Summary
Dieser Artikel stellt eine nicht-invasive Biomonitoring-System für die kontinuierliche Aufzeichnung und Analyse der Krebse Herz- und motorischen Aktivitäten. Dieses System besteht aus einem Nah-Infrarot-optischen Sensor, Video-Tracking-Modul und Software für die Bewertung der Krebse Herzschläge, spiegelt seine physiologischen Zustand und Krebse Verhalten während der Herzschlag Schwankungen charakterisiert.
Abstract
Ein Krebs ist eine zentrale Wasserorganismen, die praktischen biologischen Vorbild für Verhaltens- und physiologische Studien von wirbellosen Tieren und als ein nützlicher biologischer Indikator für Wasserqualität dient. Obwohl Krebse direkt der Stoffe, die Wasser Beeinträchtigung verursachen angeben können, können sie sofort (innerhalb von wenigen Sekunden) Menschen Wasser Qualität Verschlechterung über akute Veränderungen an ihren Herz-Verhaltens warnen.
In dieser Studie stellen wir eine nicht-invasive Methode, die einfach genug, um unter verschiedenen Bedingungen durch eine Kombination aus Einfachheit und Zuverlässigkeit in einem Modell umgesetzt werden.
Dieser Ansatz, in dem die biologischen Organismen in Umweltbewertung Prozesse umgesetzt werden bietet einen zuverlässigen und termingerechte Alarm für Warnung und Verschlechterung der akuten Wasser in einer Umgebung zu verhindern. Daher, dieses nicht-invasive System basierend auf Krebse physiologischen und ethologischen Parameter Aufnahmen für die Erkennung von Veränderungen in einer aquatischen Umgebung untersucht. Dieses System wird nun bei einer lokalen Brauerei für die Kontrolle der Wasserqualität für die Getränkeproduktion verwendet angewendet, aber es kann jederzeit Wasserbehandlung und Versorgung Anlage verwendet werden, für kontinuierliche, Echtzeit-Wasser Qualitätsbewertung und regelmäßige Labor Untersuchungen der Krebse kardiale Physiologie und Verhalten.
Introduction
Das Thema aquatische Organismen Anwendungen, als Modellorganismen für verschiedene Labor Untersuchungen1,2 sowie Tools zur Überwachung der Industrie und Natur/Umwelt Wasser Qualität3,4 , scheint gut untersucht werden. Dennoch ist dieses Thema noch von bemerkenswert Interesse für den Menschen, unabhängig von der Zugehörigkeit zu der wissenschaftlichen Gemeinschaft oder zu anderen berufen. Trotz der Existenz einer Reihe von fortschrittlichen Methoden für die Überwachung bestimmter Parameter (so genannte "Biomarker")5,6,7,8, die wichtigsten Anforderungen für die Auswahl einer Indikator besteht aus drei einfachen Faktoren: (i) Einfachheit, Zuverlässigkeit (Ii) und (Iii) allgemeinen Verfügbarkeit.
Krebse, besticht als wesentlicher Vertreter der Süßwasser-Fauna, denn es sich weltweit findet, weit verbreitet ist, und in den meisten Fällen9, einen ausreichend großen und harten Panzer geeignet für Manipulation hat. Dieses Krustentier gehört zur Gruppe der höheren Wirbellosen, die ausreichende Entwicklung wichtige physiologische Systeme und jeweiligen Organe während zur gleichen Zeit Pflege eine relativ einfache Organisation10bieten.
Basierend auf der Beurteilung des Bereichs der Krebse biologische und/oder Verhaltensstörungen Parameter, wie in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Methoden haben zur Entwicklung des Biomonitoring und Krebse Studien im Allgemeinen wesentlich beigetragen. Die meisten derzeit verfügbaren invasiven Methoden für Krebse Herzfrequenz Messungen basieren auf EKG-Aufzeichnungen, die einen komplexen und präzisen chirurgischen Eingriff11,12,13erfordern; solche Manipulationen können erheblichen Stress zu verursachen und erfordern längere Anpassung durch die Krebse. Auch, es ist nicht bekannt, wie lange ein Krebs solche Elektroden tragen kann und ob es erfolgreich mausern wird während der Durchführung einer solchen Anlage. Die genannten nicht-invasiven Methoden basieren auf graphische Aufnahmen, die durch Hardware Komplexität erschwert werden und erfordern eine Klimaanlage-Schaltung für Signal Filterung14 und eine Verstärkung oder präzise und teure faseroptische Komponenten15 ,16.
