Summary
这篇手稿描述了单壁碳纳米管 (swcnt)-共轭 malat1 反义 gapgmer dna 寡核苷酸 (swcnt 反材料-malat1) 的合成, 这表明了 swcnt 的可靠交付和强大的治疗效果。抗马拉特1在体外和体内。介绍了用于 swcnt 抗 malat1 的合成、改性、共轭和注射的方法。
Abstract
单壁碳纳米管 (swcnt) 是一种新型的纳米粒子, 已被用于向细胞输送多种药物, 如蛋白质、寡核苷酸和合成小分子药物。swcnt 具有可定制的尺寸, 一个大的表面积, 并可以灵活地结合药物通过不同的修改, 在其表面;因此, 它是一个理想的系统, 运输药物到细胞。长非编码 rna (lnrna) 是一组时间超过200nt 的非编码 rna 群, 不能转化为蛋白质, 但在生物和病理生理过程中起着重要作用。转移性与肺腺癌相关的转录 1 (malat1) 是一种高度保守的 lncRNA。结果表明, 较高的 malat1 水平与各种癌症的预后不良有关, 包括多发性骨髓瘤 (mm)。我们发现, matr1 调节 dna 修复和细胞死亡在 mm;因此, matr1 可被视为 mm 的治疗靶点。然而, 反义寡核苷酸在体内有效传递给抑制-击倒 malat1 仍然是一个问题。在这项研究中, 我们修改了 swcnt 与 peg-2000, 并结合抗 mat1 寡核苷酸到它, 测试这种化合物的体外交付, 注入静脉注射 mm 小鼠模型, 并观察到一个显著的抑制 mm 进展, 这表明swcnt 是抗马拉特1口角 dna 的理想穿梭机。
Introduction
swcnt 是一种新型的纳米材料, 可提供各种类型的药物, 如蛋白质、小分子和核酸, 在体外 1和体内2具有理想的耐受性和最小毒性。功能化的 swcnt 具有很强的生物相容性和水溶性, 可作为小分子的穿梭点, 并可携带小分子穿透细胞膜 3,4,5.
lnrna 是一组 rna (gt;200 nt), 从基因组转录到 mrna, 但不能转化为蛋白质。越来越多的证据表明, ncrna 参与了基因表达的调节 6, 并参与了大多数类型癌症的发生和发展, 包括 mm7,8,9。mallat1 是一种富核非编码记录 2 (neat2) 和高度保守的 lncRNA 10。mat1 最初被认为是转移性非小细胞肺癌 (nsclc)11, 但已在许多肿瘤5,12,13过度表达;它是 mm8,14中表达最严重的信息之一, 与预后差有关。与仅确诊为 mm 15 的患者相比, 致命病程外髓质 mm 患者的 malat1 表达水平明显高于.
在先前的一项研究中, 我们已经证实, 抗 mat1 寡核苷酸在 mm 16 中使用 gapmer dna 反义寡核苷酸靶向 mm1 (抗 amalat1) 强致 mm 16 中的 dna 损伤和凋亡。gapmer dna 由反义 dna 组成, 并由 2 '-ome-rna 连接, 这可能会促使 mirat1 通过 rnase h 活性一旦结合 17.反义寡核苷酸的体内传递效率仍然限制了其临床应用。
为了测试 swcnt 对抗 amalat1 变指寡核苷酸的传递效果, 将抗 malat1 报的 dna 与 dspe-peg2000-胺功能化的 cnt 结合。然后将 swcnt 抗 matrat1 静脉注射到 mm 扩散小鼠模型中;经过四种治疗后观察到明显的抑制。
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Protocol
所有涉及动物的实验都是由克利夫兰诊所 iacuc (机构动物护理和使用委员会) 预先批准的。
1. 功能化 swcnt 的合成
- 将1毫克的 swcnt、5毫克的 dspe-peg2000 胺和5毫升的灭菌无核水混合在玻璃闪烁小瓶中 (20 毫升)。摇匀, 完全溶解所有试剂。
- 将小瓶放入水浴声纳中, 在室温下功率为 40 w, 1小时 (rt, 20分钟 x 3, 每20分钟更换一次水, 以避免过热)。然后, 以 24, 000 x g离心 6小时, 收集上清液。这种功能性的 swcnt 解决方案可在4°c 下储存2个月。
