og bakterier8. Dermed, tilstedeværelse av biologisk materiale kan forenkle intracellulær overlevelse av bakterier9,10,11,12,13 og biofilm formasjon på den implanterte biologisk materiale4,14. BAI kan derfor føre til feil og behov for utskifting av implantert biologisk materiale, forårsaker økt sykelighet og dødelighet og langvarig sykehusinnleggelse med ekstra kostnader2,15.

Et økende antall anti-BAI strategier blir utviklet2,16,17. In vivo evaluering av effekten av disse strategiene i relevante dyremodeller er viktig. Men er tradisjonelle eksperimentelle BAI dyr modeller (f.eks, musen modeller) vanligvis dyrt, tidkrevende og derfor ikke egnet for høy gjennomstrømning testing av flere strategier18. Siste utviklingen av bio-optiske Bildeteknikker basert på bioluminescent/fluorescerende merking av vertsceller og bakterier kan for kontinuerlig overvåking av BAI progresjon og vert-patogen/host-materiale interaksjoner i én liten dyrene som mus18,19,20,21. Men denne teknikken er relativt komplisert og fortsatt i sin barndom, og flere problemer må løses for kvantitativ analyse BAI18. For eksempel kreves en høy utfordring dose å visualisere bakteriell kolonisering. I tillegg lys spredning og adsorpsjon bioluminescens/fluorescens signaler i vev av pattedyr test dyr må også være adressert18,19,21. Derfor er romanen, kostnadseffektiv dyremodeller muliggjør intravital visualisering og kvantitativ analyse over tid verdifull komplementære systemer for å studere BAI i vivo.

Sebrafisk (embryo) har blitt brukt som et allsidig i vivo verktøy for dissekere vert-patogen interaksjoner og infeksjon patogenesen ved flere bakteriell arter som mykobakterier22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25og stafylokokker26,27. Sebrafisk embryoer har mange fordeler som optisk åpenhet, relativt lave vedlikeholdskostnader og besittelse av et immunforsvar som er svært lik som i pattedyr28,29. Dette gjør sebrafisk embryo en svært økonomisk modell levende organisme for intravital visualisering og analyse av infeksjon progresjon og tilknyttede vert svar28,29. Å tillate visualisering av cellen atferd i vivo, transgene sebrafisk linjer med ulike immunceller (, makrofager og nøytrofile) og selv med fluorescently merket subcellular strukturer har vært utviklet28 ,29. I tillegg gir høy reproduksjon rate av sebrafisk mulighet til å utvikle høy gjennomstrømning testsystemer med automatisert robot injeksjon, automatisert fluorescens kvantifisering og RNA sekvens analyse27, 30.

Studien, har vi som mål å utvikle en sebrafisk embryoet modell for biomateriale-assosiert infeksjoner med fluorescens imaging teknikker. Dette utviklet vi en prosedyre for å injisere bakterier (S. aureus) i nærvær av biomateriale mikrosfærer inn i muskelvev av sebrafisk embryo. Vi brukte S. aureus RN4220 uttrykke mCherry fluorescerende protein (S. aureus- mCherry), som ble bygget som beskrevet andre steder for en annen S. aureus belastning10,31. Transgene sebrafisk linjen (mpeg1: UAS/Kaede) uttrykker Kaede grønne fluorescerende protein i de makrofager32 og blå fluorescerende polystyren mikrosfærer ble brukt. I en tidligere studie, har vi vist at intramuskulær injeksjon av mikrosfærer i sebrafisk embryo å etterligne biomateriale implantasjon er mulig33. Kvantitativt analysere utviklingen av BAI og tilknyttede cellen infiltrasjon i enkelt embryoer over tid, brukte vi "Sebrafisk-Immunotest" prosjektfilen som drives i "ObjectJ" (en plug-in for ImageJ) å kvantifisere fluorescens intensitet bakterier bosatt og makrofager infiltrert i injeksjonsstedet mikrosfærer33. I tillegg vi bestemt antall colony-forming enheter (CFU) av bakterier i tilstedeværelse og fravær av mikrosfærer i embryoene å studere mulige effekter av biologisk materiale på infeksjon. Vår nåværende studien viser at med metodene utviklet her, sebrafisk embryoet er en lovende, romanen vertebrate dyr modell for å studere biomateriale-assosiert infeksjoner i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne protokollen er vedlikehold av voksen sebrafisk fastsatt av lokale dyrevelferd forskriftene som er godkjent av lokale dyrevelferd komiteen. Eksperimenter med embryo ble utført i henhold til 2010/63/EU-direktivet.