In dieser Studie haben wir ein Konzept, das trägt dazu bei, vorhandene Ergebnisse und bietet neue Möglichkeiten zur Verbesserung der derzeitigen Krebse Herzfrequenz Messung Verfahren beschrieben. Zu den Vorteilen gibt es (i) eine schnelle und nicht-invasive Befestigung, die keine längere physiologische Anpassung erfordert; (Ii) Krebse seine Fähigkeit des Sensors innerhalb von wenigen Monaten von Häutung zu Häutung; (Iii) die Software, die Überwachung in Echtzeit Herz- und Verhaltens-Aktivitäten und die Auswertung der Daten, die gleichzeitig von mehreren Krebse; (iv) eine geringe Produktion Preis und Einfachheit. Das Biomonitoring-System, das wir beschreiben erlaubt die nichtinvasive und kontinuierliche Überwachung der Krebse Herz- und Bewegungsorgane Aktivitäten basierend auf Änderungen im Krebse Etho-physiologischen Eigenschaften. Dieses System kann leicht in Laboruntersuchungen der Krebse kardiale Physiologie und/oder Ethologie, neben industriellen Implementierungen für die Kontrolle der Wasserqualität an Wasser-Behandlung und Versorgung-Einrichtungen angewendet werden.
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Protocol
(1) Krebse Auswahl
- Um erfolgreich das derzeitige Konzept für Krebse gelten, wählen Sie den jeweiligen adulte Tiere mit ausreichend Carapax-Größen (die eine Panzerlänge von mindestens 30 mm) zur Befestigung des Sensors, visuell für die Abwesenheit von Krankheiten zu untersuchen und überprüfen ob es beide Scheeren hebt, wenn es berührt wird. Die oben genannten Parameter angeben ein förderfähigen Staates der Krebse Gesundheit.
Hinweis: Wenn mehrere Krebse werden voraussichtlich im Rahmen der Prüfung verwendet werden und sind zu den gleichen Bedingungen ausgesetzt, die experimentelle Gruppe sollte gebildet werden basierend auf mehrere Parameter: (i) ähnliches Gewicht und Länge; (Ii) vergleichbare Herzfrequenz; (Iii) ausgeprägte nächtliche Aktivität; (iv) regelmäßige Nahrungsaufnahme; (V) Häutung Inter Zeitraum17. Manchmal ist es schwer zu bestimmen, ob ein Krebs in der Nähe von Häutung durch die Messungen der Herzfrequenz oder visuelle oder taktile Prüfungen nur; Daher können die Analysen der Krebse Hämolymphe Gesamtproteingehalt hilfreich sein. Protein-Inhalt wird voraussichtlich höher sein, wenn die Krebse kurz vor Häutung als Inter Häutung Zustand18steht.
2. Aufzeichnung der Herzaktivität Krebse und Verhalten
-
Um Krebse Herzfrequenzen nicht-invasiv zu messen, vorläufig bereiten Sie den Sensor für dieses Verfahren. Davor ein Krebs in den Tank mit Wasser und lassen Sie es dort für ein paar Tage zu gewöhnen, wie die Vorbereitung des Sensors19 auch ein paar Tage dauern wird.
- Axial zu zweit ein IR - Leuchtdiode (LED) mit einem Fototransistor. Legen Sie die optische Sensorschaltung auf ein Brett; Sie benötigen eine Spannungsversorgung von 5 V. Legen Sie für die LED-Anschluss einen 200 Ω Widerstand auf der IR-Sensor-Brett; um den Fototransistor anzuschließen, legen Sie einen 220 Ω Widerstand auf dem Brett.
- Wenn die Krebse zugeordnet, die Sensor-Ausgang moduliert wird, um den Betrag der Hämolymphe füllen die Krebse des Herzmuskels und streut ein einfallendes Licht von der LED. Zur Vermeidung von gegenseitigen Störungen der beleuchteten IR-Licht von der LED und die reflektierte IR-Licht aus dem Herzen der Krebse, die von den Fototransistor empfangen wird, legen Sie eine kleine Mauer (0,5 x 1,5 x 4 mm, Dicke x Höhe x Breite) schwarze antistatischen Kunststoff zwischen der LED und den Fototransistor.
- Legen Sie die LED in einem wasserdichten Gehäuse, und bedecken Sie die Oberfläche des Sensors mit dem wasserdichten dielektrische Gel seitlich neben dem Panzer zum Schutz der elektronischen Bauteile vor möglichen Schäden (Abbildung 1). Lassen Sie das Gel für 3 Tage zu trocknen, um die besten Schutzeigenschaften zu gewinnen.
