Summary
Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.
Abstract
Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è delle principali cause del fallimento di biomateriali/dispositivi medici. Lo Staphylococcus aureus è uno dei principali patogeni a BAI. Corrente sperimentale animale mammifero di BAI modelli come modelli murini sono costosi e che richiede tempo e quindi non è adatto per analisi di rendimento elevato. Così, nuovi modelli animali come sistemi complementari per lo studio in vivo di BAI sono desiderati. Nel presente studio, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per la visualizzazione in vivo e videomicroscopia analisi dell'infezione batterica in presenza di biomateriali basati su microscopia di fluorescenza. Inoltre, è stata studiata la risposta dei macrofagi provocata. A tal fine, abbiamo usato fluorescente che esprimono proteine S. aureus e gli embrioni di zebrafish transgenici che esprimono le proteine fluorescenti in loro macrofagi e sviluppato una procedura per iniettare i batteri da soli o insieme a microsfere nel muscolo tessuto di embrioni. Per monitorare la progressione della infezione batterica negli embrioni dal vivo nel corso del tempo, abbiamo messo a punto un metodo semplice ma affidabile di scoring microscopica di batteri fluorescenti. I risultati di segnare al microscopio ha mostrato che tutti gli embrioni con più di 20 unità formanti colonie (CFU) di batteri ha prodotto un positivo segnale fluorescente di batteri. Per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione, abbiamo determinato i numeri CFU di S. aureus con e senza microsfere di 10 µm in polistirene (PS10) come biomateriali modello negli embrioni. Inoltre, abbiamo usato il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operano in ImageJ per quantificare l'intensità della fluorescenza di S. aureus infezione con e senza PS10 nel corso del tempo. Risultati da entrambi i metodi hanno mostrato un numero maggiore di S. aureus infetti embrioni con microsfere che negli embrioni senza microsfere, che indica una suscettibilità aumentato di infezione in presenza il biomateriale. Così, lo studio presente indica il potenziale del modello di embrione di zebrafish per studiare BAI con i metodi sviluppati qui.
Introduction
Una varietà di dispositivi medici (denominato "biomateriali") sono sempre più utilizzati nella medicina moderna per ripristinare o sostituire parti di corpo umano1. Tuttavia, l'impianto di biomateriali predispone un paziente all'infezione, chiamato un infezione biomateriale-collegata (BAI), che è una complicazione importante di impianti in chirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sono due specie di batteri più prevalente responsabile BAI2,3,4,5,6. Impiantato forma biomateriali una superficie sensibile alla formazione di biofilm batterico. Inoltre, la risposta immunitaria locale può essere squilibrato di biomateriali impiantati, causando ridotta efficacia della clearance batterica. Il gioco iniziale di infettare i batteri viene eseguito principalmente da infiltrazione dei neutrofili, che hanno fortemente ridotto la capacità battericida in presenza di un inserito o impiantati biomateriale7. Inoltre, i macrofagi infiltranti il tessuto dopo l'iniziale afflusso dei neutrofili verrà fagocitare i batteri rimanenti ma non può efficacemente si uccidono intracellulare, dovuto immunitario squilibrato di segnalazione che è una conseguenza della presenza combinata di il biomateriale e batteri8. Così, la presenza di biomateriali può facilitare la sopravvivenza intracellulare di batteri9,10,11,12,13 e biofilm formazione sull'impiantati biomateriali4,14. Di conseguenza, BAI potrebbe portare al fallimento e bisogno per la sostituzione dei biomateriali impiantati, causando un aumento della morbilità e mortalità e l'ospedalizzazione prolungata con costi aggiuntivi2,15.
Un numero crescente di strategie anti-BAI è stati sviluppati2,16,17. Valutazione in vivo dell'efficacia di queste strategie in modelli animali pertinenti è essenziale. Tuttavia, tradizionale BAI modelli animali (es. modelli di mouse, ) sono solitamente costosi, che richiede tempo e quindi non adatti per elevato throughput test di più strategie18. Recente sviluppo di tecniche di imaging bio-ottico basato su bioluminescenti/fluorescente etichettatura di batteri e cellule dell'ospite può permettere per il monitoraggio continuo delle interazioni di progressione e materiale-ospite-agente patogeno/host BAI in singoli piccoli animali come topi18,19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è relativamente complessa e ancora nella sua infanzia, e diversi problemi devono essere affrontati per l'analisi quantitativa di BAI18. Per esempio, per visualizzare la colonizzazione batterica è necessaria una dose alta sfida. Inoltre, light scattering e adsorbimento di bioluminescenza/fluorescenza segnali nei tessuti dei mammiferi: saggio gli animali devono anche essere affrontate18,19,21. Di conseguenza, romanzo, conveniente modelli animali, consentendo la visualizzazione videomicroscopia e analisi quantitativa nel corso del tempo sono sistemi complementari importanti per lo studio in vivo di BAI.