1. utarbeidelsen av "Bare bakterier" og bakterier-mikrosfærer suspensjon

Merk: S. aureus RN4220 belastningen uttrykke mCherry fluorescerende protein (S. aureus- mCherry) brukes. S. aureus RN4220 belastning er mutert i virulens regulator gene agrA (tilbehør genet regulator A)34, og derfor kan ha relativt lav virulens i sebrafisk embryoet modellen. Andre S. aureus stammer eller andre bakterie-art for BAI kan brukes.

  1. Ta 4-5 kolonier av S. aureus RN4220 bakterier fra tryptic soya agar kultur plater med 10 µg/mL chloramphenicol og kultur bakterier til midten av logaritmisk vekstfase i 10 mL av tryptic soya buljong med 10 µg/mL chloramphenicol på 37 ° C risting.
    1. Under kultur, fortynne 100 µL av bakteriell suspensjon i 900 µL av sterile fosfat bufret saline (PBS) i søppel (bredden på 1 cm) for en optisk tetthet (OD) måling på 620 nm (OD620). Kultur bakterier til OD620 når 0,4-0,8.
      Merk: En OD620 0,1 tilsvarer vanligvis 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. OD620 av en inoculum av bakterier i midten av logaritmisk vekstfase er mellom 0,4 0,8. Ulike tidsperioder for dyrking kanskje behøves for andre arter og bakteriestammer.
  2. Sentrifuge bakterier på 3500 x g i 10 min og å suspendere pelleted bakterier i 1 mL steril PBS. Senere vasken bakterier med sterilt PBS 2 ganger, og til slutt å suspendere bakterier i 1.1 mL 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) løsning i PBS.
  3. Vortex denne bakteriell fjæring og fortynne 100 µL av suspensjon i 900 µL av sterile PBS i søppel for OD620 måling. Justere konsentrasjonen av bakteriell suspensjon med PVP40 løsning. Dette er "Bare bakterier" suspensjon.
  4. Biologisk materiale kan velges fritt blande med bakteriell suspensjon. I studien brukes kommersielle polystyren (PS) mikrosfærer (blå fluorescerende, 10 µm). Vil generere en bakterier-mikrosfærer suspensjon, sentrifuge mikrosfærer for 1 min på 1000 x g, romtemperatur, forkaste nedbryting og re avbryte mikrosfærer "Bakterier-bare" suspensjon (i PVP40 løsning).
  5. For å injisere omtrent like doser av bakterier i nærvær og i fravær av mikrosfærer, må konsentrasjonen av bakterier-mikrosfærer suspensjon være to tredjedeler av konsentrasjonen av "Bakterier-bare" suspensjon (uten mikrosfærer). Dette oppnås ved å fortynne bakterier-mikrosfærer suspensjon med 0,5 volum PVP40 løsning. Blande av suspensjon av vortexing. Av notatet, er dette forholdet (to tredjedeler) vurdert for S. aureus. Det er også aktuelle S. epidermidis, men det anbefales å sjekke om dette forholdet også gjelder andre bakterie-art og andre størrelser (enn 10 µm) eller figurer av biologisk materiale (enn mikrosfærer) injiseres.
  6. Sjekk konsentrasjonen av "Bare bakterier" og bakterier-mikrosfærer suspensjon av kvantitative kultur av 10 ganger føljetong fortynninger som nedenfor: overføre 100 µL av karantener for en 96 godt-plate og serielt fortynne ved å overføre 10 µL dele det suspensjon i 90 µL av sterile PBS. Plate like 10 µL dele ufortynnet og utvannet suspensjoner på agarose plater, ruge platene på 37 ° C over natten, telle koloniene og beregne antallet bakterier (colony-forming enheter. CFU).

2. formering, høsting og vedlikehold av sebrafisk embryo

  1. Følg de generelle prosedyrer beskrevne tidligere35,36 for formering, høsting og vedlikehold av sebrafisk embryo, med modifikasjoner beskrevet nedenfor. Krysse en familie av wild type Tupfel lang fin (TL) sebrafisk eller sebrafisk for valgte transgene linje (her, Mpeg1: Kaede) i en tank med en netto lagt for å indusere den voksne kvinner til å produsere egg etter lyset slås på, Separer voksne fra produsert eggene.
  2. Samle embryoene neste dag og forkaste de ikke-gjennomsiktige som ikke er levedyktig. Holde ca 60 embryo per Petriskål (100 mm i diameter) E3 middels37 og ruge på 28 ° C. Fjerne døde og unormale embryo, og Oppdater E3 mediet daglig.

