Summary
Detta protokoll ger en effektiv metod för att mäta LDL kolesterol upptag med realtid tillströmning priser med hjälp av en levande cell imaging system i olika celltyper. Denna teknik ger en plattform för att skärmen den farmakologiska aktiviteten av föreningar som påverkar LDL tillströmning medan övervakning för cellmorfologi och därmed potentiella cytotoxicitet.
Abstract
Regleringen av LDL kolesterol upptag via Receptorn-medierad endocytos är ett viktigt område av studie i olika stora sjukdomar inklusive metabolisk sjukdom, hjärt- och njursjukdom. För närvarande finns det ingen tillgänglig metod att bedöma LDL-upptag medan samtidigt övervakas för hälsa av cellerna. Den aktuella studien presenterar ett protokoll, med en levande cell imaging analyssystem, för att förvärva seriella mätningar av LDL tillströmningen med samtidiga övervakning för cell hälsa. Denna nya teknik testas i tre mänskliga cellinjer (nedsatt, renal tubulär epitelial och koronar artär endotelceller) under en fyra timmars tid. Dessutom är känsligheten hos denna teknik validerad med välkända LDL-hämmare, Dynasore och rekombinant PCSK9 protein, liksom en LDL upptag promotorn, Simvastatin. Sammantaget ger denna metod en medium till hög genomströmning plattform för samtidigt screening farmakologisk aktivitet samt övervakning av cellmorfologi, därav cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL tillströmning. Analysen kan användas med olika bildsystem och analytiska programvara.
Introduction
Den Low Density Lipoprotein Receptor Receptorn-medierad LDL endocytos är ett viktigt område för studien eftersom cirkulerande LDL-kolesterolnivåerna är kärnan i hjärt-kärlsjukdom1, njur sjukdom2 samt en mängd inflammatoriska sjukdomar3 och genetiska sjukdomar med mutationer i kolesterol transport gener4,5,6,7. Studier i Receptorn-medierad kolesterol tillströmningen har ledde till identifiering av flera forskningsverktyg, såsom Dynamin-hämmare inklusive den kemiska Dynasore8,9,10, samt LDL-reglerande proteiner såsom Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Skriv 9 (PCSK9)11,12.
LDL-Receptorn endocytos vägen börjar med komplexbildare LDL-Receptorn komplex på cellytan in i clathrin-belagda gropar13. Blåsor bildas då av invagination ytan cellmembranet internalisera det LDL-Receptorn komplexet i vakuoler för transport inuti cellen. Som den bildade vesikler mognar in tidigt och sedan sent endosomes, sjunker pH inuti den sena endosome, orsakar disassociation av LDL från dess receptor14. Tidigare berodde metoder för kvantifiering av LDL tillströmning på radioaktivt märkt 125-LDL samtidig inkubering med celler och efterföljande utvinning av radioaktivt märkt proteinet från celler för kvantifiering15. Detta ersattes sedan av användningen av fluorescently märkta LDL proteiner såsom DiI-LDL, och efterföljande immunfärgning eller utvinning av protein för fluorescerande avläsningar med en spektrofotometer eller plattan läsare15,16. Fluorescently märkt har LDL också använts i fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för analys av internalisering av LDL och cell surface LDL bindande17. Medan dessa metoder möjliggör insamling av data efter behandling, är övervakning livskraften hos cellerna under behandling inte möjligt.