Zebrafish (embrioni) sono stati usati come uno strumento versatile in vivo per la dissezione interazioni ospite-patogeno e patogenesi di infezione di varie specie batteriche come micobatteri22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25e stafilococchi26,27. Embrioni di zebrafish presentano molti vantaggi quali trasparenza ottica, un relativamente basso costo di manutenzione e possesso di un sistema immunitario molto simile a quella di mammiferi28,29. Questo rende gli embrioni di zebrafish organismo modello altamente economica, living per videomicroscopia visualizzazione e l'analisi della progressione di infezione e host associato risposte28,29. Per permettere la visualizzazione del comportamento delle cellule in vivo, transgenici zebrafish linee con diversi tipi di cellule del sistema immunitario (per esempio, macrofagi e neutrofili) e anche con strutture subcellulari fluorescente contrassegnati sono stati sviluppati28 ,29. Inoltre, il tasso di riproduzione alta di zebrafish fornisce la possibilità di sviluppare sistemi di test di velocità effettiva elevata con iniezione robot automatizzati, quantificazione automatizzata di fluorescenza e RNA sequenza analisi27, 30.
Nello studio presente, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per infezione biomateriale-collegata usando tecniche di imaging di fluorescenza. A tal fine, abbiamo sviluppato una procedura per iniettare batteri (Staphylococcus aureus) alla presenza di microsfere di biomateriale nel tessuto muscolare di embrioni di zebrafish. Abbiamo usato lo Staphylococcus aureus RN4220 esprimenti mCherry proteina fluorescente (s. aureus- mCherry), che è stata costruita come descritto altrove per10,un altro ceppo di Staphylococcus aureus 31. La linea di zebrafish transgenici (mpeg1: UAS/Kaede) esprimendo Kaede proteina verde fluorescente in macrofagi32 e blu fluorescente microsfere in polistirolo sono stati usati. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l'iniezione intramuscolare di microsfere negli embrioni di zebrafish per imitare l'impianto biomateriale è fattibile33. Per analizzare quantitativamente la progressione di BAI e infiltrazione delle cellule associato a singoli embrioni nel corso del tempo, abbiamo usato il file di progetto "Zebrafish-Immunotest" che è gestito all'interno di "ObjectJ" (un plug-in per ImageJ) per quantificare l'intensità di fluorescenza di batteri che risiedono e macrofagi che si infiltrano nelle vicinanze del sito di iniezione di microsfere33. Inoltre, abbiamo determinato i numeri delle formanti colonie unità (CFU) di batteri in presenza ed assenza di microsfere negli embrioni per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione. Il nostro studio presente dimostra che con i metodi sviluppati qui, l'embrione di zebrafish è un promettente, romanzo vertebrato modello animale per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.
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Protocol
In questo protocollo, manutenzione di zebrafish adulto è nel rispetto delle normative locali benessere degli animali, come approvato dal comitato locale benessere degli animali. Esperimenti con embrioni sono stati eseguiti secondo la direttiva 2010/63/UE.
1. preparazione del "Solo batteri" e sospensioni di batteri-microsfere
Nota: Il ceppo di S. aureus RN4220 espressione della proteina fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) è usato. Il ceppo di RN4220 di S. aureus è mutato il gene regolatore di virulenza agrA (regolatore genico accessorio A)34e di conseguenza potrebbe essere relativamente bassa virulenza nel modello di embrione di zebrafish. Altri ceppi di S. aureus o altre specie batteriche per BAI può essere utilizzato.
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Prendere 4-5 colonie di batteri di RN4220 di S. aureus da piastre di coltura agar soia triptico completati con cloramfenicolo di 10 µ g/mL e cultura i batteri alla fase di crescita metà-logaritmica in 10 mL di brodo di soia triptico completato con 10 µ g/mL cloramfenicolo a 37 ° C in agitazione.
- Durante la coltura, diluire 100 µ l della sospensione batterica in 900 µ l di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) in una provetta (larghezza di 1 cm) per una misurazione di densità ottica (OD) a 620 nm (OD620). Fino a quando raggiunge il OD620 0,4 – 0,8 della coltura i batteri.
Nota: Un OD620 di 0.1 corrisponde generalmente a 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. Il OD620 di un inoculo di batteri in fase di crescita logaritmica metà è compreso tra 0.4-0.8. Periodi di tempo diversi per la coltura possono essere necessari per altre specie e ceppi di batteri.
- Durante la coltura, diluire 100 µ l della sospensione batterica in 900 µ l di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) in una provetta (larghezza di 1 cm) per una misurazione di densità ottica (OD) a 620 nm (OD620). Fino a quando raggiunge il OD620 0,4 – 0,8 della coltura i batteri.
- Centrifugare i batteri a 3.500 x g per 10 min e risospendere i batteri pellettati in 1 mL di PBS sterile. Successivamente lavare i batteri con sterile PBS 2 volte e infine Risospendere i batteri in 1,1 mL di soluzione al 4% (p/v) polivinilpirrolidone40 (PVP40) in PBS.
- Vortice questa sospensione batterica e diluito 100 µ l della sospensione in 900 µ l di PBS sterile in una cuvetta per la misurazione di620 OD. Regolare la concentrazione della sospensione batterica con soluzione di PVP40 . Questa è la sospensione "Solo batteri".
- Biomateriali possono essere scelto liberamente di mescolare con sospensione batterica. Nello studio presente, microsfere commerciale polistirolo (PS) (fluorescente blu, 10 µm) sono utilizzate. Per generare una sospensione di batteri-microsfere, centrifugare le microsfere per 1 min a 1.000 x g, temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le microsfere in sospensione "Batteri-only" (nella soluzione di40 PVP).