- Legen Sie für ein analoges Signal dünnere flexible Kabeln (ca. 3 m lang) auf den Sensor und schließen Sie an die analog-Digital-Wandler (ADC); daraus eine digitalisierte Signal übermittelt werden an einen PC über eine USB-Schnittstelle an die weisen die Informationen über die Krebse Herztätigkeit wird gespeichert, analysiert Echtzeit mit einer speziellen Software (siehe Tabelle der Materialien), und für gespeicherte Weitere detaillierte Analysen.
- Sobald der Sensor bereit ist, bringen sie die Krebse. Um dies zu tun, schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software. Bestimmen Sie die Anzahl der Krebse zu den Sensoren und aufgezeichnete Herzfrequenz die Datum-Datei gespeichert werden sollen behoben werden.
- Die Krebse aus dem Wasser nehmen und die dorsale Carapax-Seite mit einem Papiertuch abwischen. Wickeln Sie die Scheeren und Bauch der Krebse in das Papiertuch, zur Vermeidung von Schäden, die durch Menschenhand und zusätzliche Belastung auf die Krebse verursacht durch warme menschliche Hände zu beseitigen.
Hinweis: Verwenden Sie keine vorherige Kühlung des Krebses auf Eis oder im Gefrierschrank für die Immobilisierung vor Manipulationen mit dem Sensor-Anlage. Der Unterschied in der Temperatur führt zu Krebse dorsalen Oberfläche Weinen, die wiederum zu unzuverlässigen Sensor Befestigung und schnelle selbstklebende Loslösung aus der Krebse Panzer führt. - Bereiten Sie eine Oberfläche (d.h. nehmen ein kleines flaches Stück aus Kunststoff oder reißen ein Stück Klebeband und befestigen ihn an einen Tisch) und eine Peitsche für das Mischen des Leims. Drücken Sie zwei kleine Tropfen (mit einem Durchmesser von ca. 0,5 cm) aus Röhren A und B mit Epoxy-Kleber und mischen Sie schnell.
- Befestigen Sie den Sensor an Krebse dorsale Carapax und versuchen Sie, den Ort zu finden, in dem die kardiale Signalamplitude maximal wäre. Die Krebse mit dem Sensor in der Hand halten und mit der anderen freien Hand, setzen Sie einen Tropfen des gemischten Kleber auf jeder der vier zusätzliche Drähte befindet sich auf dem Sensor (beheben sie zwischen Schritten 2.1.1 und 2.1.4.). Bewegen Sie sich nicht die Sensor mindestens 5 min, bis der Kleber härtet (der Kleber aushärten hängt von der Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit).
Hinweis: Befestigung des Sensors an die Krebse Carapax prüfen Sie gründlich ganze kardiologischen Bereich seitens der Carapax, um den Bereich mit den besten (maximal) kardiale Signalamplitude zu definieren. Das hilft die Software, um genauere Herzfrequenz Berechnungen liefern. - Berühren Sie den Kleber mit einer freien Hand zu, und wenn sie nicht klebrig ist, setzen Sie die unverpackte Krebse mit dem angeschlossenen Sensor (Abbildung 2) an die Box ohne Wasser für einige Minuten, bis der Kleber vollständig trocken ist.
Hinweis: Eine optimale Temperatur für Krebse und Leim Manipulation variiert von 18 bis 22 ° C. Bei diesen Temperaturen der Kleber härtet innerhalb von 5 bis 7 Minuten und innerhalb von 8 bis 10 min völlig trocken ist. Bei niedrigeren Temperaturen ist die Spannung in der Krebse weniger stark ausgeprägt; der Kleber benötigt jedoch mehr Zeit zu härten, ca. 15-20 min unter 15 ° C und 10 ° C, beziehungsweise. Bei höheren Temperaturen, insbesondere über 25 ° C der Kleber härtet innerhalb von 3 Minuten, aber die Krebse erfährt viel mehr Stress; Daher versuchen Sie die Belichtung der Krustentier Extrembedingungen ohne Wasser zu minimieren. - Vor dem Umzug die Krebse zurück in den Tank, tauchen seine Cephalothorax mehrmals mit kurzen Abständen von wenigen Sekunden ins Wasser um eine Entlastung der Luft zu ermöglichen, die sich in den Kiemen angesammelt hat und lassen die Krebse im Wasser für ca. 1 h, keine überschüssige Chemikalien zu entfernen. Nachdem dieser Vorgang abgeschlossen ist, lassen Sie die Krebse ins Wasser und lassen Sie es für ein bis zwei Wochen unter experimentellen Bedingungen, je nach beobachteten physiologischen Indizes zu akklimatisieren. Optimalen Wasseraustausch in der Akklimatisierung Zeiten ist jeden zweiten Tag.
