Summary
マウス副腎の分離、組織を修正、セクション、それらを免疫蛍光染色を実行する方法をご紹介します。
Abstract
蛍光抗体法蛍光色素標識された抗体の雇用組織抗原の検出のための確立された技術、アプリケーションの広範なスペクトルです。抗原の検出は、複数の細胞のタイプの特性と同定のためことができます。副腎腺は発生学的起源の異なる 2 つの異なる組織、腎中間中胚葉由来外側皮質と神経によって構成する内分泌器官、腎臓の上に位置し、間葉系細胞の層でカプセル化された、家紋由来髄質。副腎髄質カテコラミン (アドレナリン、ノルアドレナリン) を生成するのに対し、副腎皮質ステロイド (すなわちミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、性ホルモン) が分泌されます。副腎研究を行いながら、異なる機能を持ったユニークな細胞を区別することが重要です。ここでプロトコルを提供副腎の細胞の種類を特徴付けるため蛍光抗体法の取得に必要な一連のステップのシリーズを説明する私たちの研究室で開発されました。まず、固定、処理およびパラフィン包埋組織の periadrenal 脂肪の微視的除去マウス副腎の解剖に着目します。回転式ミクロトームのティッシュのブロックの区分を述べる。最後に、私たちは最適な信号を達成するために非特異抗体の結合と蛍光の両方を最小限に抑えることを開発した副腎の蛍光汚損のためのプロトコルを詳しく説明します。
Introduction
免疫組織化学は、共役抗体1を検出する後続の染色技術および特定の細胞分子に対する抗体を使って組織のコンポーネントを検出するための手法です。この免疫組織化学プロシージャは、特定の固定を必要とする、特定の抗原のため多くの場合経験的に決定される組織の処理、組織および抗体利用2。固定は、組織とそれによってそのまま携帯および細胞レベル下の構造と発現パターンを維持することの「オリジナル」の状態を維持するために重要です。さらに処理およびプロシージャの埋め込みは、薄切り免疫組織学的研究に使用される区分のために組織を準備する必要があります。
免疫染色は発色や蛍光検出を実行できます。発色検出には、水溶性の基質を不溶性の着色された製品に変換する酵素の利用が必要です。この酵素は、抗体 (一次抗体) の抗原を認識する共役することができます、(すなわち、二次抗体) の一次抗体を認識する抗体にはそれをより頻繁に活用します。この手法は非常に敏感です。あるの酵素反応から生じる色の製品は、イメージングのため明視野顕微鏡だけを必要とします。ただし、共存して、1 つの色の沈着は他の 1 つの沈着を隠すことができるので 2 つのタンパク質を視覚化しようとしたとき、発色染色は適切なできません。共同染色の場合蛍光がより有利であると証明しました。蛍光抗体法の出現はアルバート ・ クーンズと付いている蛍光抗体と組織抗原を識別し、紫外光3下の断面組織でそれらを表示するシステムを開発した同僚に起因します。蛍光は励起後の光を発する蛍光体と共役抗体に基づいています。(No か少しオーバー ラップ) と異なる波長での排出量といくつか fluorophores が存在するため、この検出方法は複数のタンパク質の研究に最適です。
副腎は腎臓の上にあるし、間葉系の被膜に囲まれた 2 つの発生のコンポーネントによって特徴付けられる一対の臓器です。内側の髄質は、神経堤に由来はドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどのカテコールアミンを作り出す間、雌雄の中間中胚葉由来、外の副腎皮質はステロイド ホルモンを分泌します。副腎皮質は, 組織学的および機能的で分けられる各ゾーンの異なるクラスのステロイド ホルモンを分泌、3 つの同心円ゾーン: 外側球状 (zG) 生成ミネラルコルチコイド電解質の恒常性を調節して血管内ボリューム中間ゾナ副腎皮質 (zF)、直接、zG 下を; 血糖を増加するエネルギー店の動員を介してストレス反応を仲介するグルココルチコイドを分泌します。内部網状 (zR) を合成するセックス ステロイド前駆体 (すなわち,デヒドロエピアンドロステロン (DHEAS))4。