- 将1.2 步的 swcnt 溶液添加1毫升, 加入 100 kda mwco 离心过滤装置, 然后加入4毫升的无核消毒水。在 rt 以 4, 000 x克离心 10分钟, 以去除额外的 dspe-peg2000 胺。重复添加4毫升的水和离心5倍。每次离心后, 过滤器中会留下超过0.5 毫升的剩余 swcnt 溶液。
- 在最后清洗后, 使用 uv/vis 光谱仪在808纳米处测量滤清器中剩余的 swcnt 溶液的浓度。最终浓度通常约为 50 mgl (根据 kam 等人18 开发的方法计算)。
请注意:确保 dspe-peg 功能化的 swcnt 在步骤1.4 之后是水溶性的, 并且在不同的生物溶液中稳定, 几周后没有明显的聚集。
2. 2 '-o 改性 rna 与功能化 sscnt 的抗 mak询 1 gapmer dna 的结合
- 将0.5 毫克的磺胺 lc-spdp 加入450μl 的 dspe-peg2000-胺功能化 swcnt。加入50μl 的 10倍 pbs, 然后在 rt 孵育2小时。
- 要去除多余的 sulfo-lc-spdp, 请将步骤2.1 中的反应添加到 100 kda mwco 离心过滤装置中, 然后是4毫升无核酸水。在 rt 以 4, 000 x克的速度离心 10分钟, 重复增加4毫升的水和离心式5x。
- 在商业 dtt 溶液的 1.5 ml 中加入 200 nm 硫度改性抗 amalat1-cy3 gapmer dna, 并在 rt 孵育 90分钟. 按照制造商的协议, 用 naph 柱纯化产品。用500μl 的灭菌无核酸酶 1x pbs 对抗马拉特1-cy3 进行洗脱。
请注意:功能化的 swcnt 可以与 dtt 一起储存, dtt 可能会裂解在硫化抗 amalat1 报 dna 储存过程中形成的二硫化键。在与 swcnt 共轭之前, 可通过 nnap 柱去除添加的 dtt。 - 收集滤清器中剩余的磺化氯-spe-pgp--peg2000-胺 swcnt 溶液, 并用500μl 抗马拉t1-cy3 溶液稀释。然后, 在4°c 下孵育24小时。共轭 swcnt 抗 malat1 可在4°c 下保存3周。按照同样的程序, 可以合成具有争抢反义寡核苷酸的共轭 swcnt, 并将其用作 swcnt 控制。
3. swcnt-抗 makat 的尾静脉注射
-
生成 mm 传播的鼠标模型。
- 为了获得最佳的比较效果, 随机排列 14个 nod。cb17-prkdcscid j 小鼠 (8周大) 进入试验组或对照组 (每组7头), 其男性/女性比例相同。
- 清洁操作工作台, 用70% 的酒精消毒。
- 使用加热灯加热鼠标, 以帮助尾巴静脉出现。用尾部注射约束器正确地约束鼠标。
- 在50μl 的 pbs 中, 通过尾静脉注入 5 x 10 6 mm. 1s-luk-mchry 细胞, 无需麻醉。用酒精棉签按注射部位 30秒. 标记注射的老鼠, 然后将其返回干净的笼子。
-
在 mm.1 s 细胞注射后的第7天开始治疗。
- 将含有 swcnt 抗 malat1 的 pbs 注入小鼠的尾部静脉。使用包含 swcnt 控制的 pbs 作为控件。
- 用酒精棉签按压注射部位30秒。
- 观察尾巴局部出血和鼠标的一般行为 1分钟, 然后将其返回到干净的笼子。在将保持架返回之前, 请再次观察所有注射的小鼠, 以确保注射耐受性良好。
-
每隔7天重复一次注射, 直到实验结束。
- 当小鼠的一般健康状况下降时, 终止实验: 不进食或不饮酒时, 出现苍白的爪子, 任何皮下出血, 呼吸急促, 活动减少, 下肢瘫痪, 或可触摸的肿块在腹部被观察到。
4. 疾病进展评估
- 每天评估 mm.1-现有------------------------------------------------------------------如果小鼠出现下肢麻痹, 请特别注意。
-
在 swcnt 抗 malat1 注射之前, 使用每周1x 的体内成像系统评估肿瘤生长情况。
- 用 1x pbs 准备新鲜的 15 mgl d-lucferin。
- 将小鼠与异氟烷蒸发器进行麻醉 (诱导为 3-5%, 维护为 1-3%, 具体取决于小鼠的状态)。
- 在每个小鼠腹腔内注射 150 mg/kg d-luluferin, 成像前 5分钟;然后, 利用光谱成像系统将小鼠成像到一个易发的位置。
- 每2分钟收集一次老鼠的序列图像, 直到达到发光饱和度。根据 d-luluferin upau？信号调整间隔时间。