- Al fine di iniettare dosi approssimativamente uguali di batteri in presenza e in assenza di microsfere, la concentrazione di batteri-microsfere sospensione deve essere due terzi della concentrazione della sospensione "Batteri-only" (senza microsfere). Ciò si ottiene diluendo la sospensione di batteri-microsfere con 0,5 volume di soluzione di PVP40 . Mescolare le sospensioni nel Vortex. Di nota, questo rapporto (due terzi) è stato valutato per S. aureus. È inoltre opportuno per S. epidermidis, ma si consiglia di verificare se questo rapporto vale anche per altre specie batteriche e altri formati (superiore a 10 µm) o forme di biomateriali (rispetto a microsfere) deve essere iniettato.
- Controllare la concentrazione della sospensione "Solo batteri" e microsfere di batteri da coltura quantitativa di 10 volte diluizioni seriali come di seguito: trasferire 100 µ l delle sospensioni a un 96-pozzetti e in serie diluire trasferendo 10 aliquote µ l della sospensione in 90 µ l di PBS sterile. Piastra duplicati 10 aliquote µ l delle sospensioni non diluite e diluite sui piatti dell'agarosi, incubare le piastre a 37 ° C durante la notte, la conta delle colonie e calcolare il numero di batteri (unità formanti colonie. CFU).
2. allevamento, raccolta e la manutenzione di embrioni di Zebrafish
- Seguire le procedure generali descritte precedenti35,36 per allevamento, la raccolta e la manutenzione di embrioni di zebrafish, con le modifiche descritte di seguito. Attraversare una famiglia di tipo selvaggio Tupfel lunga pinna (TL) zebrafish o Danio rerio del selezionato linea transgenica (qui, Mpeg1: Kaede) in un serbatoio con una rete aggiunto per indurre le femmine adulte per produrre uova dopo la luce si accende, quindi separare gli adulti dalle uova prodotte.
- Raccogliere gli embrioni il giorno successivo e scartare quelli non trasparenti che non sono sostenibili. Tenere circa 60 embrioni per piastra di Petri (100 mm di diametro) in E3 Media37 e incubare a 28 ° C. Rimuovere gli embrioni morti e anormali e aggiornare quotidianamente il mezzo di E3.
3. preparazione di aghi per iniezione
- Preparare i vetro microcapillary aghi per iniezione utilizzando uno strumento di estrattore micropipetta. Utilizzare le seguenti impostazioni: calore: 772, pull: 100, vel: 200, tempo: 40, gas: 75.
- Rompere la punta dell'ago con una pinza nella posizione dove l'ago ha un diametro esterno di circa 20 µm (per 10 µm microsfere), utilizzando un microscopio ottico con una barra di scala nell'oculare. Evitare aghi con una dimensione di apertura molto ampio, in quanto compromettono la sopravvivenza degli embrioni.
Nota: L'apertura può essere scelti per essere più piccolo o più grande, secondo la dimensione e la forma dei biomateriali da iniettare. Nella letteratura, iniezioni con aghi con un'apertura di circa 50 µm sono state segnalate per causare una diminuzione significativa nell'embrione sopravvivenza38.
4. iniezione di "Sola batteri" o batteri-microsfere sospensione negli embrioni di Zebrafish
- Riscaldare la soluzione di agarosio (1 – 1,5% (wt) in demi-acqua) utilizzando un forno a microonde e versare in un piatto di Petri di 100 mm. Inserire un modello di muffa di plastica sopra la soluzione di agarosio in di Petri per creare rientranze in agarosio per posizionare gli embrioni in posizioni adeguate, facilitando le iniezioni. Incubare a temperatura ambiente e rimuovere lo stampo quando la soluzione di agarosio ha solidificato.
- Al momento della post-fecondazione d 3, posizionare gli embrioni in una capsula Petri 100 mm contenente 0,02% (p/v) 3-aminobenzoico (tricaina) per anestetizzare li. Dopo 5 min, trasferire gli embrioni alla piastra dell'agarosi overlaid con E3 mezzo contenente 0,02% (p/v) tricaina e allinearli con un orientamento per l'iniezione. Per il Mpeg1: Kaede transgenico linea prima anestetizzare gli embrioni in E3 Media contenente 0,02% (p/v) tricaina. Quindi selezionare embrioni che esprimono le proteine fluorescenti verde utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo.
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Caricare l'ago con circa 10 µ l della sospensione "Solo batteri" o batteri-microsfere utilizzando un puntale di microloader. Montare l'ago su un micromanipolatore collegato al micro-iniettore. Per l'iniettore usato qui (Vedi tabella materiali), utilizzare le seguenti impostazioni per le iniezioni di 2 – 3 nL: pressione: 300 – 350, pressione: 0, tempo: 2 ms.
Nota: Le impostazioni per il micro-iniettore dipendono l'iniettore utilizzato. Impostazioni di iniettore potrebbero essere necessario essere regolata per iniezioni dei batteri misti con biomateriali con altre forme o dimensioni.- Utilizzare aghi con la stessa apertura per l'iniezione della sospensione "Solo batteri" e la sospensione di batteri-microsfere. Se l'ago è rotto o intasato, sempre cambiare per un nuovo ago per ulteriori iniezioni.