種間副腎皮質帯状のいくつかのバリエーションがある: 例えば、ハツカネズミは、zR を欠いています。M. 毛様体筋のユニークな生後 X ゾーンは、好酸性細胞質5小さな脂質に乏しい細胞によって特徴付けられる胎児の大脳皮質の残骸です。X ゾーンは思春期の雄マウスと妊娠の最初のメスのマウスの後に消えるかない繁殖雌6,7で徐々 に退化。また、蛇行と zG 展示物の厚さは、末梢幹・前駆細胞の組織が、zG に隣接すると種の間の変化をマークしました。他の齧歯類とは異なり、ラットは zG と zF の間目に見える未分化ゾーン (zU) 幹細胞ゾーンおよび/または一時的な前駆細胞の増幅のゾーンとして機能します。ZU はラットに固有またはより単に目立つように組織的な細胞群かどうかは不明な8,9です。
副腎皮質の細胞には、すべてのステロイド ホルモン10,11の前駆体としてコレステロールエステルを格納する脂肪滴が含まれています。 「妊」という用語は、コレステロールを介して一連のステロイド産生因子 1 (SF1) 式はステロイド ホルモン産生の潜在的なマーカー活動を含む酵素反応からのステロイド ホルモン生産プロセスを定義します。副腎、Sf1 式は12の皮質の細胞にのみ存在です。興味深い研究は、副腎皮質ステロイド ホルモン産生の潜在的な13セルにおける内因性ビオチンの式を発見しました。この特性をステロイド産生を区別するためにも用いることができるこれがビオチンとストレプトアビジンに基づく染色法、内因性ビオチンとストレプトアビジン、抱合抗体による検出のための高い背景の原因になります。他のと内にある、副腎、すなわち、内皮細胞、莢膜、髄質細胞の集団からの細胞。
交感神経節前ニューロンによって支配されている、副腎髄質は、エピネフリンとノルエピネフリンを含む粒状の細胞質で好塩基性細胞によって特徴付けられます。髄質細胞酸化14後茶色の色素を形成するカテコールアミン含有量が高いため「髄質」と呼びます。チロシンヒドロキシラーゼ (TH) は、カテコールアミンの合成、および副腎の律速段階を触媒する、延髄15でのみ表される酵素です。
ここでマウス副腎、パラフィンと区分、および蛍光抗体法を構成する細胞の種類を識別するために副腎のセクションに染色を実行するメソッド内に埋め込むための処理の隔離のためのプロトコルを提案する、副腎皮質と髄質。このプロトコルは、定期的に本研究で使用される複数の抗体を用いた免疫染色の研究室で標準です。
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Protocol
すべてのメソッドは、使用とケアの動物、ミシガン大学の大学委員会の援助の下で制度上承認されたプロトコルに従い行った。
1. 手術のための準備
- 手術前日、準備 4% パラホルムアルデヒド (PFA)/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。冷凍の因数の場合いずれかを解凍し、4 ° C で保存に進みます
注: 4 %pfa は 48 時間以上安定しています。
注意: PFA は有毒、皮膚と目に触れないように、適切な容器で処分します。 - 手術の日、はさみおよび 70% エタノール (エタノール) 鉗子を滅菌することによって手術器具を準備し、ペーパー タオルで乾燥させます。
- 1x PBS で 24 ウェル プレートに満たされた場所 (1 mL/ウェルで十分です)、氷のバケツに。
注: 副腎はこのウェル培養皿で手術後保持されます。
2. 副腎の解剖
- 機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認された標準的なプロトコル、次のマウスを安楽死させます。安楽死死 (たとえば斬首刑) を確保するための二次的な方法が必要です。
- イソフルランの過剰摂取によって安楽死呼吸が停止するまでにイソフルラン蒸気で満たされた部屋にマウスを置き、マウスをチャンバーから削除表面にそれを置くし、頸の転位を実行します。
注: ほとんどの安楽死方法は動物に苦痛の原因し、下垂体 - 副腎髄質カテコラミン放出の活性化の交絡変数を追加可能性がありますので、ストレス研究に適していません。このインスタンスで、斬首刑を採用する提案された手法です。
- イソフルランの過剰摂取によって安楽死呼吸が停止するまでにイソフルラン蒸気で満たされた部屋にマウスを置き、マウスをチャンバーから削除表面にそれを置くし、頸の転位を実行します。