- 一旦实验结束, 使用 co2 来牺牲小鼠。
-
由于这是一个 mm 传播模型, 处理小鼠如下。
- 解剖前称重鼠标。
- 收集心脏外周血, 进行血细胞计数器机器进行的完整血细胞计数 (cbc) 检测。白细胞和红细胞的计数, 以及淋巴细胞的比例, 是主要指标。
- 隔离脾脏, 称重。计算脾脏重量的比例;认为 & gt;0.5% 为脾脏肿大。
- 收集骨髓、脾脏、淋巴结、肾脏和有明显转移的组织。
- 收集脊柱, 如果老鼠发展了下肢瘫痪。
- 从骨髓样本中提取 rna 和蛋白质。
- 将所有剩余的组织固定在福尔拉林中。
- 对于脱钙, 在固定24小时后, 将骨样品浸泡在 0.25 m edta 溶液 (ph 8.0) 中5天。
- 将75% 的酒精中的所有样品浸泡, 以便长期储存。
- 比较两组荧光素酶在同一时间点的信号强度。从这两个组中, 记录每个鼠标的牺牲日期, 并用软件计算两组的生存曲线。
请注意:图 1汇总了所有过程。
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Representative Results
为了证明抗 amat1 gapmer dna 在 mm 中的抑制作用, 我们击倒了菌与高级101的表达, 并将其应用于 h929 和 mm. 1s 细胞中。48小时后, 收集细胞, 分析细胞的击倒效率和细胞凋亡状态转染抗 mallat1 口吃或控制 dna。qrt-pcr 结果表明, 抗 makat1 间隙酶 dna 有效地降低了 h929 和 mm. 1s 细胞中的 halat1 表达 (图 2a)。流式细胞仪测定细胞凋亡的状态, 显示下调节的 mat1 诱导细胞凋亡显著 (图 2b)。
这些结果表明, 抗 mat1 寡核苷酸在体外有效抑制 mm。然而, 体内反 malat1 寡核苷酸的高效传递方法 (递供剂) 需要开发, 这也是反义寡核苷酸在临床应用中的障碍;因此, 我们对 swcnt 感兴趣。swcnt 是一种新型的给药纳米材料, 经过适当的修饰后, 具有亲水性和溶解性;因此, 它可以提供不同形式的货物, 如寡核苷酸药物。为了验证 swcnt 在体内的传递效率, 我们首先用 dspe-peg2000 胺对 swcnt 进行了功能化, 赋予了 swcnt19 的亲水性和结合特异性。然后, 该功能的 swcnt 进行了磺化氯-spdp 处理, 形成游离磺基, 用于与寡核苷酸连接。为了结合抗 mat1 寡核苷酸和经硫代 lc-spdp 处理的 swcnt, 用硫醇基团 (s-s) 对抗 mat1 寡核苷酸的 5 ' 端进行了改性;为了明显跟踪分娩, 用氰化物 3 (cy3) 对抗 mat1 寡核苷酸的 3 ' 端进行了改性。经过所有的合成步骤, 得到了 swcnt-抗丙烯酸 1-cy3 (图 1)12。然后, 将其添加到 h929-gfp 和 mm. 1s-gfp 细胞的培养基中, 验证了交付效率。
如图 2c 所示, swcnt-抗 mat1-cy3 被有效地输送到 mm 细胞的细胞核, 并显著抑制了 h929 和 mm.1s 细胞的内源性 mat1 水平 (图 2d)。为检测 swcnt 在正常细胞中的毒性和安全性, 在 bmec-1 细胞培养基中加入了不同浓度的 swcnt-抗菌--maalt1-cy3;脂胺是治疗控制;以纯介质作为基本控制 (图 2e)。然后, 在第1天、第2天和第3天使用细胞活力分析试剂盒检测细胞活力。swcnt-抗菌--cy3 与不同剂量和时间点的治疗控制在细胞活力抑制方面没有明显差异。与普通介质 (nc) 相比也没有差异, 这表明 swcnt 抗 malat1-cy3 的毒性与治疗控制相似, 对高剂量的正常细胞具有有限和可接受的毒性。