- Inserire l'ago nel tessuto del muscolo di embrioni sotto un microscopio chiaro (Figura 1), ad un angolo di 45 ° – 60 ° tra l'ago e il corpo di embrioni. Regolare la posizione dell'ago nel tessuto spostandolo delicatamente avanti e indietro. Iniettare gli embrioni utilizzando un comando a pedale collegato al micro-iniettore.
- Dopo iniezione di batteri fluorescenti, segnare gli embrioni per infezione successo sotto un microscopio a fluorescenza stereo. Scartare il negativo di embrioni segnati (nessun batterio fluorescente visibile o non visibile microsfere fluorescenti). Mantenere gli embrioni individualmente in E3 media a 48 pozzetti. Aggiornare il mezzo ogni giorno.
5. frantumazione degli embrioni, segnando al microscopio e coltura quantitativa di batteri
- Punteggio ottenuto tutti gli embrioni microscopicamente la presenza di batteri fluorescenti utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo, a partire immediatamente dopo le iniezioni e ogni giorno successivo fino a quando gli embrioni sono scelti a caso per coltura quantitativa.
- In modo casuale selezionare alcuni embrioni infetti dal vivo (da 5 a 6 nello studio presente) poco dopo l'iniezione e trasferirli singolarmente separato 2 mL microprovette usando puntali sterili. Rimuovere il mezzo, lavare gli embrioni delicatamente con PBS sterile una volta e aggiungere 100 µ l di PBS sterile.
- Aggiungere microsfere di zirconio sterile di 2 – 3 (2 mm di diametro) per ogni flaconcino e schiacciare gli embrioni utilizzando l'omogeneizzatore (Vedi Tabella materiali) a 3.500 rpm per 30 s. cultura omogeneato quantitativamente come descritto al punto 1.3.
Nota: Altri omogeneizzatori possono richiedere impostazioni diverse. - Selezionare casualmente più embrioni nei giorni successivi dopo l'iniezione per coltura quantitativa secondo punto 5.3.
6. fluorescenza microscopia di progressione di infezione e l'infiltrazione delle cellule ha provocato negli embrioni di Zebrafish
- Anestetizzare gli embrioni come descritto al punto 4.2. Pipettare 500 µ l di una soluzione di PBS - 2% (wt) metil cellulosa in una piastra Petri contenente mezzo E3 con 0,02% (p/v) tricaina. Posizionare gli embrioni nella soluzione metil cellulosa e tenerli diritta e orizzontale.
Nota: Metil cellulosa soluzione viene utilizzata come una "colla", che grazie alla sua viscosità, può temporaneamente immobilizzare gli embrioni migliori orientamento per l'imaging. - Uso un microscopio a fluorescenza stereo dotata di campo luminoso, mCherry, proteina fluorescente verde (GFP) e UV filtri agli embrioni singoli immagine sotto impostazioni ottimizzate identiche (ad esempio, tempo di intensità, guadagno ed esposizione) a ingrandimento x 160 . Impostare il piano focale che il danno di tessuto causato tramite l'iniezione è a fuoco, utilizzando il filtro del campo luminoso. Impostare la profondità dello stack Z a 10 µm e passo dimensioni a 5 µm, che permette la registrazione di 3 immagini consecutive.
- Embrioni individuali di immagine una volta al giorno da 5 h post-iniezione fino al post-iniezione di 2 giorni. Escludere gli embrioni morti (nessun battito cardiaco o embrione parzialmente degradato) per ulteriori di formazione immagine e l'analisi. Mantenere gli embrioni individualmente in E3 media a 48 pozzetti. Aggiornare il mezzo ogni giorno.
7. analisi quantitativa dell'intensità di fluorescenza della progressione di infezione e l'infiltrazione delle cellule provocata mediante File di progetto oggetto J "Zebrafish-Immunotest"
- Scarica "Zebrafish-Immunotest" e il manuale dettagliato dal link: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, come descritto in un precedente studio33. In breve, aprire immagini per analisi con "Zebrafish-Immunotest", operante sotto il programma freeware Image J. In ogni immagine caricata, contrassegnare manualmente il sito di iniezione, basato sul danno tissutale osservato degli embrioni.
Nota: Il sito contrassegnato è utilizzato da "Zebrafish-Immunotest" come punto centrale per rilevare il picco di fluorescenza all'interno di una distanza di 50 µm. Il picco di fluorescenza rilevati viene quindi utilizzato come centro di una zona standardizzata (diametro di 100 µm) per la misura della fluorescenza. - Fare clic su "calcolo" nel menu oggetto J per eseguire le misure in fluorescenza per più canali, se applicabile, automaticamente per tutte le immagini. Esportare i dati e analizzare con metodi di test statistici appropriati.
