Summary
Denne artikkelen presenterer en noninvasive biomonitoring system for kontinuerlig opptak og analyser av kreps cardiac og locomotor. Dette systemet består av en nær-infrarøde optisk sensor, video-sporing modul og programvare for å vurdere kreps hjerteslag som gjenspeiler sin fysiologisk tilstand og karakteriserer kreps oppførsel under heartbeat svingninger.
Abstract
En kreps er en avgjørende akvatiske organisme som tjener både som en praktisk biologiske modell for atferdsmessige og fysiologiske studier av virvelløse dyr og en nyttig biologiske indikator på vannkvaliteten. Selv om kreps ikke kan direkte angi stoffene som forårsaker vannet kvalitet forverring, kan de umiddelbart (innen noen få sekunder) advare mennesker på vann kvalitet forverring via akutte endringer i deres hjerte og atferdsmessige aktiviteter.
I denne studien presenterer vi en noninvasive metode som er enkelt nok å bli gjennomført under ulike forhold på grunn av en kombinasjon av enkelhet og pålitelighet i en modell.
Denne tilnærmingen, der de biologiske organismene er implementert i miljømessig vurdering prosesser, gir en pålitelig og rimelig alarm for varsling av og hindre akutt vann forverring i et ambient miljøet. Derfor denne noninvasive system basert på kreps fysiologiske og etologiske parameteren innspillinger ble undersøkt for påvisning av endringer i en vannmiljøet. Dette systemet brukes nå på en lokal brewery for å kontrollere kvaliteten på vannet som brukes for drikke produksjon, men den kan brukes på alle vannbehandling og levere anlegg for kontinuerlig, sanntid vann kvalitet evaluering og vanlig laboratoriet undersøkelser av kreps cardiac fysiologi og atferd.
Introduction
Gjenstand for vannlevende organismer programmer, både som modell organismer for ulike laboratorium undersøkelser1,2 og verktøy for å overvåke industrielle og naturlig og miljøarbeid vann kvalitet3,4 , vises studier. Dette emnet er likevel fortsatt av bemerkelsesverdig interesse for mennesker, uansett om de tilhører det vitenskapelige samfunnet eller andre yrker. Til tross for eksistensen av en rekke avanserte metoder for å overvåke bestemte parametere (såkalte "biomarkers")5,6,7,8, de viktigste kravene for å velge en indikator består av tre enkle faktorer: (i) enkelhet, (ii) pålitelighet og (iii) general anvendelighet.
Kreps, utmerker som en viktig representant for ferskvann fauna, seg fordi det er funnet over hele verden, er utbredt, og, i de fleste tilfeller9, har en tilstrekkelig store og hardt ryggskjold egnet for manipulasjon. Denne krepsdyr tilhører gruppen av høyere virvelløse dyr som gir tilstrekkelig utvikling av viktige fysiologiske systemer og respektive organer stund, samtidig, opprettholde en relativt enkel organisering10.
Metoder basert på vurdering av crayfishes' biologisk og/eller atferdsmessige parametere, som beskrevet i den vitenskapelige litteraturen, har bidratt betydelig til utviklingen av biomonitoring og kreps studier generelt. De fleste av de tilgjengelige invasive metodene for kreps hjertetakt er basert på elektrokardiogram innspillinger som krever en kompleks og presis kirurgiske prosedyren11,12,13; slike manipulasjoner kan forårsake betydelig stress til og kan trenge langvarig tilpasning av kreps. Også, det er ikke kjent hvor lenge en kreps kan bære slike elektroder og om det vil lykkes molt mens bærer slike vedlegg. Beskrevet noninvasive metodene er basert på plethysmographic innspillinger, som er komplisert av isenkram innviklet beskaffenhet og krever en condition krets for signalet filtrering14 og en forsterkning eller presis og dyre fiberoptisk komponenter15 ,16.