Sura pH-värde i den sena endosome tillåter användning av en pH-aktiverat fluorescerande LDL-sond som pHrodo Red LDL som fluorescerar i efter internalisering18,19. Denna egenskap kan för en fortlöpande tidsförloppet för bedömning av LDL-upptag i levande celler. Därför detta protokoll använder tredjeparts pHrodo röd-LDL fluorescens imaging i en levande cell analys till seriellt mäta LDL upptag med samtidiga övervakning cell hälsa. Resultaten visar tillförlitligheten i denna nya teknik som testats under en fyra timmars tid kurs i tre olika mänskliga cellinjer, mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler, humana epitelceller av (HK2) och nedsatt och mänskliga koronara arterial endotelceller (HCAEC ). Dessa cellinjer är kliniskt signifikanta till LDL clearance20,21,22,23,24,25,26,27 , njur sjukdom28,29,30,31, och hjärtsjukdom32,33, respektive. Förutom övervakning LDL inflödet, omfattar detta protokollet behandling med två välkända LDL hämmare, Dynasore hydrat och rekombinant PCSK9 protein samt en statin inducerare av Receptorn uttryck och LDL-upptag, simvastatin. Dynasore och rekombinant PCSK9 varje arbete genom olika vägar att minska LDL-upptag.
Dynasore är en liten molekyl hämmare av Dynamins10 och minskar LDL-upptag genom att blockera clathrin-beroende endocytos av LDL-Receptorn komplex10,34. Rekombinant PCSK9, däremot, är medlem i peptidase S8 familj som binder till Receptorn och hämmar dess återvinning till cellytan efter släppa LDL från internaliseras komplexet genom att blockera konfirmerande ändringar35,36 . Minskad cell Receptorn Ytors leder så småningom till reducerat LDL-upptag av cellen. Statiner, är medan direkt blockera 3-hydroxi-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reduktas enzym och därmed biosyntesen av kolesterol, också känt att upregulate uttrycket av Receptorn25,38 leder till ökat LDL-upptag. Känsligheten för detta protokoll är validerad genom att identifiera betydande minskningar i LDL tillströmningen i tre kliniskt relevanta mänskliga cellinjer, HK2, HepG2 och HCAECs, genom Dynasore och/eller rekombinant PCSK9, och en markant ökning av LDL-upptag i HepG2 celler av Simvastatin i en fyra timmars tid kurs med övervakning för cell morfologi/hälsa. Sammantaget ger denna metod en medium till hög genomströmning plattform för samtidigt screening farmakologiska aktivitet och cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL-upptag i levande celler.
Protocol
1. sådd celler i en 24-well platta
- Aspirera media utanför cellerna, tvätta cellerna med 5 mL av Dubelcos fosfat buffrad koksaltlösning (dPBS) och aspirera på dPBS. För HepG2 celler i en 100 mm maträtt, Använd 1,5 mL av 0,25% Trypsin/EDTA, och för HK2 celler eller HCAECs använda 1,5 mL 0,05% Trypsin/EDTA-lösning för att lossa cellerna.
- Inkubera plattan i en inkubator i 37 ° C i 4 minuter eller tills cellerna är fristående. Neutralisera trypsin efter en 4 minuters inkubation genom att tillföra 3 mL komplett media för HepG2 och HK2 eller 3 mL av trypsin neutraliserande lösning, dPBS plus 5% fetalt bovint serum (FBS), för HCAEC celler.
- Överföra cellerna i 15 mL koniska rör och centrifugera vid 250 x g i 5 min, aspirera media och resuspendera cellpelleten i komplett media.
- Filtrera cellsuspensionen försiktigt genom en 40 μm mesh SIL att bryta upp cell klumpar. Tvätta inte cellerna genom Silen.
- Räkna cellerna och platta dem på en optimerad densitet. Till exempel leda 5 000 celler per väl av HepG2 celler eller 10 000 celler per brunn HK2 celler eller HCAECs i en 24-well platta till optimalt resultat.
- Inkubera plattan över natten vid 37 ° C så att celler att fästa.
- Nästa dag, ändra cellen media om du vill basera media för cellinje (utan FBS) plus 5% Lipo-Protein bristfällig Serum (LPDS) eller låg (2%) FBS media beroende på behandlingen (se 1.7). Fortsätt sedan inkubation i 24 h att svälta cellerna. Använd 500 μL av totala media per brunn i en 24-bra platta.