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Representative Results
Il presente studio ha valutato l'applicabilità degli embrioni di zebrafish come modello animale vertebrato romanzo per indagare infezione biomateriale-collegata. Tecnica di microiniezione è stato comunemente utilizzato per iniettare diverse specie batteriche negli embrioni di zebrafish di causare infezione22,26,27,30,36. Utilizzando la procedura descritta nella Figura 1, S. aureus da solo o insieme con microsfere di 10 µm PS (PS10) sono stati iniettati nel tessuto muscolare di embrioni di zebrafish nello studio presente. Iniezione intramuscolare di S. aureus causato infezione dose-dipendente in embrioni (Figura 2). Le dosi iniettate erano vicino le dosi mirate sfida (giorno 0 nella Figura 2). Sono stati osservati solo piccole variazioni all'interno di gruppi. Embrioni iniettati con le dosi elevate sfida ha mostrate progressione variabile infezione al giorno 1 e 2 giorni dopo l'iniezione (Figura 2, 6000 e 2000 CFU). L'iniettato batteri Staphylococcus aureus sono stati sradicati o aveva proliferato e successivamente stabilito alti livelli di infezione all'interno degli embrioni. Questo è simile alla progressione dell'infezione di S. aureus dopo iniezione endovenosa in embrioni di zebrafish26segnalata. Embrioni iniettati con le dosi basse di sfida di S. aureus ha eliminato i batteri (Figura 2, 600 e 200 CFU). Questi risultati hanno indicato che la dose di sfida di S. aureus influenza fortemente la loro progressione di infezione negli embrioni di zebrafish.
Co-iniezione di batteri e microsfere è provocato da un numero maggiore di batteri iniettati dell'iniezione di batteri solo (dati non mostrati). Preparando l'inoculo batterico per le iniezioni "Solo batteri" a una concentrazione più elevata (circa 1,5 volte superiore) che la sospensione di batteri-microsfere, siamo stati in grado di superare la differenza nei numeri di CFU iniettato. In questo modo, è possibile inserire i numeri simili di batteri negli embrioni in presenza e in assenza di PS10 (giorno 0, Figura 3). I numeri di microsfere per iniezione variavano. Ad esempio, in uno dei nostri esperimenti, metà delle microsfere di 1 o 2 embrioni ricevuti per iniezione (12 su 25 embrioni nel gruppo10 PS + S. aureus ), alcuni ha ricevuto 3 o 4 (8 su 25 embrioni) e pochi ricevute microsfere di 5 a 7 (em 5 su 25 bryos). Tuttavia, tali variazioni non hanno influenzato i livelli delle risposte cellulari provocati, come riportato in un precedente studio33.
Successivamente, abbiamo studiato se la presenza di microsfere ha un impatto sulla progressione infezione negli embrioni di zebrafish sfidati con basse dosi di S. aureus. A tal fine, abbiamo iniettato circa 600 CFU di S. aureus- mCherry con o senza PS10. Abbiamo usato due metodi per studiare la progressione di infezione: (i) convenzionale cultura quantitativa degli embrioni infetti dopo la frantumazione e (ii) Il Punteggio di rilevazione microscopica ("segnando al microscopio") di batteri fluorescenti (S. aureus- mCherry). Abbiamo confrontato i risultati di questi due metodi. Il Punteggio è stato definito come "Sì o no" visibilità dei batteri fluorescenti negli embrioni, senza riguardo all'intensità di fluorescenza. I nostri risultati hanno mostrato che tutti gli embrioni con più di 20 CFU di S. aureus- mCherry erano positivi in microscopiche segnando (puntini rossi nella Figura 3). Per 600 CFU di S. aureus per embrione, la presenza di PS10 sembrava non influenza significativamente la progressione di infezione. Al momento tutti i punti, sia la frequenza di infetto embrioni (indicati sopra nella figura 3, dose challenge bassa) e il numero di CFU dopo lo schiacciamento non era differente per gli embrioni con o senza PS10 (Figura 3, dose challenge bassa). Ciò ha suggerito che le dosi elevate di sfida di S. aureus sono necessari per lo studio degli effetti potenziali di biomateriali sulla progressione di infezione negli embrioni di zebrafish. Quindi, abbiamo iniettato circa 1.000 CFU di S. aureus in presenza ed assenza di PS10 negli embrioni. Le marcature al microscopio, non ha evidenziato differenze nella frequenza degli embrioni infetti con e senza PS10 in qualsiasi punto del tempo (Figura 3, dose elevata challenge). La cultura quantitativa, tuttavia, ha mostrata più alti numeri CFU Estratto da embrioni in S. aureus + PS10 gruppo rispetto a quello Estratto da S. aureus -unico gruppo alle 2 giorni post-iniezione (Figura 3, alta dose Challenge).