其次, 建立了人与 mm 的传播小鼠模型, 以评价 swcnt-mati 1 在体内的治疗效果。首先, 每只 scid-米色小鼠 (8周大) 被静脉注射 5 x 10 6 mm. s-luccherry 细胞静脉注射 (图 3).共给14只小鼠注射了 mm.1 s 细胞;其中7只小鼠随机排列成 swcnt-抗菌--cy3 治疗组, 对照组7只。swcnt 抗 malat1 和 swcnt 对照寡核苷酸在肿瘤细胞注射7天后的 1.1倍 pbs 0.5 ml 中溶解并通过尾静脉注射。swcnt-抗 mat1-cy3 处理每7天重复一次, 直到实验结束。为了评估肿瘤负担, 在 swcnt 寡核苷酸注射前一周的荧光素注射液1。我们发现, 在21天的治疗 (从第28天开始) 后, swcnt-抗 mat1 治疗组小鼠的荧光素信号明显低于 swcnt 对照治疗组。他们的健康和生存状况每天都被检查和记录, 并在卡普兰-梅耶尔曲线中总结。从这些结果, 我们得出结论, swcnt 抗 malat1 静脉注射治疗可以有效地提供抗 malat1 寡核苷酸肿瘤细胞。然后, 我们限制了肿瘤负担, 并扩大了小鼠的寿命 (p = 0.04), 这是类似的体外结果。在整个实验期间, 我们没有发现这种治疗对小鼠有任何明显的副作用, 表明 swcnt 抗 palat1 注射液是一种安全的小鼠治疗方法;因此, swcnt 是一种安全可靠的抗马尔at1 体内输送系统。
图 1: swcnt-抗 malat1-cy3 霍聚寡核苷酸的合成、吸收和体内离解示意图.(a) swcnt 与 dspe-peg2000 胺功能化, 随后通过硫-lc-spdp 介导的二硫连接与抗马拉特1-cy3 结合。(b) 通过尾静脉将 swcnt 共轭抗 makat1 注射到一只小鼠体内。(c) swcnt 共轭抗 makat1 通过插入或内吞穿透磷脂双层膜。(d) 在细胞吸收后, 将 swcnt 抗菌委1包装在早期内生体中;然后, 早期的内生体成熟到晚期内生体, 并与溶酶体合并形成内溶体。内溶酶体通过破坏二硫键, 帮助从 swcnt 中释放抗马拉特1。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:swcnt 抗 malat1 在 mm 细胞系中得到了有效的毒性和诱导细胞凋亡.用脂质体胺将 swcnt 抗 malat1 型气相环寡核苷酸或 swcnt 对照寡核苷酸分别转染 h929 和 mm. 1s 细胞。48小时后, 我们收集细胞进行 (a) qrt-pcr 分析菌斑 1, (b) 流式细胞仪分析细胞凋亡。(c) h929-gfp 和 mm. 1s-gfp 细胞与 swcnt-mat-mat1-cy3 共同培养 48小时;用荧光显微镜 (刻度柱 = 100μm) 测定了交货效率。(d) 用 qrt-pcr 检测出 malat1 的表达水平, 表明在 h929 和 mm. 1s 细胞 (* * p < 0.01、* * * p < 0.001) 中成功击倒。(e) 将 swcnt 和治疗控制添加到不同剂量的 bmec-1 细胞培养基中。用细胞活力分析试剂盒测定了增殖情况。这一数字已从胡等人16人的修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: swcnt 抗 makat 1 抑制骨髓瘤生长在 mm. 1s 细胞构建的 mm 传播小鼠模型中.(a) 5 x10 6 mmm.1s-luc-mchry 细胞被静脉注射到辐照的 scid-beige 小鼠的尾静脉中 (每组7例);从 mm.1 s 细胞注射后的第7天起, 每7天通过尾静脉注射 50μl swcnt-抗 mat1 或 swcnt 控制溶液。ivis 被用来监测肿瘤的生长。以下肢麻痹和肿瘤负担为终点, 并通过卡普兰-梅耶尔分析生存数据。这一数字已从胡等人16人的修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
有证据表明, ncrna 参与调节癌症的多种生理和病理生理程序, 包括 mm7,8,9;它们有可能成为癌症治疗的目标, 而反义寡核苷酸20、21、22 可以实现。美国食品药品监督管理局 (fda) 已批准了几种反义寡核苷酸药物, 包括用于巨细胞病毒视网膜炎23的 fomivirsen、用于纯合家族性高胆固醇血症的mipomersen 24、用于 ususinersen 的非义寡核苷酸药物脊髓肌萎缩25, 和 eteplirsen 为杜氏肌营养不良症26。在本研究中, 我们用 2 '-ome-rna 对抗 mirat1 报的 dna 进行了修饰, 并将其与功能 swcnt 结合。swcnt 携带和提供反 malat1 寡核苷酸作为穿梭, 这不仅提高了寡核苷酸目标的亲和力, 因为它的灵活性和多重负载, 而且还稳定了寡核苷酸, 并有助于防止在交付过程中的核酸酶退化27.
