Summary
Denna artikel presenterar en icke-invasiv övervakning system för kontinuerlig inspelning och analyser av kräftor hjärt- och rörelseapparaten verksamhet. Detta system består av en nära-infraröd optisk sensor, video-tracking modul och programvara för att utvärdera kräftor pulsslag som återspeglar dess fysiologiska tillstånd och karakteriserar kräftor beteende under heartbeat fluktuationer.
Abstract
En kräftskiva är en pivotala vattenlevande organism som fungerar både som en praktisk biologisk modell för beteendemässiga och fysiologiska studier av ryggradslösa djur och som en användbar biologisk indikator för vattenkvaliteten. Även om kräftor inte kan direkt ange de ämnen som orsakar vatten kvalitetsförsämring, kan de omedelbart (inom några sekunder) varnar människor för vatten kvalitetsförsämring via akuta förändringar i deras hjärt- och beteendemässiga aktiviteter.
I denna studie presenterar vi en icke-invasiv metod som är enkel nog att genomföras under olika förhållanden på grund av en kombination av enkelhet och tillförlitlighet i en modell.
Detta tillvägagångssätt, där de biologiska organismerna genomförs i miljövärdering processer, ger en tillförlitlig och aktuell larm för varning för och förebygga akut vatten försämring i omgivande miljö. Därför detta noninvasiv system baserat på kräftor fysiologiska och etologiska parametern inspelningar undersöktes för att upptäcka förändringar i en vattenmiljö. Detta system tillämpas nu på ett lokalt bryggeri för att kontrollera kvaliteten på det vatten som används för dryck produktion, men den kan användas på någon behandling av vatten och leverans anläggning för kontinuerlig, realtid vatten kvalitetsbedömning och regelbundna laboratorium utredningar av kräftor kardiell fysiologi och beteende.
Introduction
Föremål för vattenlevande organismers program, både som modellorganismer för olika laboratorium utredningar1,2 och som verktyg för övervakning av industriella och naturlig och miljömässiga vatten kvalitet3,4 , verkar vara väl studerat. Detta ämne är dock fortfarande av beaktansvärt intresse för människor, oavsett om de hör till det vetenskapliga samfundet eller till andra yrken. Trots förekomsten av ett antal avancerade metoder för att övervaka vissa parametrar (så kallade ”biomarkörer”)5,6,7,8, de viktigaste kraven för att välja en indikator består av tre enkla faktorer: a enkelhet, (ii) tillförlitlighet och (iii) allmän tillgänglighet.
Kräftor, skiljer som en viktig representant för sötvatten fauna, sig eftersom det finns över hela världen, är utbredd och, i de flesta fall9, har en tillräckligt stor och hård ryggskölden som är lämplig för manipulation. Detta kräftdjur tillhör gruppen av högre ryggradslösa djur som ger tillräcklig utveckling av vitala fysiologiska system och respektive organ samtidigt, på samma gång, att upprätthålla en relativt enkel organisation10.
Metoder baserade på bedömningen av spänna av kräftor biologiskt och/eller beteendevetenskaplig parametrar, som beskrivs i den vetenskapliga litteraturen, har väsentligt bidragit till utvecklingen av biologisk övervakning och kräftor studier i allmänhet. De flesta tillgängliga invasiva metoder för mätningar kräftor puls baseras på EKG-inspelningar som kräver en komplexa och exakta operationsmetod11,12,13. sådana manipulationer kan orsaka betydande stress och kan kräva långvarig anpassning av kräftorna. Också, det är inte känt hur lång en kräftor kan bära sådana elektroder och om det kommer att framgångsrikt molt körsituationer sådan bifogad. De beskrivna noninvasiva metoderna baseras på pletysmografiska inspelningar, som försvåras av hårdvara komplexitet och kräver en luftkonditionering krets för signal filtrering14 och en förstärkning eller precisa och dyra fiberoptiska komponenter15 ,16.