- Behandla cellerna i ett av tre sätt: tillsätt 10 µg/mL rPCSK9 (eller fordon) och returnera celler till 37 ° C inkubatorn för 1 timme, tillsätt 40 µM Dynasore hydrat (eller fordon, dimetyl sulfoxid) och återgå cellerna till inkubatorn 37 ° C i 10 minuter , eller Lägg 1 µM Simvastatin (eller fordon, dimetyl sulfoxid) och återvända cellerna till 37 ° C inkubatorn på 12, 18 eller 24 timmar. Använda media med 5% LPDS för rPCSK9 eller Dynasore behandlingar. Använd låg (2%) FBS media eller media med 5% LPDS Simvastatin behandlingar.
Obs: Behandling av cellerna med önskad föreningar kan göras vid tidpunkten för media förändring för lipoprotein svält (steg 1,6) för långsiktiga experiment, eller före analysen för kortsiktiga experiment. Alternativt, anpassade behandlingstider kan väljas baserat på typen och syftet med experimenten. - Nästa, tillsätt 5 µL av pHrodo red-märkta LDL (1 mg/mL lager) till varje brunn för att erhålla en slutlig koncentration på 10 µg/mL. Ta sedan försiktigt bort eventuella bubblor från brunnarna.
2. levande Cell analys
- Omedelbart efter tillägger den märkta LDL, placera plattan i levande cellen analys system inkubator (se Tabell av material) och låt plattan temperera i 15 minuter för att minska kondens i plattan.
- Under tiden öppna programvaran och schemalägga genomsökningen genom att lägga till fartyget håller plattan. Bild 16 bilder per brunn 1 timmars mellanrum på 10 X 4 timmar använda kanalerna röd och fas.
- Skapa en tallrik karta för databehandling.
- Klicka på fliken Egenskaper Välj plattan karta. Ingång på celltyp och behandlingar i föreningar -fliken.
- Klicka på fliken regioner , väljer varje uppsättning replikat och Spara som regioner.
3. ställa in parametrar för analys
- När en experimentell kör är klar, skapa ange en bild i mjukvaran för att träna datorn att kvantifiera varje parameter ingå i räknande.
- I programvaran, öppna vyn plattan i rutan Analysverktyg jobb och välj sedan skapa eller Lägg till bildsamling.
- Välj Ny bildsamling, Skriv ett namn för samlingen bild och välj röd och fas kanaler genom att markera rutorna bredvid kanalerna.
- Välj 5 fler bilder och lägga till bild samlingen genom att lägga till den aktuella bildsamling.
- Skapa en bearbetning Definition för cellerna. Tabell 1 innehåller parametrarna för cellen HepG2, HK2 och HCAE bearbetning definitioner för detta LDL tillströmning protokoll.
- Välj Ny bearbetning Definitioni rutan Analysverktyg jobb . Välja bild samlingen heter i steg 2.1.2 från nedrullningsbara menyn. Mata in parametrarna för typ av celler från tabell 1.
- Använd nedrullningsbara menyn för att välja Förhandsgranska allai rutan Förhandsgranskning.
- Analys Mask i rutan kontrollera Sammanflödet Mask och rutorna Röd objekt Mask för att visa det område som ingår i analysen för bearbetning definitionen. Se figur 1.
- Bläddra genom samlingen bild se till de celler och LDL ingår i masken. Välj fil och Spara bearbetning definitionen.
- Analysera uppsättningen bilder från den experimentella kör.
- Öppna experimentet i plattan vyn. I rutan Analysverktyg jobb väljer du Starta ny analys jobb. Välj den sparade bearbetning Definition.
- Namnge analys jobbet, välja tidsintervall för analys och markera de experimentella wells att analysera. Klicka på knappen Starta .
4. analys och databehandling
- När analys jobbet är klar, exportera data:
- Välj ifyllt analysen och tryck på Visa. I verktygsmenyn, Välj Metriska/diagram exportera.