I denne studien beskrev vi en tilnærming som bidrar til eksisterende resultater og gir nye alternativer for å forbedre gjeldende kreps hjertefrekvens måling prosedyrer. Blant fordelene er det (i) en rask og noninvasive vedlegg som ikke krever en langvarig fysiologiske tilpasning; (ii) crayfishes' evne å befordre sensoren i løpet av noen måneder fra molting til molting; (iii) programvare som kan overvåke sanntid cardiac og atferdsmessige aktiviteter og evaluering av data samtidig fra flere kreps; (iv) en lav produksjon pris og enkelhet. Biomonitoring systemet som beskriver vi tillater noninvasive og kontinuerlig overvåking av kreps cardiac og locomotor aktiviteter basert på endringer i crayfishes' etho-fysiologiske egenskaper. Dette systemet kan lett brukes i laboratoriet undersøkelser av kreps cardiac fysiologi eller etologi, i tillegg til industriell implementeringer for kontroll av vannkvalitet på vann behandling og levere anlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kreps utvalg
- For å kunne bruke gjeldende tilnærming kreps, velger de respektive voksne prøvene med tilstrekkelig ryggskjoldet størrelser (som er en ryggskjoldet lengde på minst 30 mm) for sensoren vedlegg visuelt undersøke den 's fravær av sykdommer og kontrollere om det løfter både chelae når det rørte. Til parametrene angir en kvalifisert delstaten kreps helse.
Merk: Hvis flere kreps forventes å bli brukt i rettssaken, og er utsatt for samme vilkår, forsøksgruppen skal formes basert på flere parametere: (i) lignende vekt og lengde; (ii) sammenlignbare hjertefrekvens; (iii) uttalt nattlige aktivitet. (iv) faste matforbruk; (v) molting inter perioden17. Noen ganger er det vanskelig å definere om en kreps er nær molting av hjertefrekvens-målinger eller visuelle eller taktile eksamen analyser av krepss hemolymph totale proteininnhold kan derfor være nyttig. Proteininnhold forventes å være høyere når kreps er nærmere molting enn i Inter molting staten18.
2. opptak av kreps hjerte aktivitet og atferd
-
For å noninvasively måle kreps hjerte priser, forberede foreløpig sensoren for denne prosedyren. Før dette, sette en kreps i tanken med vann og la det acclimate det for et par dager som utarbeidelse av sensoren19 vil også ta noen dager.
- Aksialt par en IR lys - emitting diode (LED) med en phototransistor. Knytte optisk sensor kretsen på et bord; det vil kreve en strømforsyning 5 V. For LED tilkoblingen, plassere en 200 Ω motstand på IR sensor brettet; for å koble til phototransistor, kan du plassere en 220 Ω motstand på brettet.
- Knyttet til kreps, sensoren utgang modulert av mengden hemolymph fylle Hjertemuskel kreps og sprer en innfallende lyset fra LED. For å unngå gjensidige forstyrrelser av opplyst IR lys av LED og reflektert IR lys fra kreps hjertet som er mottatt av phototransistor, plassere en liten vegg (0.5 x 1,5 x 4 mm, tykkelse x høyde x bredde) i svart antistatiske kunststoff mellom LED og phototransistor.
- Plasser LED i en vanntett pakken, og dekker overflaten av sensoren med vanntett dielektrisk gel fra siden tilstøtende ryggskjoldet for beskyttelse av de elektroniske komponentene mot skader (figur 1). La gel tørke i 3 dager for å få de beste beskyttende egenskapene.
- Analogt signal, knytte tynn fleksibel kabler (ca 3 m lang) til sensoren og koble til analog til digital omformer (ADC); fra dette, en digitalisert signalet overføres til PC over en USB-grensesnitt, på som peker informasjon om kreps hjerte aktivitet lagres, analysert i sanntid med spesiell programvare (se Tabell for materiale), og lagret for Videre detaljerte analyser.
- Når sensoren er forberedt, kan du knytte den til kreps. For dette, slå datamaskinen på og kjøre programvare. Bestemme antall kreps rettes til sensorer og innspilte hjertefrekvens lagres i filen dato.
- Fjerne kreps fra vann og tørk dorsal ryggskjoldet siden med et papirhåndkle. Pakk chelae og magen av kreps i tørkepapir for å unngå skader menneskelige hånden og eliminere ekstra stress på kreps forårsaket av varm menneskehender.
Merk: Ikke bruk en tidligere kjøling av kreps på isen eller i fryseren for sin immobilisering før manipulasjoner med sensor vedlegget. Forskjellen i temperaturer fører til kreps dorsal overflaten gråt som i sin tur fører til upålitelige sensor festing og rask selvklebende løsgjøring fra krepss ryggskjoldet. - Forberede en overflate (dvs. tar en liten flat stykke plast eller rive et stykke selvklebende tape og fikse det i en tabell) og en pinne for å blande limet. Trykk ut to små dråper (diameter ca 0,5 cm) fra rør A og B med epoxy limet og raskt blande dem.