I denna studie beskrev vi en metod som bidrar till befintliga resultat och erbjuder nya alternativ för att förbättra nuvarande kräftor puls mätmetoder. Bland fördelarna finns det (i) en snabb och icke-invasiv bifogad fil som inte kräver en långvarig fysiologisk anpassning; (ii) kräftor förmåga att bära sensorn inom en period av några månader från ömsat till ömsat; (iii) mjukvaran som kan övervaka i realtid hjärt och beteendemässiga verksamhet och utvärdering av uppgifter som erhållits samtidigt från flera kräftor; (iv) en låg tillverkning pris och enkelhet. Biologisk övervakning systemet som vi beskriver medger noninvasiv och kontinuerlig övervakning av kräftor hjärt- och rörelseapparaten aktiviteter baserat på ändringar i kräftor etho-fysiologiska egenskaper. Detta system kan enkelt appliceras i laboratorieundersökningar av kräftor kardiell fysiologi eller etologi, förutom industriella implementationer för att kontrollera vattenkvaliteten på vatten rening samt faciliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kräftor urval
- För att framgångsrikt tillämpa det nuvarande synsättet till kräftor, Välj de respektive vuxna exemplar med tillräcklig ryggskölden storlekar (vilket är en ryggsköldslängd av minst 30 mm) för sensor fastsättning, visuellt undersöka det för avsaknad av sjukdomar och kontrollera huruvida det lyfter båda chelae när den vidrörs. De ovannämnda parametrarna indikerar ett biståndsberättigat land av kräftor hälsa.
Obs: Om flera kräftor förväntas användas i rättegången och utsätts för samma villkor, den experimentella gruppen bör bildas baserat på flera faktorer: (i) liknande vikt och längd. (ii) jämförbara hjärtfrekvens; (iii) uttalad nattlig aktivitet; (iv) regelbunden livsmedelskonsumtionen; (v) ömsat mellan perioden17. Ibland är det svårt att bestämma om en kräftor är nära ömsat av mätningarna av hjärtfrekvens eller visuella eller taktil undersökningar analyser av kräftornas hemolymph totalt proteininnehåll kan därför vara till hjälp. Proteinhalten förväntas vara högre när kräftorna är närmare ömsat än i Inter ömsat staten18.
2. registrering av kräftor hjärtats aktivitet och beteende
-
För att noninvasivt mäta hjärtfrekvenser kräftor, preliminärt förbereda sensorn för detta förfarande. Före detta sätta en kräftor i tanken med vatten och låt det acklimatiserar sig det för ett par dagar som utarbetandet av sensor19 kommer också att ta ett par dagar.
- Axiellt par en IR lysdioder (LED) med en fototransistor. Bifoga den optiska sensor kretsen på ett bräde; Det kommer att kräva en strömförsörjning på 5 V. För LED-anslutningen, placera ett 200 Ω motstånd ombord IR sensor; för att ansluta fototransistor, placera en 220 Ω resistor ombord.
- När ansluten till kräftorna, sensor utdata moduleras av mängden hemolymph fylla kräftor hjärtmuskeln och skingrar en infallande ljus från LED. För att undvika ömsesidiga störningar av den upplyst IR-ljus av LED och den reflekterade IR-ljus från kräftor hjärtat, som tas emot av fototransistor, placera en liten vägg (0,5 x 1.5 x 4 mm, tjocklek x höjd x bredd) av svart antistatisk plast mellan lysdioden och en fototransistor.
- Placera lampan i en vattentät förpackning och täcka ytan av sensorn med vattentät dielektriska gelen från sida intill ryggskölden för skydd av elektroniska komponenter från potentiell skada (figur 1). Låt gelen torka i 3 dagar för att få sina bästa skyddande egenskaper.
- För en analog signal, bifoga tunna flexibla kablar (ca 3 m lång) till sensorn och Anslut till den analog till digital omvandlaren (ADC); från detta, en digitaliserad signal kommer att överföras till en personlig dator över ett USB-gränssnitt, på vilken peka information om kräftorna hjärtats aktivitet sparas, analyseras i realtid med speciell programvara (se Tabell för material), och lagras för ytterligare detaljerade analyser.
- Så snart sensorn är beredd, bifoga det till kräftorna. För att göra detta, aktivera datorn och köra programmet. Bestämma antalet kräftor skall fastställas till sensorer och inspelade puls ska sparas till filen datum.
- Ta bort kräftorna från vattnet och torka dess dorsala ryggskölden sida med en pappershandduk. Linda den chelae och buken av kräftorna i hushållspapper för att eliminera ytterligare stress på kräftorna orsakas av varma mänskliga händer och undvika skador av mänsklig hand.
Obs: Använd inte en tidigare kylning av kräftorna på is eller i frysen för dess immobilisering innan manipulationer med sensor bifogad. Skillnaden i temperaturer leder till kräftor dorsala ytan gråt, som i sin tur leder till otillförlitliga sensor infästning och snabb självhäftande lossnar från kräftornas ryggskölden. - Förbereda en yta (dvs. ta en liten platt plastbit eller riva en bit tejp och fixa det till ett bord) och en pinne för att blanda limmet. Tryck ut två små droppar (med en diameter av ca 0,5 cm) från rör A och B som innehåller epoxi lim och snabbt blanda dem.