3. forberedelse av injeksjon nåler

  1. Forberede glass microcapillary nålene for injeksjon bruker en brønnene avtrekker instrument. Bruk følgende innstillinger: varme: 772, trekk: 100, vel: 200, tid: 40, gass: 75.
  2. Bryte pinne-spissen med tang på plasseringen der nålen har en ytre diameter på omkring 20 µm (for 10 µm mikrosfærer), lys mikroskop med en skala bar i okulær. Unngå nåler med en meget stor åpning størrelse, som de vil invadere overlevelse av embryoene.
    Merk: Åpningen bli valgt til å være mindre eller større, avhengig av størrelsen og form av biologisk materiale skal injiseres. I litteraturen, er injeksjoner med nåler med en åpning på ca. 50 µm rapportert til en betydelig reduksjon i fosteret overlevelse38.

4. injeksjon av "Bakterier-bare" eller bakterier-mikrosfærer suspensjon i sebrafisk embryo

  1. Varme agarose løsning (1-1,5% (wt) i demi-vann) bruker en mikrobølgeovn og hell i en 100 mm Petriskål. Plass en plast mold mal på toppen av agarose løsningen i Petriskål lage innrykk i agarose for å plassere embryo i riktig posisjoner, tilrettelegge injeksjoner. Inkuber ved romtemperatur og fjerne mold når den agarose løsningen har styrket.
  2. Ved 3 d etter befruktning, sett embryoene i en 100 mm Petriskål inneholder 0.02% (w/v) 3-aminobenzoic acid (Tricaine) å anaesthetize dem. Etter 5 min, overføre embryoene til agarose plate kledde med E3 medium som inneholder 0.02% (w/v) Tricaine og plassere dem i én retning for injeksjon. For Mpeg1: Kaede transgene linjen første anaesthetize embryo i E3 middels inneholder 0.02% (w/v) tricaine. Velg embryo uttrykke grønne fluorescerende proteiner med stereo fluorescens mikroskop.
  3. Laste inn nålen med ca 10 µL av "Bakterier-bare" eller bakterier-mikrosfærer suspensjon bruker et microloader pipette tips. Montere nålen på en micromanipulator koblet til mikro-injektoren. For injektoren brukt her (se tabell for materiale), bruk følgende innstillinger for injeksjoner av 2-3 nL: Press: 300-350, mottrykk: 0, tid: 2 ms.
    Merk: Innstillingene for mikro-injektoren avhenger injektoren brukes. Injektor innstillinger må justeres for injeksjoner av bakterier blandet med biologisk materiale med andre former eller størrelser.
    1. Bruke nåler med samme åpning for injeksjon av "Bakterier-bare" suspensjon og bakterier-mikrosfærer suspensjon. Hvis nålen er ødelagt eller tett, alltid endre for en ny nål for ytterligere injeksjoner.
  4. Sette inn nålen inn i muskelvev av embryo under lys mikroskop (figur 1), i en vinkel på 45-60 ° mellom nålen og kroppen av embryo. Juster plasseringen av nålen i vevet ved forsiktig flytte frem og tilbake. Injisere embryo ved hjelp av en fotpedal koblet til mikro-injektoren.
  5. Etter injeksjon av fluorescerende bakterier, score embryoene til infeksjonen under stereo fluorescens mikroskop. Kast embryo scoret negative (ingen synlige fluorescerende bakterier eller ingen synlige fluorescerende mikrosfærer). Opprettholde embryo individuelt i E3 medium i 48-og plater. Oppdater medium daglig.

5. knusing av embryo, mikroskopiske Scoring og kvantitative kultur av bakterier

  1. Resultat alle embryoer mikroskopisk etter fluorescerende bakterier ved hjelp av en stereo fluorescens mikroskop, starter umiddelbart etter injeksjoner og på hver påfølgende dag før embryoene velges tilfeldig for kvantitative kultur.
  2. Tilfeldig velge noen live infiserte embryo (5 til 6 studien) etter injeksjon og overføre dem individuelt til separate 2 mL microtubes bruke sterilt tips. Fjerner mediet, vaske embryo forsiktig med sterilt PBS gang og legge 100 µL av sterile PBS.
  3. Legge til 2-3 sterilt zirconia perler (2 mm i diameter) hvert hetteglass og knuse embryoene ved hjelp av homogenizer (se Tabell for materiale) på 3500 rpm for 30 s. kultur i homogenate kvantitativt som beskrevet i trinn 1.3.
    Merk: Andre homogenizers kan kreve forskjellige innstillinger.
  4. Tilfeldig velge flere embryoer på påfølgende dager etter injeksjon for kvantitative kultur etter trinn 5.3.