- Feste sensoren til kreps dorsal ryggskjoldet og prøve å finne der cardiac signal amplituden ville være maksimalt. Hold kreps med sensoren i en hånd, og bruker gratis derimot, sette en dråpe blandet lim på hver av de fire ekstra ledningene på sensoren (fikse dem mellom trinn 2.1.1 og 2.1.4.). Ikke flytte sensoren minst 5 min til limet stivner (lim herding er avhengig av omgivende temperatur og luftfuktighet).
Merk: Når feste sensoren til kreps ryggskjoldet, undersøke grundig hele hjerte området fra ryggskjoldet side for å definere området med beste (maksimalt) cardiac signal amplituden. Det vil hjelpe programvare for å gi mer presis hjertefrekvens beregninger. - Trykk limet med frie hender, og hvis det ikke er klissete, sette pakket kreps med tilknyttede sensoren (figur 2) boksen uten vann for noen få minutter til limet er helt tørt.
Merk: En optimal temperatur for kreps og lim manipulasjon varierer fra 18 til 22 ° C. På disse temperaturer, limet beskytter innen 5-7 min, og er helt tørt innen 8 til 10 min. Ved lavere temperaturer, er stress i kreps mindre uttalt; imidlertid limet trenger mer tid til å herde, ca 15 og 20 min under 15 ° C og 10 ° C, henholdsvis. Ved høyere temperaturer, spesielt over 25 ° C, limet stivner innen 3 min, men kreps gjennomgår mye mer stress; Derfor Prøv å minimere eksponering for krepsdyr ekstreme forhold uten vann. - Flyttet kreps tilbake i tanken, dyppe sin cephalothorax i vannet flere ganger med korte intervaller på noen sekunder slik at utslipp av luft som er akkumulert i gjellene, og forlate kreps i vannet for ca 1 h å fjerne noen overflødige kjemikalier. Når denne prosessen er fullført, frigi kreps i vannet og la den å acclimate for en til to uker under eksperimentelle forhold, avhengig av observerte fysiologiske indekser. Optimal vann exchange i acclimation perioder er annenhver dag.
Merk: Kjennetegner kreps som har acclimated og sunne inkluderer uttales circadian cardiac og locomotor aktiviteter, vanlig matforbruk og bruke de fleste dagslys i en spesialisert ly (hvis tilgjengelig).
3. kamera og programvare Setup
- Start programvaren; videokameraet vil automatisk slå på.
- Velg et alternativ av bevegelse, oppdage grundig området av hver tanken på skjermen og starter programmet spore atferden og koblinger til hjerte aktivitet opptakene.
Merk: En søkemodul kreps bevegelse består av et videokamera som sporer kreps oppførsel fra under tanken og programvaren som kombinerer virkemåten med hjerte aktivitet. Data fra modulen brukes til å rette mer presis hjerte aktivitet databehandling ved å eliminere perioder der kreps demonstrerer høy lokomotiv aktivitet. Plutselig kreps bevegelser (dvs. en flukt reaksjon eller fôring innvielse) kan resultere i svingninger eller kort tid toppene i hjertets signaler som kan redusere beregningspresisjonen cardiac intervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et resultat oppnådd vi en kombinasjon av kreps cardiac og atferdsmessige aktiviteter, registrert og lagret i en txt-format fil (Figur 3). Foruten antallet eksperimentelle kreps, datoen og samplingsfrekvensen, filen består av tre kolonner: (1) kontinuerlig tiden filmtid i formatet; (2) hjertefrekvens beregnes automatisk i slag per minutt; (3) bevegelse registrert som fravær (0) eller tilstedeværelse (1) av enhver bevegelse. Da kreps var inaktiv, null ble tilordnet cellen ansvarlig for bevegelse, og når den flyttes, deretter nummer én i respektive cellen. Når kontinuerlig opptak, ble datafilen automatisk opprettet hver dag kl 00:00 (12:00 AM). Det var avgjørende å inkludere bevegelse siden det kunne ha forårsaket endringer i hjertefrekvensen (Figur 4). Etter 10 s, en mat lukt (valset, filtrert og utvannet fjærmygg Larvene) ble levert i tanken med kreps, bruker en peristaltiske pumpe. 14 s, kreps anerkjent stimulans og dens hjertefrekvensen litt redusert på grunn av det såkalte orienting svaret. Etter 20 s, hjertefrekvensen økt, dermed resulterer i en reduksjon i cardiac intervaller. På 26 s, kreps flyttet til stimulans kilden, og både fysiologiske magnetisering forårsaket av mat lukt og bevegelse initiering førte til en betydelig hjertefrekvens økning. På 37 s, var det også bevis brå kreps bevegelse. I tillegg kan bevegelse har vesentlig bidratt til hjertefrekvens veksten i krepss reaksjoner på visse stimuli (figur 5). En forstyrret kreps har vanligvis en økning i hjertefrekvens, sett i løpet av 30-40 minutter intervallet med sporadisk bevegelse. Men under 45-50 min intervall, er bevegelse mye mer uttalt. Denne bevegelse bidratt til en puls som er betydelig høyere enn under perioden med redusert bevegelse. Hvis dataene fra filen er overført til et annet program eller over programmering algoritmen brukes, dataene som inneholder bare kardial aktiviteten til kreps kan være innhentet og senere behandlet eventuelt (figur 6). Hjertefrekvens uforstyrret kreps er preget av en monotoniske amplituden av hjerteslag kurven og av omtrent lik cardiac intervallene mellom hver cardiac topp.