- Fäst sensorn till kräftor dorsala ryggskölden och försöka hitta den plats där kardiella signalens amplitud skulle vara maximal. Håller kräftorna med sensorn i ena handen och med den andra fria handen, sätta en droppe mixat lim på varje av de fyra extra ledarna ligger på sensorn (fixa dem mellan steg 2.1.1 och 2.1.4.). Flytta inte sensorn minst 5 min tills Limmet härdar (lim härdning beror på omgivningens temperatur och luftfuktighet).
Obs: Vid fastställande av sensorn till kräftor ryggskölden, undersöka noggrant hela hjärt området från ryggskölden sida för att definiera området med den bästa (maximal) hjärt signalens amplituden. Det kommer att hjälpa programvaran att tillhandahålla mer exakt puls beräkningar. - Tryck på limmet med fria händer, och om det inte är klibbig, sätta oförpackade kräftorna med bifogade sensorn (figur 2) till rutan utan vatten för några minuter tills limmet är helt torr.
Obs: En optimal temperatur för kräftor och lim manipulation varierar från 18 till 22 ° C. Vid dessa temperaturer, Limmet härdar inom 5-7 min och är helt torr inom 8-10 min. Vid lägre temperaturer, är stress i kräftorna mindre uttalad; limmet behöver dock mer tid att härda, ca 15-20 min under 15 ° C och 10 ° C respektive. Vid högre temperaturer, särskilt över 25 ° C, Limmet härdar inom 3 min, men kräftorna genomgår mycket mer stress; Därför försök minimera kräftdjuret exponering för extrema förhållanden utan vatten. - Innan du flyttar kräftorna tillbaka in i tanken, doppa sin framkroppen i vattnet flera gånger med korta intervall på några sekunder för att möjliggöra utsläpp av den luft som har ackumulerats i gälarna, och lämna kräftorna i vattnet för ca 1 h ta bort någon överflödig kemikalier. När denna process är klar, släpp kräftorna i vattnet och låt det anpassa sig i en till två veckor under experimentella förhållanden, beroende på observerad fysiologiska index. Optimal vattenutbyte under perioderna som acklimatisering är varannan dag.
Obs: Egenskaper för kräftor som har anpassat sig och är i felfritt tillstånd inkluderar uttalad dygnsrytm hjärt och rörelseapparaten aktiviteter, vanliga livsmedelskonsumtion och spendera mest dagsljus i en specialiserad skydd (om sådan finns).
3. kameran och mjukvara Setup
- Starta programvaran; videokameran växlar automatiskt.
- Välj ett alternativ för rörelse upptäckt, upptäcka noggrant området i varje tank på skärmen och programvaran kommer att börja spåra beteendet och länka den med hjärtats aktivitet inspelningarna.
Obs: En kräftor motion detection modul består av en videokamera som spårar kräftor beteende underifrån tanken och den programvara som kombinerar beteendet med hjärtats aktivitet. Data från modulen används för att underlätta mer exakt hjärtats aktivitet databehandling genom att eliminera perioder där kräftorna visar lok med hög aktivitet. Plötslig kräftor rörelser (dvs. en flykt reaktion eller utfodring initiering) kan resultera i fluktuationer eller kortvariga toppar i hjärtats signaler som kan minska beräkningsprecisionen hjärt intervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett resultat, fick vi en kombination av kräftor hjärt- och beteendemässiga aktiviteter, registreras och sparas i en fil i txt-format (figur 3). Förutom antalet experimentella kräftor, datum och samplingsfrekvens, filen består av tre kolumner: (1) den kontinuerliga tiden i HH format; (2) puls inräknad i beats per minut; (3) locomotion registrerad som frånvaron (0) eller närvaron (1) av någon rörelse. När kräftorna var inaktiva, noll tilldelades till cellen ansvarar för rörelse och när det flyttade, sedan nummer ett visades i respektive cell. När kontinuerligt inspelning, var datafilen skapas automatiskt varje dag kl 00:00 (12:00 AM). Det var avgörande att inkludera locomotion eftersom det kan ha orsakat förändringar i hjärtfrekvensen (figur 4). Efter 10 s, en mat lukt (slipat, filtrerade och utspädda fjädermyggor larver) levererades i behållaren som innehåller kräftorna, använder en Peristaltisk pump. 14 s, kräftorna erkänt stimulansen och dess puls minskade något på grund av den så kallade orientering svaren. Efter 20 s, pulsen ökade, vilket resulterar i en minskning av hjärtats intervall. 26 s, kräftorna flyttade mot stimulans källan, och båda fysiologisk excitation orsakas av mat lukt och locomotion inledande resulterade i en betydande puls. På 37 s, det fanns också tecken på abrupt kräftor rörelse. Dessutom kunde locomotion har väsentligt bidragit till puls tillväxten under kräftornas reaktioner på vissa stimuli (figur 5). En störd kräftor har vanligtvis en ökning i hjärtfrekvens, som under 30 - till 40-min intervallet med tillfällig förflyttning. Dock under 45-50 min intervall uttalas locomotion mycket mer. Denna förflyttning bidragit till en puls som är betydligt högre än som sett under perioden med minskad locomotion. Om data från filen överförs till ett annat program eller den ovanstående programmering algoritmen används, data som innehåller bara den hjärtats aktiviteten av kräftorna kunde vara erhållits och därefter bearbetas vid behov (figur 6). Pulsen av ostörd kräftor kännetecknas av en monoton amplitud av hjärtslag kurvan och av ungefärligt lika hjärt mellanrum mellan varje hjärt topp.