6. fluorescens mikroskopi infeksjon progresjon og provosert celle infiltrasjon i sebrafisk embryoer

  1. Anaesthetize embryoene som beskrevet i trinn 4.2. Pipetter 500 µL av en PBS - 2% (wt) metyl cellulose løsning i en Petriskål inneholder E3 medium med 0,02% (w/v) Tricaine. Plasser embryoene i metyl cellulose løsningen og holde dem rett og vannrett.
    Merk: Methyl cellulose løsningen brukes som en "lim", som på grunn av sin viskositet, kan midlertidig nakkens embryo i beste papirretningen for bildebehandling.
  2. Bruk stereo fluorescens mikroskop utstyrt med lyse feltet, mCherry, grønne fluorescerende protein (GFP) og UV filtre til bildet personlige embryo under identiske optimalisert innstillinger (f.eks, intensitet, forsterkning og eksponering tid) på 160 x forstørrelse . Angi fokalplanet slik at vevsskade forårsaket av injeksjon er i fokus, bruker det lyse feltfilteret. Angi dybden Z stabel på 10 µm og trinn størrelse på 5 µm, som gir mulighet for opptak av 3 påfølgende bilder.
  3. Bildet personlige embryoer når daglig 5 h etter injeksjon til 2 dager etter injeksjon. Ekskludere døde embryo (ingen hjerteslag eller embryoet delvis degradert) for ytterligere bildebehandling og analyse. Opprettholde embryo individuelt i E3 medium i 48-og plater. Oppdater medium daglig.

7. kvantitativ analyse av fluorescens intensiteten av infeksjon progresjon og provosert celle infiltrasjon bruker objektet J prosjektfilen "Sebrafisk-Immunotest"

  1. Dataoverføre "Sebrafisk-Immunotest" og den detaljerte håndbokn fra leddet: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, som beskrevet i en tidligere studie33. I korthet, åpne bilder for analyse med "Sebrafisk-Immunotest", som opererer under programmet freeware bilde J. I hver lastet bildet, markere manuelt injeksjonsstedet basert på observerte vevsskade av embryo.
    Merk: Området markant brukes av "Sebrafisk-Immunotest" som midtpunktet for å oppdage fluorescens toppen innenfor en avstand på 50 µm. Oppdaget fluorescens toppen brukes deretter som et standardisert område (diameter på 100 µm) for fluorescens måling.
  2. Klikk "beregning" i objektet J-menyen for å kjøre fluorescerende målene for flere kanaler, eventuelt automatisk for alle bilder. Eksportere dataene og analysere ved passende flygninger testmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Studien vurdert anvendelse av sebrafisk embryo som roman vertebrate dyr modell for å undersøke biomateriale-assosiert infeksjoner. Microinjection teknikken er vanligvis brukt til å injisere ulike bakterie-art i sebrafisk embryo å forårsake infeksjon,22,,26,,27,,30,,36. Bruke fremgangsmåten avbildet i figur 1, ble S. aureus alene eller sammen med 10 µm PS mikrosfærer (PS10) injisert inn i muskelvev av sebrafisk embryo studien. Intramuskulær injeksjon av S. aureus forårsaket doseavhengig infeksjon i embryo (figur 2). Doser injisert var nær rettet utfordring doser (dag 0 i figur 2). Bare mindre variasjoner i grupper ble observert. Embryo injisert med høy utfordring doser viste variabel infeksjon progresjon på 1 dag og 2 dager etter injeksjon (figur 2, 6000 og 2000 CFU). Den injisert S. aureus bakterier enten ble utryddet eller hadde proliferated og senere etablerte høye nivåer av infeksjon i embryoene. Dette ligner på rapporterte progresjon av S. aureus infeksjon etter intravenøs injeksjon i sebrafisk embryo26. Embryo injisert med lav utfordring doser av S. aureus ryddet bakterier (figur 2, 600 og 200 CFU). Disse resultatene indikerte at utfordringen dosen av S. aureus sterkt påvirker deres infeksjon progresjon i sebrafisk embryoer.

Co injeksjon av bakterier og mikrosfærer resultert i høyere antall bakterier injisert enn injeksjon av bakterier bare (data ikke vist). Ved å forberede den bakteriell inoculum for "Bare bakterier" injeksjoner på en høyere konsentrasjon (ca 1,5 ganger høyere) enn i bakterier-mikrosfærer suspensjon, kunne vi overvinne forskjellen i antall CFU injisert. På denne måten er det mulig å injisere lignende antallet bakterier i embryo tilstedeværelse og fravær av PS10 (dag 0, Figur 3). Antall mikrosfærer per injeksjon variert. Som et eksempel mottatt en av våre eksperimenter, halvparten av embryo mottatt 1 til 2 mikrosfærer per injeksjon (12 av 25 embryo i S. aureus + PS10 gruppe), noen 3 til 4 (8 av 25 embryo), og noen mottatt 5 til 7 mikrosfærer (5 av 25 em bryos). Men påvirke slike variasjoner ikke nivåene av provosert mobilnettet svar, som rapportert i en tidligere studie33.