For å analysere kreps atferdsmønster (som passerte avstand, preferanse for et bestemt område i tanken eller arena og bevegelse hastigheten), ville det være mulig å bytte gjeldende kameraet med standard videokamera med en flat vidvinkel linse, som den for øyeblikket brukes kameraet gjør ikke en innspilling, men spor bare bevegelse. Alternativt kan en innspilling med noen av online-programmer for å fange en video fra skjermen brukes.
Figur 1 : Noninvasive infrarød Optoelektronisk sensor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Signal kreps, Pacifastacus leniusculus, holde sensoren på sin ryggskjold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Et eksempel på datafilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Kreps hjerterytme under bytte fra normal til forstyrret forhold når de utsettes for mat lukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Hjertefrekvens og bevegelse aktiviteter av en kreps uforstyrret (0-30 min) og forstyrret (30-60 minutter) forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Uforstyrret kreps hjertefrekvens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har mye blitt foreslått at måling av visse fysiologiske parametre (som hjertet eller ventilasjon rate eller begge) er en sikrere metode for opptak kreps reaksjoner enn evalueringen av atferdsmessige responser som ikke forekommer alltid umiddelbart11. Men er det tydelig at den mest effektive tilnærmingen for å vurdere virkelige kreps reaksjoner på miljøendringer er kombinasjonen av hjerte aktivitet og atferd innspillinger siden som gjør det mulig å se ekstraordinær kreps hjerterytme endringer og hvorvidt de oppstår som følge av kjemiske endringer i ambient miljøet eller bevegelse innvielse. Under vann kvalitet overvåking er det avgjørende å eliminere alle ytre påvirkninger på endringene i kreps fysiologiske markører, inkludert brå bevegelser som økende effekter hjertefrekvens men ikke presentere en alarm for biomonitoring systemet.
En annen mulighet for å tilrettelegge en mer presis og informativ hjerteslag vurdering er chronotropic og inotrope parameteren analyser av kreps cardiac aktiviteter hovedsakelig knyttet til bestemte figurer i kreps hjertets signaler19. Slike analyser bekreftet at selv når hjerterytme endret bare noen slag per minutt, kan noen av de sekundære parameterne indikerer betydelige endringer i kreps cardiac aktiviteter19.
Selv om antallet fordeler i ved hjelp av beskrevet tilnærming, har forskning rundt overvåking kreps flyttet mot en absolutt minimering av taktile kreps manipulasjoner. I nylig utviklet kontaktløse system20betyr eliminering av sensorer og deres respektive ledninger at kreps uansett størrelse kan brukes for overvåking prosedyren. Det er også mulig å holde flere kreps en eksperimentell område siden fravær av alle telegrammer hindrer wire ledningskrøll og kreps bevegelse restriksjoner. Kreps vil bære to små biter av en svært reflekterende tape som angir dens hjerteområde. Disse stykker bånd kan knyttes til kreps selv etter noen post molting dager. Kreps cardiac aktiviteter og atferd er registrert av videokameraet og analysert i sanntid av koordinerende. Sammen med andre tekniske fremskritt, vil endret tilnærming føre til en betydelig reduksjon i prisen på overvåking systemet på grunn av begrenset maskinvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av departementet for utdanning, ungdom og sport for Tsjekkia-prosjekter "CENAKVA". CZ.1.05/2.1.00/01.0024 og "CENAKVA II'' nr. LO1205 under nasjonale bærekraft Program jeg, Grant byrået av universitetet Sør-Böhmen i České Budějovice (012/2016/Z), og gi byrået i Tsjekkia (nr. 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
- do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
- Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
- Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
- Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
- Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
- Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
- Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
- Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594 (2009).
- Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
- Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
- Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
- Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
- Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
- Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
- Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
- Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
- Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).