För att kunna analysera kräftor beteendemönster (som passerade avstånd, preferens av ett visst område i tank eller arena och locomotion hastigheten), skulle det vara möjligt att utbyta aktuella kameran med en vanlig videokamera med en platt vidvinkelobjektiv, som den för närvarande används kameran gör inte en inspelning men spårar bara förflyttning. Alternativt kunde en inspelning med någon av de online-applikationer för att fånga en video från skärmen användas.
Figur 1 : Noninvasiv infraröd optoelektronisk sensor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Signal kräftor, Pacifastacus leniusculus, hålla sensorn på dess ryggskölden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Ett exempel på datafilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kräftor hjärtslag under förändringen från normal till störd villkor när de utsätts för mat lukt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Puls och locomotion verksamhet en kräftor i ostörd (0 – 30 min) och störd (30 – 60 min) villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Ostört kräftor hjärtfrekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har allmänt föreslagits att mätning av vissa fysiologiska parametrar (till exempel hjärtat eller ventilation ränta eller båda) är en mer tillförlitlig metod för att registrera kräftor reaktioner än utvärdering av beteendemässiga svaren som inte alltid förekommer omedelbart11. Det är dock uppenbart att den mest effektiva metoden för att bedöma verkliga kräftor reaktioner till miljöförändringar är kombinationen av hjärtats aktivitet och beteende inspelningar eftersom det gör det möjligt att se skälen för kräftor heartbeat ändringar och om de uppstår till följd av kemiska förändringar i den omgivande miljön eller på grund av locomotion initiering. Under övervakning av vatten är det viktigt att eliminera alla yttre påverkan på förändringarna i kräftor fysiologiska markörer, inklusive plötsliga rörelser som har ökande effekter på pulsen men inte uppvisar ett larm för biologisk övervakning system.
En annan möjlighet för att underlätta en mer exakt och informativ heartbeat utvärdering är kronotropa och inotropa parametern analyser av kräftor hjärt aktiviteter främst relaterade till specifika former i kräftor hjärtats signaler19. Sådana analyser bekräftade att även när hjärtslag ändras bara några slag per minut, kan vissa sekundära parametrar visar betydande förändringar i kräftor hjärt aktiviteter19.
Trots ett antal fördelar med att använda metoden beskrivs, har forskning runt övervakning kräftor flyttat mot en absolut minimering av taktila kräftor manipulationer. I den nyligen utvecklat kontaktlösa system20innebär eliminering av sensorer och deras respektive sladdar att kräftor av valfri storlek kan användas för övervakningsförfarandet. Det är också möjligt att hålla flera kräftor i en experimentell område eftersom avsaknad av några ledningar förhindrar tråd trassel och restriktioner för förflyttning av kräftor. Kräftorna kommer att bära bara två små bitar av en starkt reflekterande tejp som anger dess hjärt område. Dessa bitar av tejp kan kopplas till kräftorna även efter några efter ömsat dagar. Kräftor hjärt aktiviteter och beteenden är inspelad av videokameran och analyseras i realtid av samordnande programvara. Tillsammans med andra tekniska framsteg, kommer att den modifierade metoden orsaka en betydande minskning av priset på övervakningssystemet på grund av begränsad hårdvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ministeriet för utbildning, ungdom och sport av fältet Tjeckien-projekt ”CENAKVA”. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 och ”CENAKVA II'' nej. LO1205 under de nationella hållbarheten Program, bevilja byrån av de universitet i södra Böhmen i České Budějovice (012/2016/Z), och av den beviljande myndigheten i Tjeckien (nr 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
- do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
- Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
- Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
- Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
- Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
- Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
- Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
- Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594 (2009).
- Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
- Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
- Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
- Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
- Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
- Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
- Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
- Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
- Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).