Hinweis: Merkmale der Krebse, die gewöhnt haben und in einem gesunden Zustand gehören ausgeprägte circadiane Herz- und Bewegungsorgane Aktivitäten, regelmäßige Nahrungsaufnahme und verbringen die meisten Tageslicht in einem spezialisierten Tierheim (sofern vorhanden).
3. Kamera und Software-Setup
- Starten Sie die Software; die Kamera schaltet automatisch auf.
- Wählen Sie eine Option der Bewegungserkennung, gründlich Bereich jeder Tank auf dem Bildschirm zu erkennen und die Software startet verfolgen das Verhalten und die Verknüpfung mit den Aufzeichnungen der Herztätigkeit.
Hinweis: Ein Krebse Motion-Detection-Modul besteht aus einer Videokamera, die Krebse Verhalten von unterhalb des Tanks und die Software, die das Verhalten mit Herztätigkeit verbindet verfolgt. Die Daten aus dem Modul dienen zur Erleichterung eine präzisere Herztätigkeit Datenverarbeitung durch den Wegfall von Perioden, in denen die Krebse hohen Lokomotive Aktivität zeigt. Plötzliche Krebse Bewegungen (wie z. B. eine Flucht-Reaktion oder Fütterung Einleitung) können dazu führen, Schwankungen oder kurzzeitige Spitzen in der kardialen Signale, die die Präzision der kardialen Intervall Berechnungen reduzieren können.
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Representative Results
Dadurch erhielten wir eine Kombination von Krebsen Herz- und Verhaltensstörungen Aktivitäten aufgezeichnet und gespeichert in eine Datei im Txt-Format (Abbildung 3). Neben der Anzahl der experimentellen Krebse, das Datum und die Sampling-Rate, die Datei besteht aus drei Säulen: (1) die ständige Uhrzeit im Format HH; (2) automatisch berechnet die Herzfrequenz in Schlägen pro Minute; (3) die Fortbewegung als (0) oder Abwesenheit (1) jede Bewegung registriert. Wenn die Krebse inaktiv war, wurde die Zelle verantwortlich für Bewegung null zugewiesen, und wenn es verschoben, erschien dann Nummer eins in der jeweiligen Zelle. Wenn kontinuierlich aufzeichnen, entstand die Datendatei automatisch jeden Tag um 00:00 Uhr (12:00 Uhr). Es war entscheidend für die Fortbewegung einbezogen werden, da es Veränderungen der Herzfrequenz (Abbildung 4) verursacht haben könnte. Nach 10 s, ein Lebensmittel-Geruch (gefräst, gefiltert und verdünnte Chironomidae Larven) in den Behälter mit der Krebse, mittels einer peristaltischen Pumpe geliefert wurde. Um 14 s, die Krebse erkannt, der Reiz und seine Herzfrequenz verringert durch die so genannte orientierende Resonanz. Nach 20 s, die Herzfrequenz erhöht, wodurch sich eine Abnahme der kardialen Intervalle. Bei 26 s, die Krebse bewegte sich auf die Quelle der Anregung, und sowohl die physiologische Erregung verursacht durch den Geruch von Essen und die Fortbewegung Einleitung führte zu einer erheblichen Herzfrequenz-Erhöhung. Bei 37 s, gab es auch Hinweise auf abrupte Flusskrebs Bewegung. Darüber hinaus könnten Fortbewegung wesentlich für das Wachstum der Herzfrequenz während der Krebse Reaktionen auf bestimmte Reize (Abbildung 5) beigetragen haben. Eine gestörte Krebse hat in der Regel eine Erhöhung der Herzfrequenz, wie während der 30-40 min-Intervall mit gelegentlichen Fortbewegung zu sehen. Jedoch ist die Fortbewegung während der 45 bis 50 min Intervall, viel stärker ausgeprägt. Diese Fortbewegung dazu beigetragen, ein Herzschlag, der deutlich höher als in der Periode mit verminderter Fortbewegung ist. Wenn die Daten aus der Datei in eine andere Anwendung übertragen werden oder der oben genannten Programmierung Algorithmus wird verwendet, könnte die Daten, enthalten nur die Herztätigkeit des Krebses gewonnen und verarbeitet bei Bedarf (Abbildung 6). Die Herzfrequenz der ungestörten Krebse zeichnet sich durch eine monotone Amplitude der Herzschlag Kurve und von ungefähr gleich kardiale Intervalle zwischen jeder kardiale Gipfel.