Per quantificare l'estensione dell'infezione in presenza e in assenza di biomateriali in embrioni di zebrafish mediante analisi d'immagine, abbiamo registrato una serie di immagini che mostrano la progressione di infezione di S. aureus- mCherry (1.000 CFU / embrione) nella presenza e assenza di PS10 negli embrioni dal vivo nel corso del tempo (Figura 4A). Abbiamo anche registrato l'infiltrazione provocata di Kaede verde fluorescente che esprimono proteine macrofagi negli embrioni di quantificare la risposta delle cellule immuni (Figura 4B). Proteina fluorescente Kaede può subire la conversione di colore dal verde al rosso sotto esposizione a luce UV, a seconda del tempo di esposizione e l'intensità della luce39. Tuttavia, tale conversione del colore non è stata osservata sotto la condizione sperimentale utilizzata nello studio presente. L'intensità di fluorescenza dei batteri che infettano anche a partire da infiltrazione macrofagi all'interno di una zona standardizzata intorno al sito di iniezione è stata misurata dal nostro file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest", operano all'interno di Image J." Zebrafish-Immunotest"definisce una zona standardizzata con un diametro di 100 µm (cerchi gialli nella Figura 4) intorno a un punto indicato dell'iniezione. Negli embrioni, questa zona comprendeva la maggior parte dei batteri fluorescenti che risiedono nelle vicinanze delle microsfere iniettate, come pure i macrofagi infiltranti. La presenza di un biomateriale è stata indicata per influenzare entrambi iniziale suscettibilità all'infezione e immunitario le risposte delle cellule. Alle 5 h post-iniezione, infiltrazione di macrofagi in risposta a S. aureus solo era significativamente superiore in risposta a S. aureus + PS10 (Figura 5, l'infiltrazione del macrofago, 5 hpi). A 1 giorno dopo l'iniezione gli embrioni con PS10 ha mostrato livelli significativamente più elevati di infezione da S. aureus che embrioni senza PS10 (Figura 5, progressione di infezione, 1 dpi). Così, questi risultati quantitativi hanno dimostrato che la combinazione di registrazione di immagini di fluorescenza e il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" può essere utilizzata per quantificare la progressione di infezione e provocato la risposta delle cellule immuni in presenza di un biomateriale nel modello di embrione di zebrafish. Il modello consente di valutare le piccole differenze nelle risposte delle cellule immuni e livelli di infezione batterica in vivo, e richiede solo un microscopio a fluorescenza stereo (con registrazione di immagini) e l'accesso aperto "Zebrafish-Immunotest" per la valutazione.
Figura 1: schema procedura di co-iniezione di batteri-microsfere sospensione nel muscolo della coda degli embrioni di zebrafish. Questa figura è stata modificata da Zhang et al.,33 , con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: numero di CFU di S. aureus Estratto da embrioni di zebrafish iniettati con inoculi, che vanno da 6.000 a 200 CFU / embrione e valutati a post-iniezione 0 per 2 giorni. Le linee rosse rappresentano il numero mediano di CFU. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Numero di CFU e segnando al microscopio di mCherry esprimendo la proteina S. aureus (S. aureus- mCherry) in embrioni di zebrafish, valutati in diversi momenti. Dose bassa challenge: 600 CFU / embrione; Dose elevata challenge: 1.000 CFU / embrione; PS10: 10 µm PS microsfere; "+", embrioni iniettati con S. aureus- mCherry insieme a PS10; "-", embrioni iniettati con S. aureus- mCherry solo, quindi senza PS10. Gli embrioni erano microscopicamente ha segnati per batteri fluorescenti e selezionati in modo casuale per coltura quantitativa di batteri dopo la frantumazione degli embrioni al giorno dell'iniezione (giorno 0) e a giorno 1 e giorno 2 dopo l'iniezione. Embrioni microscopicamente segnati positivo e negativo per batteri fluorescenti sono mostrati in puntini rossi e neri, rispettivamente. I numeri di microscopicamente positivi-scoring embrioni divisi per il numero totale di embrioni segnati (frequenza di embrioni infetti) in ciascun punto di tempo sono indicati nella parte superiore del grafico. Differenze nelle frequenze di embrioni infetti e in un numero di CFU tra gli S. aureus + PS10 e S. aureus solo i gruppi in ogni punto del tempo sono state analizzate tramite la Fisher' esatta prova e test di Mann-Whitney, rispettivamente. p ≤ 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative la progressione di infezione di mCherry-esprimendo S. aureus (A, rossa) di registrazione in presenza e assenza di 10 µm PS microsfere (PS10, blu) e l'infiltrazione provocata di Kaede che esprimono proteine macrofagi (B, verde) in embrioni, da post-iniezione 5h (hpi) post-all'iniezione 2 giorni (dpi). Embrioni non trattate (NT) sono stati utilizzati come controlli. I cerchi gialli (100 µm di diametro) indicano la zona standardizzata al sito di iniezione per la quantificazione di fluorescenza utilizzando il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest'. La fluorescenza quantificata dei batteri e dei macrofagi è raffigurata in Figura 5. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione di fluorescenza di S. aureus infezione progressione e l'infiltrazione del macrofago provocata in presenza ed assenza di 10 µm PS microsfere (PS10) in embrioni di zebrafish da 5 ore post-iniezione (hpi) per 2 giorni dopo l'iniezione (dpi), utilizzando il progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" del file. Una zona standardizzata al sito di iniezione è stata utilizzata per la quantificazione della fluorescenza (con un diametro di 100 µm, indicato come i cerchi gialli nella Figura 4). Embrioni non trattate (NT) sono stati utilizzati come controlli. Differenze tra ogni due gruppi in ogni momento punto sono stati analizzati da Mann-Whitney test, *p ≤ 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è una grave complicazione clinica. Una migliore comprensione della patogenesi di BAI in vivo sarebbe fornire nuove conoscenze per migliorare la prevenzione e il trattamento di BAI. Tuttavia, corrente modelli animali sperimentali BAI come modelli murini sono costosi, laborioso e richiedono personale specializzato addestrato nelle tecniche chirurgiche complesse. Di conseguenza, questi modelli non sono adatti per alta analisi di rendimento. Poiché i requisiti per i modelli di embrioni di zebrafish sono meno complessi e costi in generale sono inferiori per modelli murini, lo studio presente ha valutato se gli embrioni di zebrafish possono essere utilizzati come un modello animale vertebrato romanzo per indagare BAI in vivo, complementare a i modelli dei mammiferi.