- 仰臥位のマウスを置く、腹部および 70% のフランクの切開領域を消毒エタノール。
注: 一方、毛を剃ると、不稔が増加、この特定のアプリケーションの必要はありません。 - はさみを使用して腹部の真ん中、皮膚を切り取り、腹膜から皮膚を分離、カットの周りの皮膚をつまんで、(尾側と吻側) 2 つの反対の方向のそれを引っ張って、マウスを deskin します。それから後部左右側面に到達するまで、腹膜を切った。
- 周囲の脂肪組織の周りにマウス副腎カットを削除し、24 汚損プレート 1x PBS でいっぱいされ、氷の上に配置します。
3. ペリ副腎脂肪除去
- 解剖顕微鏡の下で基本ガラスの上の副腎を配置またはステージ プレートにペトリ皿光源の位置、表示倍率を選択、全体の副腎の明確なビューを取得するフォーカスを調整します。
注: 使用倍率は、個人の好みによって異なります。計画レンズ 1 X 30 X の合計倍率ズーム 3 倍、接眼レンズ 10 X 良い視野全体の腺を視覚化することができます。 - すぐに副腎の脱水を避けること、2 つの 25 G 針と周囲の脂肪組織を削除します。すべての脂肪を削除する前にこのような場合、移動戻る副腎井戸に含む 1x PBS で 1-2 分と脂肪除去プロセスを続行します。
- 1x PBS で 2 分の 2 x を洗浄します。
4. ティッシュの処理と埋め込み
- 4% で組織を修正する PFA/PBS 2 h のロッキング プラットフォームで 4 ° c。
- 削除、4 %pfa と洗浄 1x PBS で組織、4 ° C で 15 分間 3 倍
注意: PFA は有毒、有害廃棄物;化学のフードの下で慎重に処理し、有害廃棄物容器に廃棄する必要があります。 - 50% で副腎を孵化させなさい 2 h のロッキング プラットフォーム上の 4 ° C で江藤。
- 70% で副腎をインキュベートを最低 2 h ロッキング プラットフォーム上の 4 ° C で江藤。
注: 場合は埋め込み処理組織によらない、副腎に格納できる 70% EtOH 4 ° C で70% の長期貯蔵を避ける江藤と組織をできるだけ早く処理する手続より良い品質のサンプルを得られます。 - 副腎をガーゼでそれをラップし、カセットを埋め込み組織で囲む処理組織に備えます。ティッシュ プロセッサに移動する準備ができるまで 70 %etoh、4 ° C でストアで満ちている瓶にカセットを配置します。テーブル 1で報告されたようにプログラム ティッシュ プロセッサにカセットを挿入し、プログラムを実行します。
- 65 ° C で溶融パラフィンでいっぱい埋め込みステーションにカセットを転送します。冷却ステーションが利用できない場合は、横にある冷たい冷却トレイを配置します。
- 埋め込み型にラベルを付けるし、カセットを埋め込み組織を開きます。ピンセットのペアを使用して、ガーゼに包みを開けるし、埋め込み型のベースの中心に目的の位置で優しく、副腎を配置します。副腎に溶けたパラフィンを注ぐ。必要に応じて、それは金型内移動可能性がありますそれ以外の金型内での位置を確保するための鉗子で、副腎を保持します。
- 優しく冷却トレイに埋め込み型を移動して、パラフィンの硬化まで待ちます。その後、切断しやすく、涼しい場所で埋め込み型を格納します。
5. 回転式ミクロトームで、セクショニング
- ミクロトームが開始する前にクリーンであることを確認、すべて破棄されたパラフィン残留物を拭う、ナイフ (またはブレード) を削ったことを確認、オイルの内部メカニズム、必要に応じてブロック ホルダーを完全に撤回します。
- 一連の顕微鏡スライド ラベル (積極的に充電または組織の損失を防ぐためにコーティング (材料の表を参照))、37 ° C でスライド ウォーマー セットにそれらを置き、各スライドの上にいくつかのオートクレーブ タイプ 1 の純水を調剤。
- 5 μ m の切片厚を設定します。
- ブレード ホルダーのミクロトーム刃を挿入、ブレードの角度を制御、刃がホルダーにしっかりと固定されていることを確認、パラフィン ブロックとブロック ホルダーのクリアランスをチェックします。
- ブロック ホルダーを最高位置にもたらすと、可能であれば、操作ハンドルをロック、金型からパラフィン ブロックを削除、クランプでしっかりと固定ブロック ホルダーに入れます。ブロックの直面している表面とブレードの中心線の角度は約 20 ° にする必要があります。必要な場合は、パラフィン ブロックを再調整します。