Neste, vi undersøkt om tilstedeværelsen av mikrosfærer har en innvirkning på infeksjon progresjon i sebrafisk embryoer utfordret med lave doser av S. aureus. Dette injisert vi ca 600 CFU av S. aureus- mCherry med eller uten PS10. Vi brukte to metoder for å studere infeksjon progresjon: (i) konvensjonelle kvantitative kultur av de infiserte embryoene etter knusende, og (ii) scoring av mikroskopiske gjenkjenning ("mikroskopiske scoring") av fluorescerende bakterier (S. aureus- mCherry). Vi sammenlignet resultatene fra disse to metodene. Poengsummen ble definert som "Ja eller nei" synlighet av fluorescerende bakterier i embryoer, uansett fluorescens intensiteten. Resultatene viste at alle embryoer med mer enn 20 CFU av S. aureus- mCherry var positive i mikroskopiske scoring (røde prikker i Figur 3). For 600 CFU av S. aureus per embryo syntes tilstedeværelse av PS10 ikke å betydelig innflytelse infeksjon progresjon. På hele tiden poeng, både hyppigheten av infisert embryo (angitt på Figur 3, lave utfordring dose) og antall CFU etter knusende var ikke annerledes for embryoer med eller uten PS10 (Figur 3lave utfordring dose). Dette foreslo at høyere utfordring doser av S. aureus er nødvendig for å studere mulige effekter av biologisk materiale på infeksjon progresjon i sebrafisk embryoer. Derfor injisert vi ca 1000 CFU av S. aureus i tilstedeværelse og fravær av PS10 i embryoer. Mikroskopiske scoring ikke viser forskjeller i frekvensen av de infiserte embryoene med og uten PS10 på noen tidspunkt (Figur 3høy utfordring dose). Kvantitativ kultur, men viste høyere CFU tall Hentet fra embryo i S. aureus + PS10 gruppe enn de Hentet fra S. aureus -eneste gruppen på 2 dager etter injeksjon (Figur 3, høy utfordringen dose).

For å måle omfanget av infeksjon i nærvær og i fravær av biologisk materiale i sebrafisk embryoer av bildeanalyse, registrerte vi en rekke bilder viser infeksjon utviklingen av S. aureus- mCherry (1000 CFU per embryoet) i nærvær og fravær av PS10 i live embryoer over tid (figur 4A). Vi har også spilt inn provosert infiltrasjon av Kaede grønne fluorescerende protein-uttrykke makrofager i embryoer å kvantifisere immun celle respons (figur 4B). Kaede fluorescerende protein kan gjennomgå fargekonvertering fra grønt til rødt under eksponering for UV-lys, avhengig av eksponeringstid og lysintensiteten39. Slike fargekonvertering ble imidlertid ikke observert under eksperimentelle betingelsen brukt studien. Fluorescens intensiteten av infisere bakterier også som infiltrere makrofager i et standardisert område rundt injeksjonsstedet ble målt ved våre ObjectJ prosjektfilen "Sebrafisk-Immunotest", som opererer innenfor bildet J." Sebrafisk-Immunotest» definerer et standardisert område med en diameter på 100 µm (gule sirkler i Figur 4) rundt et angitt punkt av injeksjon. I embryoer inkludert dette området fleste fluorescerende bakterier bor i nærheten av den injiserte mikrosfærer som infiltrere makrofager. Tilstedeværelsen av en biomateriale ble vist å påvirke både første mottakelighet for infeksjon og immun celle svar. På 5 h etter injeksjon var macrophage infiltrasjon svar på S. aureus bare betydelig høyere enn svar på S. aureus + PS10 (figur 5, macrophage infiltrasjon, 5 hpi). På 1 dag etter injeksjon embryo med PS10 viste signifikant høyere nivåer av S. aureus infeksjoner enn embryo uten PS10 (figur 5, infeksjon progresjon, 1 PPT). Dermed disse kvantitative resultatene viste at kombinasjonen av fluorescens bildet opptak og ObjectJ prosjektfilen "Sebrafisk-Immunotest" kan brukes å kvantifisere infeksjon progresjon og provosert immun celle respons i nærvær av en biomateriale i sebrafisk embryoet modellen. Modellen gir vurdere små forskjeller i immun celle svar og nivåer av bakteriell infeksjon i vivo, og det krever bare stereo fluorescens mikroskop (med bilde opptak) og åpen tilgang "sebrafisk-Immunotest" for evaluering.