Per impostare il modello BAI embrioni di zebrafish, abbiamo sviluppato un protocollo di co-iniezione di batteri e microsfere basate su un metodo per iniezione intramuscolare di microsfere in embrioni descritto prima33. In questo modo, la maggior parte dei batteri sono presente nelle vicinanze le microsfere in embrioni, che imita l'interazione batteri-biomateriale che avviene durante o subito dopo l'impianto di biomateriali in esseri umani/mammiferi.
Per essere in grado di confrontare la progressione di infezione in presenza e in assenza di microsfere in embrioni di zebrafish, gli embrioni dovrebbero essere sfidati con simili numeri iniziali dei batteri con e senza le microsfere. Tuttavia, secondo la nostra esperienza, co-iniezione di batteri-microsfere sospensione comporta più batteri essere iniettati dell'iniezione della sospensione "Solo batteri". Per risolvere questo problema, il rapporto tra la concentrazione di batteri in sospensioni "Batteri-only" (senza le microsfere) ed in batteri-microsfere sospensioni deve essere adattato. Nello studio presente, la concentrazione di S. aureus nella sospensione "Solo batteri" dovuta essere circa 1,5 volte superiore alla concentrazione della sospensione di batteri-microsfere. Se questo rapporto vale anche per altre specie batteriche e altri biomateriali rimane da testare. Di nota, per iniettare i numeri simili di batteri con e senza microsfere, l'apertura degli aghi utilizzati per iniezioni di entrambi sospensione dovrebbe essere più vicino identici come possibile.
Diverse proprietà di un biomateriale come forma e dimensione, un ruolo importante nel determinare la sua iniettabilità e co-iniezione con batteri. Nello studio presente, abbiamo usato 10 µm (PS10) microsfere di polistirolo come biomateriali di modello. Secondo la nostra esperienza, le microsfere di dimensioni fino a 15 µm sono iniettabili per 3 giorni vecchi embrioni seguendo il protocollo sviluppati nel presente studio33. Per microsfere di dimensioni relativamente grandi (ad esempio, ≥ 10 µm), sconsigliamo l'uso di non-monodispersed o dalla forma irregolare microsfere/microparticelle che tendono a causare intasamento dell'ago. Se biomateriali in altre forme più rotonde e nei formati differenti sono scelti per essere utilizzati, loro iniettabilità deve essere testato. (Co-) iniettabile di microsfere e batteri, abbiamo utilizzato una soluzione di polivinilpirrolidone (PVP) 4% per facilitare la dissipazione. Questo può essere utile per l'iniezione di biomateriali con e senza batteri negli embrioni in generale.
Come è avvenuto per le iniezioni di microsfere solo33,40, i numeri di microsfere iniettate insieme a batteri negli embrioni variato per iniezione, per lo più comprese tra 1 e 4 microsfere per embrione. Tuttavia, poiché tali variazioni non hanno provocato le differenze nei livelli della risposta delle cellule immuni provocata in embrioni33, essi erano anche non dovrebbe influenzare gli effetti potenziali di microsfere sulla progressione di infezione. Tuttavia, sarebbero desiderare nuovi approcci permettendo le iniezioni di una singola microsfera (da solo o insieme con i batteri).
Abbiamo valutato se segnando microscopica della presenza di batteri fluorescenti può essere utilizzato come un "Sì o no" scoring system per analizzare la progressione di infezione negli embrioni dal vivo. Il criterio di un punteggio positivo al microscopio è stato definito come la presenza di batteri fluorescenti visibili, senza riguardo all'intensità di fluorescenza. Rispetto alla coltura quantitativa di batteri, i nostri risultati rappresentativi suggeriscono che segnando al microscopio può distinguere gli embrioni con 20 o più CFU di batteri Staphylococcus aureus da embrioni con un numero inferiore di CFU o nessuna infezione. Così, dal momento che solo i numeri bassi di batteri sono necessari per un punteggio positivo, questo metodo è quasi sensibile come coltura quantitativa. Dal momento che gli embrioni non devono essere sacrificate e non sono necessari per eseguire analisi di utilizzo di questo metodo High-end microscopi o sistemi di smistamento per fluorescenza, consideriamo microscopica segnando un metodo semplice ma affidabile per monitorare la progressione di infezione di batteri in embrioni dal vivo. Per analisi quantitativa del livello di infezione (piuttosto che il "Sì o no" sistema di punteggio come descritto sopra) e la risposta delle cellule immuni in singoli embrioni dal vivo, abbiamo applicato il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" per quantificare l'intensità di fluorescenza di i batteri fluorescenti e macrofagi fluorescenti registrarono nel corso del tempo. Abbiamo usato una zona standardizzata (con un diametro di 100 m) che circonda il sito di iniezione per misurare la fluorescenza, poiché questa zona è stata indicata da comprendere la maggioranza dei batteri e i macrofagi infiltranti. Un manuale dettagliato di "Zebrafish-Immunotest" è stato pubblicato precedentemente33,40. Della nota, "Zebrafish-Immunotest" è un plug-in accesso aperto per ImageJ, che può essere personalizzata dall'utente. Per esempio, il diametro dell'area di analisi e altri parametri di "Zebrafish-Immunotest" può essere liberamente modificato secondo il programma di installazione di studio (Vedi esempi nel link fornito nel passaggio 7 nel protocollo).