注意: ブレードは鋭いです。 - 既にロックされている場合は、ハンド ホイールのロックを解除、その顔はミクロトームの刃の端と同じ高さまでパラフィン ブロックを下ろします。一定のリズムでハンドルを回転させます。パラフィンを削除して、副腎を公開する最初のトリミングを実行します。
- ハンド ホイールを回し続けなさいし、副腎の終わりまでセクションします。明視野または解剖顕微鏡を使用して、セクションで組織の存在を確認します。ブレードからリボンを外し、鉗子の別のペアの助けを借りて、スライド ガラスの上に置いた水の上に置きます。表面にリボンを配置し、慎重に、それを伸ばし、スライド マウント役に立つ場合があります。
- スライドは、ホット プレートで乾燥させてください。フラット スライド トレイにそれらを置き、一晩以上水がまだ存在する場合 37 ° C で焼きます。一度乾燥し、室温でのスライド] ボックスで、スライドを格納します。
- ミクロトームを使用するすべての機器を片付けて清潔。
6. 蛍光抗体法
- 免疫染色用のスライドを選択し、スライド ホルダーに配置。
- ホット プレートで pH を沸騰させる 2.0 で 0.01 M クエン酸が入ったビーカーをもたらします。バッファーのボリュームは、ビーカー サイズに依存し、(いくつか蒸発する必要が考慮する) を沸騰中にスライド上のセクションをカバーするために十分でなければ。アルミ箔でビーカーをカバーします。
注: 抗原検索の他の方法が利用できる (見なさい議論) です。 - キシレン 100 %2 スライドを deparaffinize x 各 5 分。次のシリーズを使用してスライドを水分補給: 100% EtOH 2 x 5 分、70% のエタノール 2 5 分 x タイプ 1 純水 5 分。
注: deparaffinization 後、それはセクションを乾燥させないことが重要: ティッシュ セクションする必要があります常に、プロシージャが終了するまでバッファーまたはソリューションで覆われるまたは組織構造を破損ことができます。 - 抗原検索のため金属スライド ホルダーにスライドを配置し、アルミ箔せずクエン酸を沸騰とビーカーにそれを挿入します。10 分間沸騰させてください。
- ビーカーをホット プレートから外し、冷ますために 20 分は副腎のセクションがまだバッファーで覆われていることを確認してください。
- ブロッキング液を準備します。代表結果に対して採用キット市販染色を使用のかどうか (材料の表を参照)、管内マウス Ig ブロッキング試薬とヤギ血清の 5 %1.25 mL の 1x PBS、1 滴 (約 45 μ L に等しい) を追加。ブロッキング液で 4 ° C または働きながら氷の上を格納します。
注: 使用される血清は、二次抗体のホスト種に依存します。ここでヤギに発生した二次抗体が使用されています。その他の抗体、血清濃度が必要かもしれません。経験的いくつかの濃度をテストすることによって正しい血清濃度を決定します。 - 1 × PBS と穏やかな揺動とロッカーにそれぞれ 3 × 10 分の洗浄を含む Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。
- 染色の加湿チャンバーを準備します。
- 優しく、1 つのスライドから PBS を振り払う過剰な PBS を削除する糸くずワイプでスライド底を拭きなさい。
- 特殊なマーカーを使用すると、疎水性のあるスライドについて、各副腎セクションで、ガラス表面をセクションにインク液の拡散を避けるために乾燥することを囲む円を描きます。必要に応じて、慎重に拭いて乾かして表面ください。加湿チャンバーにスライドを配置します。
- すばやく、ピペット 50 μ L (またはセクションをカバーするために十分な) 各セクションに解決を妨げるのです。室温で 1 時間インキュベートします。
注: 必要なソリューション ボリュームのブロック異なる場合があります。セクションがよくソリューションで覆われていることが重要です。 - 7.5 mL の 1x PBS で市販のキットから希釈溶液を調製、600 μ L 蛋白質の集中在庫ソリューションと 5% ヤギ血清 (またはその他血清およびブロック ソリューションで使用される濃度)。保管作業中氷 4 ° c または希釈のソリューションです。
- 希釈のソリューションに適切な濃度で一次抗体の希釈、一次抗体ソリューションを準備します。共同染色、新しい管で各抗体の因数を追加、軽く混ぜます。氷の上を使用する準備ができるまで抗体と抗体のソリューションを配置します。
注: ここで我々 は家兎抗 SF1 抗体とマウスで発生した反回抗体を採用しました。抗体を準備するには、作業ソリューション以下の指示に従って。- SF1 の作業ソリューションは、1 つの管で希釈溶液 (1.5 μ G/ml の最終的な集中) 999 μ L にアンチ SF1 抗体の 1 μ L を追加します。番目の作業ソリューションは、チューブで 1 μ L 反回抗体希釈液 (2-6 μ g/mL の推定最終的な濃度) の 499 μ L を追加します。
- SF1 + TH 抗体作業ミックスは、新鮮な管にピペット SF1 実用的なソリューションの 250 μ L と TH 作業ソリューションを 250 μ l 添加します。ピペットで穏やかに混合します。氷の上を格納します。
- 1x PBS を含む Coplin jar ファイルにスライドをコピーして穏やかな揺動とロッカーの 5 分の 3 x を洗います。
- スライドは、PBS、ピペット SF1 + TH 抗体作業ミックス (あるいは他の一次抗体の解決策) 各セクションでの過剰を拭き取り後加湿チャンバーに戻って配置加湿チャンバーを閉じるし、4 ° C で一晩を残して
- 次の日に、Coplin にスライド 1x PBS を含む jar ファイルし、穏やかな揺動とロッカーの 15 分の 3 x を洗うを移動します。
- スライドを洗いながら適切な濃度を使用して希釈液二次抗体溶液を準備します。共同染色を実行している場合は、新しいチューブに各二次抗体溶液の同量を追加します。ピペットで穏やかに混合します。氷の上を格納します。光からチューブを守るため、氷を使用する準備ができるまで保存できます。
注: ここでは、使用される二次抗体、488 nm 蛍光色素標識抗マウス ヤギの発生と 549 蛍光色素標識抗家兎ヤギで育った。二次抗体溶液希釈液 (1.2 μ g/mL の最終濃度) の 799 μ L で各二次抗体の 0.5 μ L を追加することによって準備されました。 - PBS の過剰を削除した後、加湿チャンバーに戻ってスライドを配置、すぐに副腎部に二次抗体溶液をピペット、加湿チャンバーを閉じる、光から保護します。室温で 1 時間インキュベートします。
- 1x PBS で Coplin jar 内のスライドを洗うし、光から身を守ることを確かめる穏やかなロッキング、ロッカーの 15 分の 3 x を洗ってください。
- 染色性が核の 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューションを準備: DAPI (20 mg/mL) 1 mL の 1x PBS で 1 μ L。
注: 青い蛍光核対比染色することもできますヘキスト染料を使用します。 - 副腎のセクションに DAPI 液をピペット、光から蓋をして 7 分間室温で孵化させなさい。
- 1x PBS で Coplin jar 内のスライドを洗浄し、スライドを光から保護しながら穏やかな揺動とロッカーの 5 分の 3 x を洗います。
- 直接光から守られる区域にカバーガラスを置き、下に置くし、60 μ L またはカバーガラスの表面に沿って蛍光抗体法に適した溶剤を取り付け約 3 滴をピペットします。
- 糸くずのワイプ、スライド カバー ガラスに向かって下向きし、ティッシュ セクションそれの取り付けエージェントとカバーガラスに直面するので、それへの平行の位置でスライドの背面を軽く拭きます。軽く、カバーガラスにスライドを押して、スライドとカバーガラスの間に気泡がトラップされたことはないかどうかを確認します。
- 必要に応じて、空気の泡と取付エージェントの過剰を削除するそれ以上の圧力を適用されます。
- 暗いコンテナーと 24 h (またはマウント剤の情報シートに示された時間) の最低室温でキュアのスライドを置くし、イメージングに進みます。
7. イメージング
注: カメラに接続されている蛍光顕微鏡検出および決定の波長で励起後の組織によって放出される蛍光のキャプチャに必要です。一方、明白なセカンダリを選択する抗体は螢と共役が励起し発光スペクトルが利用できる機器と互換性が重要です。イメージング設定顕微鏡と画像をキャプチャするために使用するソフトウェアによって異なります。副腎のセクションをイメージングに適用されるいくつかの基本的なルールなどを確かめて、露光時間、カメラのゲイン設定、および光源の輝度が一定に保たれます。
- 光源とカメラをオンに、製造元の指示に従ってイメージング ソフトウェアを起動します。
注: これらのアクションの順序は使用される機器によって異なります。 - ステージ上のスライドを固定、シャッターを開けて、スライド上の組織を識別するために核染色 (DAPI) チャネル、低倍率 (4 X) を使用して、顕微鏡の接眼レンズに探して: 副腎のセクションが小さいとその可視化は、いくつかの時間を必要があります。
- 高倍率 (10 倍) に変更、フォーカス、シャッターを閉じます。
注: 退色、信号の損失を引き起こすことができます光の下で不必要に長い博覧会を避けるために重要です。 - ソフトウェア コマンドを使用して、使用 (DAPI) の目的 (10 X) およびチャネルを選択し、露出時間を調整 (1 信号があまりにも強いまたは弱い場合に s を調整ことができます)。利用可能な場合、'2 X 2' の変換を得るために '中間'、20 MHz に読み出し速度' ビニング ライブ イメージング (取得しない) を設定します。使用ソフトウェア イメージングの終わりにスケール バーが表示されない場合、メニューからスケール バー オプションを選択し、バーの位置が。
- シャッターを開き、必要に応じてフォーカスを再調整、チャンネル (FITC、TRITC、DAPI) を切り替えます。顕微鏡が自動化されていない場合は、ステージを移動することがなく各チャンネルで副腎の写真を撮るし、使用中のチャンネルの選択を調整することを確認します。したらシャッターを閉じます。
注: は、採用の場合、ソフトウェアは自動的にそれらを保存されません設定を書き留めます。 - 画像を保存します。
注: マージされた画像よく作成できます顕微鏡のソフトウェアまたは他のグラフィック編集ソフトウェア パッケージを使用します。 - 高倍率および/またはセクションの他のエリアの画像を繰り返します。
注: 20 倍の倍率を頻繁には、短い露光時間 (すなわち、 800 ms) が必要です。 - 画像の最後には、適切な順序ですべての機器の電源をシャット ダウンします。
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Representative Results
図 1は、上記で説明したプロトコル全体の概略を表します。副腎はマウスから収穫される、解剖顕微鏡の下で隣接する脂肪組織が削除され、副腎は 4% で固定し、PFA。この手順の後副腎、処理されますと、パラフィンに埋め込まれた臓器を顕微鏡スライド上に堆積薄いスライスにカットするミクロトームの断面します。セクションの乾燥後蛍光抗体法が行われ、顕微鏡でのセクションが作成されます。
隣接する脂肪 (図 2A) の除去は、さらなる処理と副腎の断面を促進するため重要です。周囲の脂肪組織の成功の除去は、図 2B副腎は容易に検出、余分な脂肪が表示されていないに表示されます。重要ですこの手順中に、ただし、副腎を乾燥またはこれを聞かせしないように組織構造の損傷できます。乾燥は、副腎は、しわの外観 (図 2C) を引き受けると認識されています。1x PBS で副腎脂肪除去を続行する前に復元することによってこの問題を簡単に解決できます。
終わり結果は、次の図 3のとおりでこのプロトコルを得られます。蛍光イメージは、2 つの異なる倍率で副腎の免疫染色を示しています。ラベル、髄質の細胞の細胞質緑染色に対し、副腎皮質の細胞をラベル赤核 SF1 染色します。ステロイド ホルモン産生 (SF1 負) ではないので、青 (DAPI) で核染色によって外側のカプセルが付いています。
図 1: プロトコルの概略図。4% で修正される組織後に副腎を収穫、隣接する脂肪組織を除去する PFA、パラフィン包埋、処理し、断面します。セクションは、immunostained、蛍光顕微鏡を用いたイメージングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ペリ副腎脂肪の除去します。(A) 脂肪周囲の副腎は解剖顕微鏡の下で削除されます。(B) クリーンアップ後副腎。組織乾燥、(C) の例には、水分補給が必要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:副腎の蛍光イメージング。副腎皮質のマーカーとステンド グラス、副腎の (異なる倍率) で蛍光イメージングの例 (SF1、染色性が核)、副腎髄質 (TH、細胞質の緑) の。核 (DAPI) は青で表示されます。C: カプセル;CO: 皮質;m: 髄質。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | 駅 | 温度 | 期間 |
| 70% エタノール | 1 | RT | 1 h |
| 90% エタノール | 2 | RT | 1 h |
| 90% エタノール | 3 | RT | 1 h |
| 絶対エタノール | 4 | RT | 1 h |
| 絶対エタノール | 5 | RT | 1 h |
| 絶対エタノール | 6 | RT | 1 h |
| 絶対エタノール | 7 | RT | 1 h |
| キシレン | 8 | RT | 1 h |
| キシレン | 9 | RT | 1 h |
| キシレン | 10 | RT | 1 h |
| パラフィン ワックス | 11 | 62 ° C | 1 h |
| パラフィン ワックス | 12 | 62 ° C | 1 h |
| パラフィン ワックス | 13 | 62 ° C | 1 h |
表 1:ティッシュ プロセッサ プログラム。
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Discussion
このプロトコルでは、準備とともにマウス副腎の分離およびパラフィン包埋切片のマウス副腎の染色方法について説明します。
我々 がテストした他のプロトコルと比較して、この蛍光プロトコルは当研究室で使用される抗体の大部分に適して証明されています。しかし、特定のケースでそれは染色の結果を改善するためにいくつかの調整を必要があります。簡単に変更およびテストすることができます 1 つの変数は、固定の長さです。本研究室では、4% でインキュベーション PFA は異なります 1 h に 4 h 12-24 h16他の所で固定期間を延長中。私たちの手でただし、固定時間が長く増加バック グラウンド ノイズにつながった、日常的に私たちの研究で使用されるいくつかの抗体に最適でした。
抗原検索の pH も染色の成功の役割を果たすことができます。PH クエン酸 (pH 6)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、pH 8) などの酸性、アルカリ性と同様に他の社内作られたバッファーからトリス EDTA と市販ソリューションを採用することにより熱誘起エピトープ検索 (HIER) が実施されることができます。(pH 9) トリス (pH 10)。酵素治療は、抗原のアンマス キングのためのオプションも可能です。酵素 (たとえばプロティナーゼ K) の適切な濃度を含むソリューションと deparaffinized のスライドを限られた時間インキュベート HIER の代替方法をすることができます。ただし、酵素濃度を滴定しなさい以上消化することができます悪影響を組織17ので理想的なインキュベーション時間を決定するために不可欠です。
ブロック バッファーの選択はまたトラブルシューティングの別の変数です。ヤギ血清とこのプロトコル (内因性マウス IgG による高いバック グラウンドを防ぐために、マウス組織でプライマリ マウス抗体を使用するときこのインスタンスで便利) に記載されている市販のブロック バッファーの使用、ほかがあります。タンパク質溶液 (ウシ血清アルブミン (BSA) または乾燥したミルク) またはその他の商業的に使用可能なバッファーなどのオプション追加。バッファーに法を用いたビオチン ストレプトアビジンとビオチンなどに染色を妨げる物質が含まれていないことを確認しますが重要です。
副腎は、免疫染色、脂質の高い蛍光のために挑戦することができますしばしば高い脂質含量によって特徴付けられる内分泌器官です。また、マウスやラットから副腎皮質が蛍光細胞リポフスチン、範囲の色が黄色から茶色の色素粒体、非晶質材料豊富です。この問題を克服するために、スーダン黒い B (SBB) などの化合物は、lipofuscins18によって生成された蛍光を消すことができます。良い染色の結果を危険にさらすもう一つの要因は、血液細胞の存在です。ヘモグロビンは赤血球中に存在の波長の光を吸収する < 600 nm とすることができますその波長19,20にまたがる螢を妨げます。灌流のテクニックを使用して、組織の血管から血液細胞をクリアできます中、核 counterstaining を実行する前に pH 5 に 10 mM の銅硫酸塩の使用は不要な蛍光21を抑制することができます。
このプロトコルの重要なステップは、副腎の解剖です。副腎はその場所をその場で見つけるが困難にすることができます器官: マウスの腺が小さく、彼らの位置はやや変数。古い動物で特に副腎もプロトコルのこのステップの間に領域の明確なビューを持つことが重要ですこのため腺とその結果としての分離検出を妨げる脂肪組織によって囲まれています。ペリ副腎脂肪除去の除去は、繊細なステップです。特に注目は、カプセルを破裂しないように脂肪を切り離すに副腎に支払わする必要があります。腺も保たれなければならない PBS で湿った組織の損傷を避けるためにしている最中。
断面しているときのセクションでの副腎組織の小さな部分の存在を検出は難しい組織色素脱失による処理手順の後。顕微鏡は、肥えたワックスから組織の断面の間に非常に便利です。
パラフィン切片での免疫染色は、組織の形態を維持しながら興味の反応蛋白質の貴重な手法です。ここで紹介した方法は蛍光検出に基づいて、複数の一次抗体を用いる研究のための特に機能は、蛍光信号は光に敏感なすることができます簡単に失われたり、スライドが処理されない場合を弱体化正常 (すなわち顕微鏡の光への暴露または周囲の光に不必要な露出を延長)。さらに、我々 は時間をかけて蛍光信号自体の品質の低下を気づくことができます。この問題は、発色検出、あると長年にわたって可視化することができますを使用して回避することができます。このメソッドは、ただし、高い精度をラベリングと 1 つの研究でいくつかのタンパク質の同時表示など、蛍光検出の利点に欠けています。
パラフィン包埋処理および複数の組織サンプルを保管する便利な方法です。しかし、自分自身を埋め込むパラフィン処理組織は記者を標的とする特定の抗体を使用せずいくつかのトランスジェニック動物で表される内生的蛍光レポーターのイメージングのため適していません。凍結は、蛍光タンパク質の分解を避けるために、顕微鏡下で直接その可視化を許可する方法です。余分な抗体の使用を回避する利点を表すことができます。その一方で、凍結保存も制限があります組織形態に影響を与えるので• セクショニングのためまた別の機器が必要です、スライドおよびティッシュのブロックの貯蔵は冷凍庫のみで可能です。
撮像断面の組織の 1 つの主要な制限は、高空間解像度で構造コンポーネントのイメージを取得する能力です。実際、組織組成は光の透過性に影響を与える貧しい解決につながることができますので、画像の品質を決定する上で主要な変数です。副腎は、22の散乱光を引き起こす脂質の豊富な組織です。高脂質含量も、脳内の明快さ、バブ、iDISCO、3DISCO など組織クリア技術より良い画像と 3 D の組織再建23を可能にする組織の可視化を改善するために開発されています。これらの技術高品質画像データ、研究者を提供している組織の様々 な範囲に適応しているし、副腎イメージングもこれらの方法を採用していきたい、将来。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は彼の有用な提案およびこのプロトコルの確立でテクニカル サポートを博士モハマド ズバイルをありがちましょう。この作品は、国立糖尿病・消化器病・腎臓病、健康研究助成の国立機関 2R01-DK062027 (G.D.H) にによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
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