Figure 1
Figur 1: skjematisk prosedyren for co injeksjon av bakterier-mikrosfærer suspensjon i halen muskler av sebrafisk embryoer. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al.33 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: antall CFU av S. aureus Hentet fra sebrafisk embryo injisert med inocula, alt fra 6000 til 200 CFU per embryoet og vurdert på 0 til 2 dager etter injeksjon. De røde linjene representerer median antall CFU. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Antall CFU og mikroskopiske scoring av mCherry protein-uttrykke S. aureus (S. aureus- mCherry) i sebrafisk embryoer, vurdert på ulike tidspunkt. Lav utfordring dose: 600 CFU per embryoet; Høy utfordring dose: 1000 CFU per embryoet; PS10: 10 µm PS mikrosfærer; "+", embryo injisert med S. aureus- mCherry sammen med PS10; "-", embryo injisert med S. aureus- mCherry bare uten PS10. Embryo var mikroskopisk scoret for fluorescerende bakterier og tilfeldig valgt for kvantitative kultur av bakterier etter knusing av embryo på dagen for injeksjon (dag 0) og dag 1 og dag 2 etter injeksjon. Embryo mikroskopisk scoret positive og negative for fluorescerende bakterier er vist i rødt og svart prikker, henholdsvis. Antall mikroskopisk positive-scoring embryo delt på det totale antallet embryo scoret (frekvens av infiserte embryo) på hvert tidspunkt er angitt øverst i diagrammet. Forskjeller i frekvenser av infiserte embryoer og antall CFU mellom S. aureus + PS10 og S. aureus bare grupper på hvert tidspunkt ble analysert av Fisher' eksakt test og Mann-Whitney test, henholdsvis. p ≤ 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant bilder innspillingen infeksjon utviklingen av mCherry-uttrykke S. aureus (en rød) i tilstedeværelse og fravær av 10 µm PS mikrosfærer (PS10, blå) og provosert infiltrasjon av Kaede protein-uttrykke makrofager (B, grønn) i embryoer, fra 5 h etter injeksjon (hpi) for 2 dager etter injeksjon (PPT). Ikke behandlet embryo (NT) ble brukt som kontroller. Gule sirkler (100 µm i diameter) Angi standardisert området på injeksjonsstedet for fluorescens kvantifisering benytter det ObjectJ prosjekt arkiv "sebrafisk-Immunotest". Den kvantifisert fluorescensen bakterier og makrofager er avbildet i figur 5. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Fluorescens kvantifisering av S. aureus infeksjoner progresjon og provosert macrophage infiltrasjon i tilstedeværelse og fravær av 10 µm PS mikrosfærer (PS10) i sebrafisk embryoer fra 5 timer etter injeksjon (hpi) til 2 dager etter injeksjon (PPT), bruker ObjectJ prosjektet fil «Sebrafisk-Immunotest». Et standardisert område på injeksjonsstedet ble brukt til fluorescens kvantifisering (med en diameter på 100 µm, slik som de gule sirklene i Figur 4). Ikke behandlet embryo (NT) ble brukt som kontroller. Forskjeller mellom hver to grupper på hver gang punkt ble analysert av Mann-Whitney teste, *p ≤ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biomateriale-assosiert infeksjoner (BAI) er en alvorlig klinisk komplikasjon. En bedre forståelse av patogenesen av BAI i vivo ville gi ny innsikt for å forbedre forebygging og behandling av BAI. Imidlertid gjeldende eksperimentelle BAI dyr modeller som murine modeller er kostbar, arbeidskrevende, og krever spesialisert personell opplært i komplekse kirurgiske teknikker. Derfor er disse modellene ikke egnet for høy gjennomstrømning analyse. Siden kravene for sebrafisk embryoet modeller er mindre komplekse og kostnadene er generelt lavere enn for murine modeller, studien vurdert om sebrafisk embryo kan brukes som en roman vertebrate dyr modell for å undersøke BAI i vivo, utfyllende til pattedyr modellene.

For å sette opp sebrafisk embryoet BAI modellen, utviklet vi protokollen co injeksjon av bakterier og mikrosfærer basert på en metode for intramuskulær injeksjon av mikrosfærer i embryo beskrevet før33. På denne måten finnes de fleste bakterier i nærheten av mikrosfærer i embryo, etterligne bakterier-biomateriale samhandlingen som foregår under eller etter implantering av biologisk materiale i mennesker/pattedyr.