Al fine di mostrare i possibili effetti di infezione di miglioramento di biomateriali in embrioni di zebrafish, la dose di sfida di batteri deve essere valutata. Nello studio presente, abbiamo trovato che una dose di sfida di 1.000 CFU di S. aureus per embrione o superiore è necessaria. I livelli elevati di infezione da S. aureus embrioni con PS10 rispetto a quelli senza PS10 sono stati trovati i primi 2 giorni dopo l'iniezione, che indica che la presenza di biomateriali transitoriamente facilita la conseguenza di S. aureus negli embrioni. Se l'infezione rimane a livelli elevati in presenza di biomateriali a intervalli di tempo successivi dovrebbe essere studiati utilizzando vecchi embrioni sotto etico approvazione secondo le norme vigenti. Poiché la clearance di S. aureus in embrioni di zebrafish è dipenda principalmente dalla fagocitosi e l'uccisione di macrofagi e neutrofili23,24, la conseguenza di batteri potrebbe essere spiegata da una ridotta efficacia della fagociti per uccidere i batteri a causa della presenza di biomateriali. Ciò è in linea con la valorizzazione di ben noto rischio di infezione di biomateriali in pazienti2,4,15, anche comunemente osservata in modelli animali più complessi come mouse e altri modelli animali10 ,11,12,13. Oltre a infezione da S. aureus , progressione di infezione di S. epidermidis o altri agenti patogeni in presenza di biomateriali possa essere studiate seguendo il protocollo descritto nello studio presente. Dal punto di biomateriali, diverse proprietà del materiale (ad es. composizione chimica, , idrofobicità, rugosità e cariche di superficie) possono influenzare le risposte cellulari e/o interazione batteri-materiale41, 42. il nostro studio precedente ha mostrato che l'iniezione di un biomateriale (in presenza di PVP) ha provocato una forte infiltrazione del macrofago rispetto all'iniezione di PVP solo negli embrioni di zebrafish. Inoltre, gli embrioni di zebrafish hanno reagito diversamente a microsfere di poli (-caprolactone) e polistirolo33. Di conseguenza, iniezione di microsfere di diversa natura può anche avere effetti differenziali sul potenziamento dell'infezione, che può essere relativamente facilmente valutato secondo il metodo descritto qui.
Per un ulteriore sviluppo, questo modello BAI embrione di pesce zebra può essere modificato per un throughput elevato sistema con automatizzato robot iniezione27,43, analisi parametrica di oggetti complessi e l'ordinamento (COPAS) sistemi e throughput elevato RNA sequenza analisi27,44. Tali modelli BAI throughput elevato basato su embrioni di zebrafish possono essere utilizzati come animale intero sistemi per in vivo di screening e test di biomateriali antinfettivi (romanzo), nonché prove dell'efficacia di trattamenti antibiotici o altre strategie anti-BAI. Inoltre, la sopravvivenza intracellulare è una strategia importante di batteri di sopravvivere in presenza di biomateriali9,10,11,12,13. L'utilità degli embrioni di zebrafish per studiare l'infezione intracellulare è stato dimostrato in diversi studi36,46. Così, il nostro modello di embrione può essere utilizzata per studiare la sopravvivenza intracellulare di stafilococchi o altri patogeni intracellulari in presenza di biomateriali e strategie per il trattamento di tali infezioni intracellulari. Inoltre, l'ibridazione in situ tecniche45 può essere utilizzato nel modello per studiare l'influenza dei batteri o biomateriali o loro combinazione sull'espressione di geni particolari al sito di iniezione, che può essere utile per scoprire i geni marcatori per BAI.
In sintesi, lo studio presente indica il potenziale di embrioni di zebrafish con i metodi sviluppati qui per studiare l'infezione biomateriale-collegata in tempo reale in vivo. Questo modello di embrione di zebrafish pertanto può essere utilizzato per indagare nuovi biomateriali resistente all'infezione e promettente prevenzione e strategie di trattamento di BAI e di colmare il divario tra gli studi in vitro e in modelli animali più grandi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziariamente supportato dal progetto IBIZA del programma materiale biomedico (BMM) e co-finanziato dal Ministero olandese degli affari economici. Gli autori desidera ringraziare il Dr. Graham Lieschke da Monash University, Australia per fornire la linea transgenica di zebrafish (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2 mL pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri dish | Falcon | 353003 | |
| Petri dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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