Um Krebse Verhaltensmuster (wie z. B. übergeben Entfernung, Bevorzugung eines bestimmten Gebietes in den Tank oder Arena und Fortbewegung Geschwindigkeit) zu analysieren, wäre es möglich, die Kamera mit einer normalen Videokamera mit einem flachen Weitwinkelobjektiv als Austausch der aktuell verwendete Kamera macht eine Aufnahme nicht aber nur Spuren Fortbewegung. Alternativ könnte eine Aufnahme mit der Online-Anwendungen für den Fang ein Video vom Bildschirm verwendet werden.
Abbildung 1 : Nicht-invasive Infrarot-optoelektronische Sensor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Krebse, Pacifastacus Leniusculus, hält den Sensor auf dem Panzer zu signalisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Ein Beispiel für die Datendatei. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Krebse Herzschlag beim Wechsel von normal bis gestört Bedingungen, wenn Nahrung Gerüche ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Herzfrequenz und Fortbewegung Aktivitäten von Krebsen in ungestörten (0-30 min) Geschäftsbedingungen gestört (30 – 60 min). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Ungestört Krebse Herzfrequenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es wurde weithin vermutet, dass die Messung bestimmte physiologische Parameter (z. B. Herz oder Lüftungsrate oder beides) ist eine zuverlässigere Methode zur Erfassung von Krebsen Reaktionen als die Bewertung von Verhaltensreaktionen, die nicht immer vorkommen gleich11. Es ist jedoch offensichtlich, dass die effizienteste Methode für die Bewertung der realen Krebse Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt die Kombination von Herztätigkeit und Verhalten Aufnahmen, ist da das macht es möglich, die Gründe für die Krebse Herzschlag zu sehen Änderungen und unabhängig davon, ob sie durch chemische Veränderungen in die Umgebung oder wegen der Fortbewegung Einleitung entstehen. Während der Überwachung der Wasserqualität ist es wichtig, alle äußere Einflüssen auf die Veränderungen in physiologischer Marker Krebse, einschließlich abrupte Bewegungen, die zunehmende Auswirkungen auf die Herzfrequenz aber stellen keinen Alarm für das Biomonitoring-System zu beseitigen.
Eine weitere Möglichkeit für eine genaue und informative Herzschlag Auswertung zu erleichtern sind die chronotropen und inotrope Parameter Analysen von Krebsen kardiale Aktivitäten vor allem im Zusammenhang mit bestimmten Formen Krebse kardiale Signale19. Solche Analysen bestätigt, dass selbst wenn der Herzschlag nur wenige Schläge pro Minute verändert, einige sekundäre Parameter Veränderungen im Krebse kardiale Aktivitäten19angeben kann.
Trotz der Vielzahl von Vorteilen bei der Verwendung des beschriebenen Ansatzes hat Forschung rund um Überwachung Krebse gegen eine absolute Minimierung der taktilen Krebse Manipulationen bewegt. Die Beseitigung von Sensoren und ihre jeweiligen Drähte heißt die neu entwickelte kontaktlose System20Krebse beliebiger Größe für das monitoring-Verfahren verwendet werden kann. Es ist auch möglich, mehrere Krebse in einem experimentellen Bereich da keine Kabel Draht Kabelgewirr verhindert und Bewegungseinschränkungen Krebse halten. Die Krebse tragen nur zwei winzige Stückchen hoch Reflexfolie, die seiner kardiologischen Bereich angibt. Diese Stücke der Band können auch nach ein paar Post-Häutung der Krebse befestigt werden Tage. Krebse kardiale Aktivitäten und Verhaltensweisen werden von der Videokamera aufgezeichnet und analysiert Echtzeit durch die koordinierende Software. Zusammen mit anderen technischen Fortschritt wird die modifizierte Ansatz einen deutlichen Rückgang der Preis des monitoring-Systems aufgrund der begrenzten Hardware verursachen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik-Projekte "CENAKVA" Nr. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 und "CENAKVA II'' No. LO1205 unter den nationalen Nachhaltigkeit programmiere ich, von der Grant-Agentur der Südböhmischen Universität in Budweis České (012/2016/Z) und von der Grant-Agentur der Tschechischen Republik (Nr. 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
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