For å kunne sammenligne infeksjon progresjon i tilstedeværelse og fravær av mikrosfærer i sebrafisk embryoer, bør embryo bli utfordret med lignende første antall bakterier med og uten mikrosfærer. Men vår erfaring fører co injeksjon av bakterier-mikrosfærer suspensjon flere bakterier tilværelse innsprøytet enn injeksjon av "Bakterier-bare" suspensjon. Forholdet mellom konsentrasjonen av bakterier "Bakterier-bare" suspensjoner (uten mikrosfærer) og bakterier-mikrosfærer suspensjoner skal være skreddersydd for å løse dette problemet. Studien, konsentrasjonen av S. aureus i "Bakterier-bare" suspensjon måtte være ca 1,5 ganger høyere enn konsentrasjonen i bakterier-mikrosfærer suspensjon. Om dette forholdet gjelder også for andre bakterie-art og andre biologisk materiale gjenstår å bli testet. Av notatet, å injisere lignende antall bakterier med og uten mikrosfærer, bør åpningen av nålene brukes for injeksjoner av enten suspensjon være så nær identisk som mulig.

Flere egenskaper av en biomateriale som form og størrelse spiller en viktig rolle i å bestemme sin injectability og løsemiddel-injeksjon med bakterier. I denne studien, vi brukte 10 µm mikrosfærer polystyren (PS10) som modell biologisk materiale. Vår erfaring er mikrosfærer med en størrelse på opptil 15 µm injiserbare for 3 dager gamle embryo følger protokollen utviklet den nåværende studie33. For mikrosfærer med en relativt stor størrelse (f.eks, ≥ 10 µm), vi fraråder bruken av ikke-monodispersed eller uregelmessig formet mikrosfærer/microparticles som pleier å forårsake tilstopping av nålen. Hvis biologisk materiale i andre former enn runde og i forskjellige størrelser er valgt for å brukes, skal deres injectability testes. For (co-) injeksjon av mikrosfærer og bakterier brukt vi en 4% polyvinylpyrrolidone (PVP) løsning for å lette spredningen. Dette kan være nyttig for injeksjon av biologisk materiale med og uten bakterier i embryo generelt.

Som var tilfelle for injeksjoner av mikrosfærer bare33,40, variert antall mikrosfærer injiseres sammen med bakterier embryo per injeksjon, stort sett alt fra 1 til 4 mikrosfærer per fosteret. Men siden slike variasjoner ikke resulterte i ulik grad av provosert immun celle respons i embryo33, ventet de også ikke å påvirke potensielle effekten av mikrosfærer på infeksjon progresjon. Likevel ville romanen tilnærminger tillater injeksjoner av en enkelt microsphere (alene eller sammen med bakterier) være ønsket.

Vi vurdert om mikroskopiske scoring av tilstedeværelsen av fluorescerende bakterier kan brukes som en "Ja eller nei" scoring system for å analysere infeksjon progresjon i live embryoer. Kriteriet for en positiv mikroskopiske score ble definert som tilstedeværelse av synlig fluorescerende bakterier, uansett fluorescens intensiteten. Sammenlignet med kvantitative kultur av bakterier, antydet representant resultatene at mikroskopiske scoring kan skille embryo med 20 eller flere CFU S. aureus bakterier fra embryo tallene CFU eller ingen infeksjon. Dermed, siden bare lavt antall bakterier er nødvendig for en positiv score, denne metoden er nesten så sensitive som kvantitative kultur. Siden embryoene trenger ikke å bli ofret og ingen high-end mikroskop eller sortering systemer til fluorescens er nødvendig for å utføre analyser på denne måten, vurdere vi mikroskopiske scoring en enkel men pålitelig metode for å overvåke infeksjon progresjon av bakterier i live embryoer. Kvantitativ analyse av nivået av infeksjon (i stedet for "Ja eller nei" scoring system som beskrevet ovenfor) og immun celle respons i ett live embryoer brukt vi ObjectJ prosjektfilen "Sebrafisk-Immunotest" å kvantifisere fluorescens intensitet fluorescerende bakterier og fluorescerende makrofager registrert over tid. Vi brukte et standardisert område (med en diameter på 100 m) rundt injeksjonsstedet for å måle fluorescens, siden dette området ble vist med et flertall av bakterier og infiltrere makrofager. En detaljert manual for "Sebrafisk-Immunotest" ble utgitt tidligere33,40. Av notatet er "Sebrafisk-Immunotest" en åpen tilgang plug-in for ImageJ, som kan tilpasses av brukeren. For eksempel kan diameteren på området analyse og andre parametere for "Sebrafisk-Immunotest" fritt endres i henhold til studien oppsettet (se eksemplene i koblingen gitt i trinn 7 i protokollen).