在 swcnt 表面进行适当的改性, 可帮助其在与生理相关的水环境中获得可靠的分散性, 并促进其生物分布28,29。我们用 dspe-peg2000 胺对 swcnt 进行了改性, 并对其进行了接枝, 提高了其水溶性, 在生物介质30中表现出了良好的稳定性。在实验中, 磺胺-lc-spdp 被用作交联剂, 这有助于功能化的 swcnt 通过二硫化链结合抗 malat1 交联 dna, 然后将其传递到细胞中。一旦 swcnt 穿透 mm 细胞, 他们被早期内质体 (ph ~ 6.0) 吸收, 然后成熟到晚期内质体 (ph ~ 5.0) 伴随着 ph 值31的降低。peg 链接的优点是键在 ph 值和 gt;6 时稳定, 但一旦 ph 值小于 5.532,33, 34,在2小时内释放了多达75-95% 的 peg 连接药物。携带 swcnt 抗 makat1 的内质体与溶酶体 (ph ~ 4.5) 结合形成内溶酶体, 然后由溶酶体硫醇还原酶催化二硫醇键, 在低 ph 值35下最佳活化。这, 随后, 释放出免费的抗 amalat1 口吃 p。根据体外和体内的实验结果, swcnt 有效地提供了 swcnt-抗 malat1, 并帮助其在体外与抗马拉特1具有类似的作用。
功能化的 swcnt 通过两种模式通过磷脂双层: 插入36、37 和内吞38、39.这些程序有助于 swcnt 在不中断细胞膜稳定的情况下将货物输送到细胞, 从而降低了 swcnt 的毒性。我们在每只小鼠 (~ 20 克) 中注射 50μl swcnt-抗菌--maalat1 (~ 40mgl);因此, 最终药物浓度为 0.1 mg kg, 比我们在毒性实验中使用的剂量 (2 mgl 和 4 mgl) 要低得多。正如先前的结果所显示的, swcnt 在匹配剂量下对细胞生长和活力的治疗控制 (例如, 脂胺) 具有类似的效果。治疗控制是细胞转染的常见试剂, 相信对细胞的毒性有限, 可以接受;因此, 我们认为 swcnt 对正常细胞的毒性是最小的。
代谢作为反义寡核苷酸的穿梭物, 是影响 swcnt 安全性的另一个重要考虑因素。结果表明, 功能化的 swcnt 主要通过肾脏排泄, 无肾小球和肾小管毒性40。在接受 swcnt 注射液的小鼠中, 我们没有发现与肾脏功能异常相关的症状, 如少尿、无尿 、水肿、肾脏外观变化等。因此, 由于肾功能正常的小鼠存在任何异常积累, swcnt 没有毒性影响。
我们是第一个结合反义寡核苷酸瞄准每个 ncrna 与功能化 lncRNA, 并将其用于 mm 治疗。swcnt 是一种新型纳米材料, 具有一致的手性、可选直径和长度分布。经过功能化处理后, swcnt 发展出水溶性和生物相容性, 成为通过细胞膜运送众多货物的理想生物穿梭机, 从而增加药物分布, 提高治疗效果。此外, swcnt 还可以稳定核酸酶消化产生的反义寡核苷酸分子 1.结果表明, 功能化的 swcnt-抗 mat1 有效地将 mat1 输送到 mm 细胞中, 并在体外细胞系和体内的传播小鼠模型中显著抑制 mm 的生长。到目前为止, 我们没有观察到任何毒性由于 swcnt 治疗在这些实验。这项研究表明, swcnt 是反义寡核苷酸药物的安全有效的载体, 有可能被用作治疗分子的载体在患者。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢勒纳研究所的蛋白质组学、基因组和成像核心的帮助和支持。资金: 这项工作得到了 NIH/NCI 赠款 r00 ca17292 (给 j. z.) 和启动资金 (jj. z.) 和凯斯西储备大学核心利用试点赠款 (j. z.) 临床和转化科学合作 (ctsc) 的财政支持。这项工作使用了 leica sp8 共聚焦显微镜, 该显微镜是在国家卫生研究院 sig 赠款1s10od01992-01 下购买的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
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