- I menyn regioner , välja Alla brunnar, och den gruppen för att få medelvärdena för varje uppsättning brunnar som grupp Välj menyn replikerar och för att exportera de enskilda värdena för varje brunn väljer du ingen.
- Välj Totala röda objekt integrerade intensitet (RCU x µm2/image)i menyn röda objekt metriska . Den här parametern anger summan av tidens röd signal intensiteten (i RCU) området i röd signal (i µm2) i alla bilder över varje brunn, vilket motsvarar det totala LDL-upptaget av celler.
- Klicka på knappen Exportera . Kontrollera bryta data ner till enskilda bilder. Data kopieras automatiskt ett urklipp och kan klistras in till en ny kalkylbladsfil.
- I fas-objektet metriska menyn, Välj Confluence (procent). Kontrollera bryta data ner till enskilda bilder. Klicka på knappen Exportera . Data kopieras automatiskt ett urklipp och kan kopieras till den kalkylbladsfil som innehåller totala röda objekt integrerade intensitet data.
- Gäller omvandlingen av procent sammanflödet totalyta med följande ekvation.
Totalt fas (µm2/image) = Confluence (%) × (bildens höjd (bildpunkter) × Resolution) × (bildens bredd (bildpunkter) × upplösning)
Obs: parametern sammanflödet (%) anger procent sammanflödet av området fas per bild som motsvarar området i cellerna i varje brunn. Detta mått bör omvandlas till totala fas område för varje enskild bild som en gång exporterade. Bild specifikationerna för fas kanal (bildhöjd, bredd och upplösning) för att användas med formeln ovan för varje experimentellt fartyg kan hittas genom att hänvisa till Fartyget boenden under Bild kanaler. - Normalisera totala röda objekt integrerade intensitet till området totala fasen som beräknas enligt 4.1.6 använder följande formel för varje enskild bild för att eliminera variabiliteten i cell densiteten över brunnarna.
- Dela Totalt röda objekt integrerade intensitet (RCU x µm2/image) värdena för varje bild av dess motsvarande Totala fas område (µm2/image) att erhålla LDL upptag (RCU) värden per bild.
- Sedan, genomsnittlig LDL upptag (RCU) data av alla bilder av varje brunn för att få det genomsnittliga LDL-upptaget i varje brunn och sedan genomsnittlig LDL upptag värdena för alla de replikera brunnarna att få grupp medel. Dessa data är de slutliga LDL upptag värdena och får användas för illustration och statistisk analys med hjälp av programvaran val.
Representative Results
Levande cellen Imaging möjliggör tillförlitlig övervakning av Cell hälsa under kolesterol tillströmning studier i tre mänskliga cellinjer
Vi validerat vår analys i tre mänskliga cellinjer som kolesterol homeostas förordning spelar en viktig patofysiologisk roll, inklusive mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler, humana epitelceller av (HK2) och nedsatt och mänskliga kranskärl endotelceller (HCAECs). Vi använde en levande cell imaging system för att utföra LDL upptag analysen i en 4 h tid kurs med seriella mätningar 1 h mellanrum. Våra resultat visar att alla de celltyper som testade var förenliga med denna nya teknik och resultatet i kurvor som visar kontinuerlig LDL-upptag under hela studien tillströmningen med 4,33 h som den sista slutpunkten (figur 2). Tillströmningen data visas i figur 2 erhölls genom att normalisera den totala pHrodo Red-märkta LDL fluorescens (summa rött objekt integrerade intensitet per bild i RCU x µm2/bild) till området summacell i varje bild av varje brunn (fas objektområde per bild i µ m2/image) till eliminera variabiliteten i cell densiteten över brunnarna. Dessutom för att validera känsligheten LDL tillströmning analysens syfte att screening föreningar som påverkar LDL-kolesterol upptag, använde vi två positiva kontroller kända för att hämma LDL tillströmning, Dynasore och rPCSK9, och en positiv kontroll inducera LDL upptag, Simvastatin. Som validerats av våra resultat, efter behandling med Dynasore och rPCSK9, testade alla tre mänskliga cellinjer (HepG2, HK2 och HCAEC) visade signifikant minskning i LDL inflödet över en 4 h tid kurs (figur 2A-C). Figur 2 visar exempelvis att LDL tillströmningen är nedsatt i HepG2 celler med behandling av Dynasore under tid, jämfört med de celler som behandlas med DMSO; medan DMSO som fordonskontroll för Dynasore kontroll hade ingen signifikant effekt på LDL inflöde jämfört med obehandlad kontrollgruppen. Våra resultat visade en markant ökning i LDL-upptag av HepG2 celler efter behandling med Simvastatin (figur 3), stödja känsligheten hos denna metod att upptäcka betydande förändringar i LDL tillströmningen. På runt 4,5 h tid-punkten, som är en typisk tidpunkt i studierna för LDL-upptag, är LDL tillströmningen avsevärt minskas med antingen Dynasore eller rPCSK9 behandling, och ökade med Simvastatin behandling (figur 4).
En stor fördel att använda levande cell imaging för LDL upptag studier är att detta system ger realtid bilder av cellerna i varje brunn som kunde användas för att övervaka potentiella cytotoxiciteten hos de undersökta föreningarna. Siffrorna 5-7 illustrera representativa bilder av tre cellinjer undersökt vid inledande tid LED 0,33 h och sista endpoint (4,33 h) som en visuell referens för Nettoinflödet LDL. Bilder bekräftar normal morfologi av celler efter Dynasore eller rPCSK9 behandlingar, som visar både effektiviteten och säkerheten i dessa föreningar.
Levande cellen analys ger tillförlitlig seriell kvantitativa kolesterol tillströmning mätningar med olika behandlingar
En stor fördel med att använda detta protokoll med en levande cell imaging system är förmågan att samla in data under hela tiden och jämföra LDL tillströmningen vid flera tidpunkter snarare än bara en sista gång punkt som traditionellt gjort. Användning av detta protokoll, kan vi beräkna procent minskning LDL tillströmningen den terminal tidpunkt samt 1 h mellanrum under kursens gång. Tabell 2 sammanfattar minskningen av LDL tillströmning i tre testade mänskliga cellinjer efter 10 min före behandling med 40 µM Dynasore eller 1 h före behandling med 10 µg/mL rPCSK9. På 4,33 h som slutlig slutpunkten, behandling med Dynasore vid 40 µM signifikant LDL tillströmningen i HepG2 celler, HK2 celler och HCAECs av 53%, 68% och 54%, respektive (Tabell 2A-C) och behandling med rPCSK9 på 10 µg/mL resulterade i 55% minskning av LDL inflödet i HK2 celler (tabell 2B). Förutom att kvantifiera den terminal tidpunkten som i traditionella analyser, kan vi utföra en kvantitativ analys i minskningen av LDL tillströmning på grund av behandling vid varje tidpunkt av experimentet. Tabell 2B visar exempelvis att behandling med rPCSK9 i HK2 celler resulterade i en minskning av LDL-upptag av 79% vid 1.33 h, 67% vid 2.33 tim, 59% på 3,33 h efter behandling jämfört med obehandlade celler. Detta protokoll ger en pålitlig metod för kvantitativ analys av LDL tillströmning efter behandling.
Figur 1 : Bearbetning Definition Mask. Representativa bilder av HK2 celler är avbildad efter applicering av lämpligt bearbetning definitionen (detaljerat i tabell 1). Visat areHK2 celler utan maskering (A), med fas-Maskapplied (B), med röda objekt Mask tillämpad (C), eller med både fas och röda objekt masker tillämpas (D). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Minskning av LDL upptag med live cell bildsystem över en 4,33 h tid kurs. Levande cellen analys system används för att mäta LDL tillströmningen i mänskliga nedsatt carcinoma (HEPG2) celler (A), humana renala tubulära (HK2) epitelceller (B) och (HCAE) mänskliga kranskärl endotelceller (C). Cellerna behandlades med Dynasore (10 min innan körningen) eller rPCSK9 (1 h innan körningen) som positiva kontroller. DMSO användes som ett medel för Dynasore behandlingar. Positiva kontroller minskade signifikant LDL inflödet i alla 3 cellinjer. LDL tillströmning värden erhölls av normalisera totala rött objekt integrerade intensiteten (RCUxµm2/image) till området totalt fas objekt (µm2/image). Uppgifterna är mean±SEM. N = 6 wells/grupp. Data är representativa för 2 eller 3 oberoende experiment. p < 0,0001 vs tom, och ###p < 0,0001 vs DMSO, med tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Ökning av LDL-upptag med levande cell imaging system över en 4,33 h tid kurs. Levande cellen analys system används för att mäta LDL tillströmningen i mänskliga nedsatt carcinoma (HEPG2) celler. LDL-upptag är ökat betydligt efter behandling med Simvastatin för 12 h (A), 18 h (B) eller 24 h (C) med hjälp av media som innehåller 2% FBS. 24 h tidpunkten utfördes även med media som innehåller 5% LPDS (utan FBS). DMSO användes som negativ kontroll. LDL tillströmning värden erhölls av normalisera totala rött objekt integrerade intensiteten (RCU x µm2/image) till området totalt fas objekt (µm2/image). Uppgifterna är mean±SEM. N = 6 wells/grupp. Data är representativa för en oberoende experiment. p < 0,0001 vs DMSO, med Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Signifikant LDL tillströmning reduktion av LDL upptag-sänkande medel 4,3 h tidpunkt. LDL inflödet minskar betydligt i mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler (A), humana renala tubulära (HK2) epitelceller (B) och mänskliga kranskärl (HCAE) endotelceller (C) efter behandling med LDL-upptag -hämmare Dynasore för 10 min eller rPCSK9 i 1 timme. LDL tillströmning ökas markant med Simvastatin i HepG2 celler efter 12, 18 eller 24 h behandlingar (D). Uppgifterna är mean±SEM. N = 6 wells/grupp. Data är representativa för 2 eller 3 oberoende experiment. p < 0,0001 med tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Minskade LDL tillströmningen i hepatocellulära carcinom (HepG2) celler av LDL upptag-sänkande agent, Dynasore. Representativa bilder av fas-objektet och röda objekt för HepG2 celler är avbildade på 0,33 h (vänster paneler) och slutpunkten 4,33 h (rätt panelerna) visar status felfri av celler. 40 µM Dynasore, kända för att minska LDL-kolesterol upptag, användes som positiv kontroll (C). Bilder är tagna vid 10 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Minskade LDL tillströmningen i humana renala tubulära (HK2) epitelceller av LDL-upptag-sänkande medel, Dynasore och rPCSK9. Representativa bilder av fas-objektet och röda objekt för HK2 celler avbildad på 0,33 h (vänster paneler) och slutpunkten 4,33 h (rätt panelerna) Visa friska status av cellerna. 40 µM Dynasore (C), eller 10 µg/mL rPCSK9 (D), är kända för att minska LDL kolesterol upptag, användes som positiv kontroll. Bilderna är tagna vid 10 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 . Minskade LDL tillströmningen i mänskliga kranskärl endotelceller (HCAECs) av LDL upptag-sänkande agent, Dynasore. Representativa bilder av fas-objektet och röda objekt för HCAECs skildras på 0,33 h (vänster paneler) och slutpunkten 4,33 h (rätt panelerna) Visa friska status av cellerna. 40 µM Dynasore, kända för att minska LDL-kolesterol upptag, användes som positiv kontroll (C). Bilder är tagna vid 10 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm. Data är mean±SEM. N = 6 wells/grupp. Data är representativa för 2 eller 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: bearbetning Definition parametrar. Dessa parametrar är specifika för den analyssystem som används i detta protokoll. Parametrar bör inrättas för att analysera röda området i den röda kanalen och området i cellen i kanalen fas. Parameterinställningar för HepG2, HK2, HCAE cellinjer presenteras.
Tabell 2: procentuell förändring i LDL tillströmningen i HepG2, HK2 och HCAE celler behandlas med Dynasore, rPCSK9 eller Simvastatin på 4,3 h. (A) HepG2 celler, (B) HK2 celler, (C) HCAE celler och (D) HepG2 celler.
Discussion
I det nuvarande protokollet demonstrera vi användningen av levande cell imaging som en ny och mer effektiv metod för att mäta realtid LDL-upptag under en tid i olika mänskliga cellinjer. Mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler används ofta i studier som screening för kolesterolsänkande therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Därför valde vi denna celltyp för att testa kapaciteten hos en levande cell bildsystem för LDL tillströmning studier. Våra resultat tyder på att HepG2 celler är förenliga med denna nya teknik och resultatet i en sigmoideum-liknande kurva som visar kontinuerlig LDL-upptag under hela tillströmning analysens tills 4,33 h som sista slutpunkt (figur 2A och figur 3 ).
Kolesterol homeostas spelar en viktig roll i patofysiologin bakom olika nefropatier. Faktiskt, kolesterol ackumulering i nedsatt vävnad är en stor bidragsgivare till nedsatt fibros leder till kronisk njursjukdom och är en större patologi i olika nefropatier28,29,30,31. Därför undersökte vi vår metod i humana renala epitelceller av (HK2) som en populär och pålitlig cellinje som utnyttjas inom njurmedicin. Våra data stöds också genomförbarheten av det levande cellen imaging systemet för att mäta LDL tillströmningen i HK2 celler. Som visas i figur 2B, tog HK2 celler upp LDL kolesterol linjärt under hela studien tillströmning (4 timmar).
På grund av vikten av kolesterol metabolism i utvecklingen och utvecklingen av åderförkalkning32,33,41, den ledande orsaken till hjärt-kärlsjukdomar, vilket i sin tur är den nummer ett dödsorsaken i hela världen 42, syftar vi till att validera vår metod i en åderförkalkning-relevanta celltyp. Vi använde mänskliga koronara Arterial Endothelial celler (HCAECs), eftersom dessa är en av de första celltyper att utsättas för en kolesterol förolämpning i kranskärl lumen av en åderförkalkning patient. Våra data som visas i figur 2C indikerar att LDL tillströmning metoden fungerar också effektivt med HCAECs. Den resulterande grafen är en sigmoideum-liknande kurva liknande till det av HepG2 celler.
För att testa giltigheten och känsligheten hos denna förbättrade LDL tillströmning analys för screening föreningar som påverkar LDL-kolesterol upptag, använde vi tre kontroller, LDL upptag-sänkande medel Dynasore och rPCSK9 och LDL tillströmning aktivator Simvastatin. Här, vi behandlat ovan nämnde cellinjer (HepG2, HK2 och HCAECs) med optimerad koncentrationer av Dynasore eller rPCSK9 innan tillströmningen analysen. Våra resultat visade att alla tre testade cellinjer svarade att behandlingarna med betydande minskningar i LDL tillströmning under en 4-timmars tid (figur 2). Exempelvis på 4,33 h som den slutliga tidpunkten, behandling med Dynasore vid 40 µM signifikant LDL tillströmningen i HepG2 celler, HK2 celler och HCAECs av 53%, 68% och 54%, respektive (p < 0,0001, Figur 2 A-C och Tabell 2A-C). Dessutom rPCSK9 på 10 µg/mL orsakade en markant 55% minskning i LDL tillströmningen i HK2 celler (p < 0,0001, Figur 2 B och tabell 2B). Våra resultat visade dessutom att behandla HepG2 celler med Simvastatin resulterade i en markant ökning LDL-upptag (figur 3), stödja känsligheten hos denna metod att upptäcka betydande förändringar i LDL tillströmningen. Studier av behandling med rPCSK9 i HepG2 och HCAEC celler ingår inte i detta protokoll som rPCSK9 används som en ytterligare kontroll behandling med väl dokumenterade resultat, men är kostsamt att köpa i små mängder. RPCSK9 var därför endast användas för att validera detta protokoll i HK2 celler.
Levande cellen imaging analys, tillsammans med funktionella och snabb mätning av LDL tillströmning, tillåtet för kontinuerlig övervakning av hälsa och morfologi av celler. Denna fördel kan effektivt identifiera potentiella cytotoxicitet tillämpad föreningar, vilket gör denna metod en idealisk teknik för samtidigt övervakning farmakologiska aktivitet och cytotoxicitet. Siffrorna 5-7 illustrera representativa bilder av tre testade cellinjer på den sista slutpunkten (4,33 h) som en visuell referens för effekten av behandlingarna som LDL Nettoinflödet och visar också den friska morfologin av celler efter de testade behandlingar. Vi rekommenderar okulärbesiktning av alla bilder från varje brunn för att försäkra heathy morfologi av celler under hela studien. Till exempel i data inte visas, när bilderna av HepG2 celler behandlas med 80 μM Dynasore inspekterades, vi observerade indikeringar av cell avlossning som kanterna på cellerna föreföll vara lyfta från plattan, vilket tyder på cell avlossning vid högre koncentrationer av Dynasore. Dessutom inducerad höga koncentrationer av simvastatin (3-10 μM) ledde också till förändrad morfologi indikera apoptos som rapporterats för höga doser av statiner45. Detta protokoll användes för att utföra en titrering av Dynasore behandling vid 20-80 μM och Simvastatin på 0,5-10 μM koncentration, varefter cellen bilderna användes för att analysera cellerna hälsa och fastställa potentiella ctotoxicity av behandlingar på olika koncentrationer. Resultaten föreslås användning av 40 μM för Dyansore och 1 μM för simvastatin som optimala koncentrationer.
Slutligen föreslår vi att utföra en cell densiteten titrering studie om en annan cellinje skall provas i denna metod för att identifiera den optimala mobilnummer per brunn för att få konsekventa resultat. Vår cell densiteten optimering studie visade att 10 000 celler per brunn i en 24-well platta leder till konsekvent LDL tillströmning utfallen för HK2 och HCAE celler. Det är viktigt att notera att för denna LDL tillströmning analys använder levande cell imaging system, en enskiktslager av icke-konfluenta celler jämnt fördelade på brunnarna är önskvärt som klumpar av celler kan ge upphov till fel i normaliserade LDL tillströmning slutvärdena. Anledningen till detta är att för normalisering av tillströmningen data, området fas objekt används som ett mått på cell densiteten och denna parameter kan påverkas negativt när cellen klumpar bildas. Vi observerade att HepG2 celler har en tendens att bilda klumpar när seedade vid tätheter högre än 5 000 celler per brunn orsakar inkonsekvent tillströmning resultat; Därför använde vi 5 000 celler per brunn i en 24-well platta som optimal täthet för HepG2 celler.
Kollektivt, ger vår metod en medium till hög genomströmning plattform för screening farmakologiska aktivitet och cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL tillströmning samtidigt. Denna metod kan lätt anpassas för användning med andra fluorescently-märkt ligander som anger den lysosomala facket för att utvärdera ligand upptag i realtid. Medan detta protokoll erbjuder specifikationerna för InCucyte bor imaging och analyssystem, protokollet kan anpassas för alternativa bildgivande system såsom Cellomics.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av följande bidrag till LAS: National Institute of Health (R56HL132209 och 1R01HL140468) och Miami hjärtat Research Institute. KY är en mottagare av amerikanska hjärtat Association pre Fellowship (18PRE33960070). HepG2 celler var vänligen tillhandahållen av Dr Emmanuel Thomas, universitet av Miami-Miller School of Medicine46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G.
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M.
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