For å vise mulig infeksjon-forsterke effekten av biologisk materiale i sebrafisk embryoer, må utfordringen dosen av bakterier vurderes. I studien fant vi at en utfordring dose av 1000 CFU av S. aureus per embryo eller høyere er nødvendig. Høyere nivåer av S. aureus infeksjoner i embryoer med PS10 enn i de uten PS10 ble funnet på de 3 første dagene etter injeksjon, som angir at tilstedeværelsen av biologisk materiale transiently muliggjør utvekst av S. aureus i embryoer. Om infeksjon forblir på høye nivåer i nærvær av biologisk materiale på senere tidspunkt bør studeres bruker eldre embryo under etiske godkjenning i henhold til gjeldende forskrifter. Siden klarering av S. aureus i sebrafisk embryoer er hovedsakelig avhengig fagocytose og drap av makrofager og nøytrofile23,24, resultatet av bakterier kan forklares med en redusert effektiviteten av den phagocytes å drepe bakterier av biologisk materiale. Dette er i tråd med kjente infeksjon risiko styrking av biologisk materiale i pasienter2,4,15, også ofte observert i mer komplekse dyremodeller som mus og andre dyr modeller10 ,11,12,13. I tillegg til S. aureus infeksjon, kan infeksjon progresjon av S. epidermidis eller andre patogener i nærvær av biologisk materiale undersøkes følger protokollen beskrevet studien. Fra punktet av biologisk materiale, kan flere materialegenskaper (f.eks, kjemisk sammensetning, hydrophobicity, grovhet og overflate kostnader) påvirke mobilnettet svar og/eller bakterier-materiell samhandling41, 42. vår forrige studie har vist at injeksjon av en biomateriale (i nærvær av PVP) provoserte en sterkere macrophage infiltrasjon sammenlignet injeksjon av bare PVP i sebrafisk embryoer. Videre sebrafisk embryo reagerte ulikt mikrosfærer av poly (-caprolactone) og polystyren33. Injeksjon av mikrosfærer av ulike natur har derfor også differensial effekter på forbedring av infeksjon, som kan relativt lett vurderes av metoden beskrevet her.

For videre utbygging, kan denne sebrafisk embryoet BAI modellen endres for en høy gjennomstrømning systemet med automatisert robot injeksjon27,43, komplekst objekt parametrisk analyse og sortering (COPAS) systemer og høy gjennomstrømning RNA sekvens analyse27,44. Slike sebrafisk embryo-baserte høy gjennomstrømning BAI modeller kan brukes som helt dyr systemer i vivo screening og testing av (Roman) anti-infeksiøs biologisk materiale samt testing av effekten av antibiotika behandlinger eller andre anti-BAI strategier. Videre er intracellulær overlevelse en stor strategi av bakterier å overleve i nærvær av biologisk materiale,9,,10,,11,,12,,13. Nytten av sebrafisk embryo for å studere intracellulær infeksjon har vært vist i flere studier36,46. Dermed kan vår embryoet modell brukes å studere intracellulær overlevelse av stafylokokker eller andre intracellulær patogener i nærvær av biologisk materiale, og strategier for å behandle slike intracellulær infeksjoner. I tillegg kan i situ hybridisering teknikker45 brukes i modellen for å studere påvirkning av bakterier eller biologisk materiale eller deres kombinasjon med uttrykk for bestemte gener på injeksjonsstedet, som kan være nyttig å oppdage markør gener for BAI.

Oppsummert viser studien potensialet i sebrafisk embryo metoder utviklet her for å studere biomateriale-assosiert infeksjoner i sanntid i vivo. Denne sebrafisk embryoet modellen kan derfor brukes å undersøke romanen infeksjon-resistente biologisk materiale og lovende forebygging og behandling strategier BAI og lukke gapet mellom in vitro studier og større dyr modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble økonomisk støttet av IBIZA prosjektet av programmet biomedisinsk materiale (BMM) og delfinansiert av nederlandsk Ministry of Economic Affairs. Forfatterne gjerne takke Prof. Dr. Graham Lieschke fra Monash University, Australia for å gi sebrafisk transgene linjen (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

Tags

Bioteknologi problemet 143 sebrafisk embryo biomateriale-assosiert infeksjoner Staphylococcus aureus polymere mikrosfærer i vivo visualisering intravital analyse fluorescens kvantifisering
En sebrafisk Embryo modell for In Vivo visualisering og Intravital analyse av biomateriale-assosiert <em>Staphylococcus aureus</em> infeksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, … More

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, O. W., Grijpma, D. W., Spaink, H. P., Zaat, S. A. J. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (143), e58523, doi:10.3791/58523 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter