Summary
Эта статья представляет собой систему неинвазивной биомониторинга для непрерывной записи и анализа деятельности сердца и опорно-раки. Эта система состоит из ближнего инфракрасного оптического датчика, видео слежения модуль и программного обеспечения для оценки раков сердцебиения, которое отражает его физиологическое состояние и характеризует раков поведение во время колебания пульса.
Abstract
Раков – стержневые водной организм, который служит как практический биологической модели для поведенческие и физиологические исследования беспозвоночных и полезным биологический индикатор качества воды. Даже несмотря на то, что Раки нельзя задать напрямую вещества, которые вызывают ухудшение качества воды, они могут немедленно (в течение нескольких секунд) предупреждают людей ухудшения качества воды через острые изменения в их сердца и поведенческих деятельности.
В этом исследовании мы представляем неинвазивный метод, который достаточно прост быть выполнены в различных условиях объясняется сочетанием простоты и надежности в одной модели.
Этот подход, в котором биологические организмы, интегрированы в процессы экологической оценки, обеспечивает надежную и своевременную сигнализации для предупреждения и предотвращения ухудшения острый воды в окружающей среде. Таким образом это неинвазивный система, основанная на раков физиологические и этологическая параметр записи было проведено расследование для выявления изменений в водной среде. Теперь эта система применяется в местной пивоварне для контроля качества воды, используемой для производства напитков, но он может использоваться в любой обработки воды и снабжения объект для оценки качества воды непрерывного, в реальном времени и для регулярных лабораторных исследования рака сердца физиологии и поведения.
Introduction
Тема приложения водных организмов, как модель организмов для различных лабораторных исследований1,2 , так и инструменты для мониторинга промышленных и природные и экологические воды качества3,4 , как представляется, быть хорошо изучены. Тем не менее эта тема все еще отметить интерес для людей, независимо от того, принадлежат ли они к научному сообществу или других профессий. Несмотря на существование целого ряда передовых методов для мониторинга определенных параметров (так называемые «биомаркеров»)5,6,7,8, наиболее важных требований для выбора индикатор состоит из трех простых факторов: (i) простота, надежность (ii) и (iii) общей доступности.
Раки, как основных представитель пресноводной фауны, отличает себя потому, что он встречается во всем мире, широко распространена и, в большинстве случаев9, имеет достаточно большие и жесткие панцирь, подходит для манипуляции. Этот ракообразных принадлежит к группе выше беспозвоночных, которые обеспечивают достаточное развитие жизненно важных физиологических систем и соответствующих органов, в то же время, поддержание сравнительно простой организации10.
Методы на основе оценки ряда раки биологических и поведенческих параметров, как описано в научной литературе, значительно способствовали развитию исследований биомониторинга и раков в целом. Большинство имеющихся в настоящее время инвазивных методов для измерения пульса раков основаны на записи ЭКГ, которые требуют сложных и точных хирургическая процедура11,12,13; такие манипуляции могут вызвать значительный стресс и может требовать длительной адаптации, раков. Кроме того, не известно, как долго раков может нести такие электродов и ли он будет успешно линяют при проведении такого вложения. Описанные неинвазивные методы основаны на plethysmographic записи, которые осложняются сложности оборудования и требуют цепи принадлежности для фильтрации сигнала14 и усиления или точные и дорогих оптические компоненты15 ,16.
В этом исследовании мы описали подход, который способствует существующие результаты и предлагает новые альтернативы для совершенствования нынешних процедур измерения ЧСС раков. Среди преимуществ являются (i) быстрый и неинвазивной вложения, которое не требует длительной Физиологическая адаптация; (ii) раки возможность нести датчика в течение нескольких месяцев от линьки для линьки; (iii программное обеспечение, способных осуществлять мониторинг в реальном времени сердечной и поведенческих деятельности и оценки данных, полученных одновременно от нескольких раков; (iv низкий производства цена и простота. Системы биомониторинга, что мы описываем позволяет неинвазивной и непрерывный мониторинг деятельности раков сердца и опорно-двигательного аппарата на основе изменений в раки etho физиологические характеристики. Эта система может легко применяться в лабораторных экзаменов раков сердца физиологии и этологии, помимо промышленной реализации для контроля качества воды на лечение и снабжения водой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. раков выбор
- Для того, чтобы успешно применять нынешний подход к раков, выберите соответствующих взрослых особей с достаточных размеров панцирь, (который является панцирь длиной не менее 30 мм) для крепления датчика, визуально изучить его за отсутствие заболеваний и проверьте ли он поднимает обе chelae, когда он коснулся. Вышеупомянутые параметры указывают право состояние здоровья раков.
Примечание: Если несколько раков, как ожидается, будут использоваться в ходе судебного разбирательства и подвергаются те же условия, экспериментальная группа должны быть сформированы на основе нескольких параметров: (i) аналогичного веса и длины; (ii) сопоставимые сердечного ритма; (iii) произносится как ночной активности; (iv) регулярное питание; (v) между линьки периода17. Иногда трудно определить, является ли раки рядом линьки путем измерения сердечного ритма или зрительной или тактильной экзамены только; Таким образом анализ содержания общего белка гемолимфа раками может быть полезным. Содержание белка, как ожидается, будет выше, когда ближе к линьки чем между линьки государства18раков.
2. запись раков сердечной деятельности и поведения
-
Для того чтобы измерить неинвазивно раков ЧСС, предварительно Подготовьте датчик для этой процедуры. До этого положить раков в бак с водой и дайте ему акклиматизироваться там на несколько дней, как подготовка датчик19 также займет несколько дней.
- Осево пара ИК светодиод (LED) с фототранзистора. Присоединить оптический датчик цепи на доске; Это потребует питания 5 V. Для подключения к LED место 200 Ω резистор на доске датчик ИК; чтобы подключить фототранзистора, место резистор 220 Ω на доске.
- При подключении к раков, выход датчика модулируется на величину гемолимфа заполнение раков сердечной мышцы и рассеивает падающий свет от LED. Для того, чтобы избежать взаимных помех освещенная IR света, светодиод и отражение ИК свет от сердца раков, который получил Фототранзистор, место небольшой стеной (0.5 x 1,5 x 4 мм, толщина х высота x ширина) из черного пластика антистатические Светодиод и Фототранзистор.
- Светодиод в водонепроницаемый пакет и покрывают поверхность датчика с водонепроницаемый диэлектрической гель со стороны рядом панцирь для защиты электронных компонентов от повреждений (рис. 1). Дайте высохнуть в течение 3 дней для того, чтобы получить лучшие защитные свойства геля.
- Для аналогового сигнала приложите тонкие гибкие кабели (длиной около 3 м) с датчиком и подключитесь к аналого цифрового преобразователя (АЦП); от этого, цифровой сигнал будет передана персональный компьютер через USB интерфейс, на который указывают сведения о раков сохраняется сердечной деятельности, проанализированы в реальном времени со специальным программным обеспечением (см. Таблицу материалы) и хранятся Далее подробный анализ.
- Как только датчик готовится, приложите его к раков. Чтобы сделать это, включите компьютер и запустить программное обеспечение. Определите количество раки должны быть установлены датчики и записанные сердечного ритма, чтобы быть сохранены в файле Дата.
- Удаление раков из воды и протрите его дорсальной панцирь стороне с бумажным полотенцем. Обертывание chelae и живота раков в бумажное полотенце для того, чтобы избежать повреждения человеческой рукой и ликвидации дополнительного стресса на раков, вызванных тепло человеческих рук.
Примечание: Не используйте предыдущие охлаждения раков на льду или в морозильнике для иммобилизации до манипуляций с креплением датчика. Разница в температурах приводит к раков дорсальной поверхности плач который, в свою очередь, приводит к ненадежной датчик крепления и быстрый клей отряд из раков панцирь. - Подготовка поверхности (то есть, взять маленький плоский кусок пластика или оторвать кусок липкой ленты и исправить ее в таблицу) и палки для смешивания клей. Отожмите две небольшие капли (диаметром около 0,5 см) от трубы A и B, содержащий эпоксидный клей и быстро перемешайте их.
- Прикрепите датчик к спинной панцирь речных раков и попытаться найти место, в котором будет максимальная амплитуда сигнала сердца. Держите раков с датчиком в одной руке и, используя другой свободной, капнуть каплю смешанного клея на каждом из четырех вспомогательных провода, расположенные на датчик (исправить их между шаги 2.1.1 и 2.1.4.). Не перемещайте датчик по крайней мере 5 минут до тех пор, пока клей затвердеет (упрочнения клея зависит от окружающей температуры и влажности).
Примечание: При установлении в сенсоре панцирь речных раков, тщательно изучить весь сердечной области со стороны панцирь с целью определения области с лучших (максимальный) сердечной сигнала амплитудой. Это поможет программное обеспечение для предоставления более точного вычисления сердечного ритма. - Сенсорных клей с помощью свободной рукой и если это не липкий, положить развернул раков с присоединенного датчика (рис. 2) в поле без воды за несколько минут до тех пор, пока клей высохнет.
Примечание: Оптимальная температура для раков и клей манипуляции колеблется от 18 до 22 ° C. При этих температурах клей затвердевает в течение 5-7 мин и полностью сухой в течение 8-10 мин. При более низких температурах произносится меньше стресса в раков; Однако, клей необходимо больше времени для упрочнения, около 15-20 мин при 15 ° C и 10 ° C, соответственно. При более высоких температурах, особенно выше 25 ° C клей затвердевает в течение 3 мин, но раков подвергается гораздо больше стресса; Поэтому старайтесь свести к минимуму воздействие ракообразных в экстремальных условиях без воды. - Перед перемещением раков обратно в бак, окуните его головогрудь в воду несколько раз с короткими интервалами в несколько секунд для того, чтобы разрешить сброс воздуха, который накоплен в жабры, и оставить раков в воде примерно 1 час для удаления любых избыточных химических веществ. После завершения этого процесса, отпустите раков в воду и позволить ему акклиматизироваться на одну-две недели в экспериментальных условиях, в зависимости от наблюдаемых физиологических показателей. Оптимальное водообмена во время адаптационного периода это каждый день.
Примечание: Характеристики раков, которые приспособиться и находятся в работоспособном состоянии включают выраженный суточный сердечной и опорно-двигательной деятельности, регулярное питание и расходы большинства дневного света в специализированный приют (если предусмотрено).
3. камеры и настройка программного обеспечения
- Запуск программного обеспечения; видео камеры автоматически включится.
- Выберите опцию обнаружения движения, тщательно выявлять области каждого танка на экране и программное обеспечение будет начать отслеживать поведение и увязки его с записями сердечной деятельности.
Примечание: Модуль обнаружения движения раков состоит из видео камеру, которая отслеживает поведение раков снизу бака и программное обеспечение, которое сочетает в себе поведение с сердечной деятельности. Данные из модуля используются для облегчения более точную обработку данных сердечной деятельности, устраняя периодов, в которых раков демонстрирует локомотивов высокой активности. Внезапный раков движений (то есть, реакция бежать или кормления инициации) может привести к колебания или короткое время шипы в сердечной сигналы, которые могут уменьшить точность расчетов сердечной интервал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В результате мы получили сочетание раков деятельности сердца и поведенческих, записываются и сохраняются в файл txt формата (рис. 3). Кроме того количество экспериментальной раков, даты и частота дискретизации, файл состоит из трех столбцов: (1) постоянное время в формате чч; (2 Частота сердечных сокращений, автоматически рассчитывается в ударах в минуту; (3 локомоции зарегистрированы как отсутствие (0) или наличие (1) любого движения. Когда раки было неактивным, ноль был назначен ячейка отвечает за движения, и когда он переехал, затем номер один появилась в соответствующей ячейке. При непрерывно записи, файл данных был автоматически создан каждый день в 00:00 часов (12:00 утра). Важно включить локомоции, поскольку это могло стать причиной изменения частоты сердечных сокращений (рис. 4). После 10 s, запах пищи (молотый, отфильтрованные и разбавленных Chironomidae личинки) был доставлен в бак, содержащие раков, с использованием перистальтического насоса. В 14 s, раков признали стимул и его частота сердечных сокращений, несколько снизилась благодаря так называемой ориентации ответ. После 20 s, сердечного ритма увеличилась, что приводит к снижению сердечного интервалов. 26 s, раков, двинулась к стимула источник, и физиологического возбуждения, вызванные запах пищи и начало передвижения привели к увеличению существенной сердечного ритма. В 37 s, наблюдается также резкое раков движения. Кроме того локомоции может существенно способствовали росту сердечного ритма во время раков реакции на определенные стимулы (рис. 5). Нарушается раки обычно имеет увеличение частоты сердечных сокращений, как видно во время интервала 30-40 мин с случайные локомоции. Однако в течение 45 до 50 мин интервал, гораздо более произносится локомоции. Это передвижение способствовали сердечного ритма, что значительно выше, чем видели в период с снижение локомоции. Если передаются данные из файла в другое приложение или выше алгоритм программирования используется, данные, содержащие только сердечной деятельности раков может получить и впоследствии обработаны при необходимости (рис. 6). ЧСС ненарушенных раков характеризуется монотонно амплитуда кривой сердцебиение и, приблизительно равно сердечная интервалы между каждым сердечной пик.
Чтобы проанализировать раков поведения (такие как прошли расстояние, предпочтение определенной области в танк или арена и передвижения скорости), можно было бы обмениваться текущей камеры с стандартной видеокамеры с плоской широкоугольный объектив, как в настоящее время используются камеры не сделать запись, но просто треков передвижения. В качестве альтернативы можно использовать запись с любым из онлайн приложений для ловли видео с экрана.
Рисунок 1 : Неинвазивный инфракрасный оптоэлектронных датчиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Сигнал раков, Pacifastacus leniusculus, удерживая датчик на его панциря. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Пример данных файла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Раки сердцебиения во время смены от нормальных до нарушается условия при воздействии на запах пищи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Сердечного ритма и передвижения деятельности раков в ненарушенных (0-30 мин) и условий нарушается (30-60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Спокойно раков ЧСС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Широко предлагает что измерение некоторых физиологических параметров (например, сердце или интенсивность вентиляции или оба) это более надежный метод для записи раков реакциях чем оценки поведенческих реакций, которые происходят не всегда сразу же11. Однако очевидно, что наиболее эффективный подход для оценки реальных раков реакции на изменения окружающей среды является сочетание сердечной деятельности и поведение записей, поскольку что делает его можно увидеть причины для раков пульса изменения и ли или не они происходят вследствие химических изменений в окружающей среде или вследствие передвижения посвящения. В ходе мониторинга качества воды, имеет решающее значение для ликвидации всех внешних влияний на изменения в физиологических маркеры раков, включая резкие движения, которые имеют все большее влияние на частоту сердечных сокращений, но не представляют сигнал для системы биомониторинга.
Еще одна возможность для содействия более точным и информативным сердцебиение оценки являются хронотропной и анализ инотропной параметр раков, сердечной деятельности касаются главным образом конкретных фигур в раков сердца сигналы19. Такой анализ подтвердил, что даже когда наименьшая только несколько ударов в минуту, некоторые из вторичных параметров можно указывать значительные изменения в раков сердечной деятельности19.
Несмотря на ряд преимуществ в использовании описанный подход исследования вокруг мониторинг раков переехал к абсолютной минимизации тактильные раков манипуляций. В недавно разработанных бесконтактные системы20ликвидация датчиков и их соответствующих проводов означает, что Раки любого размера могут использоваться для мониторинга процедуры. Это также можно хранить несколько раков в одной экспериментальной области, поскольку отсутствие каких-либо проводов предотвращает запутывания проводов и ограничений на передвижение раков. Раков будет нести только две крошечные кусочки высоко светоотражающая, указывающее сердечной области. Эти кусочки ленты могут быть прикреплены к раков даже после несколько после линьки дней. Раки сердечной деятельности и поведения записываются на видео камеру и проанализированы в режиме реального времени посредством Координационного программного обеспечения. Наряду с других технических достижений измененный подход приведет к значительным снижением цены системы мониторинга за ограниченная.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики-проектов «CENAKVA» № CZ.1.05/2.1.00/01.0024 и «CENAKVA II'' № LO1205 под устойчивости национальной программы я, Грант агентством Южно-чешского университета в České-Будеёвице (012/2016/Z) и агентство по субсидированию Чешской Республики (№ 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
- do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
- Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
- Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
- Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
- Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
- Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
- Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
- Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594 (2009).
- Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
- Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
- Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
- Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
- Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
- Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
- Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
- Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
- Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).
