Summary
该协议描述了使用多色4D(延时3D)共聚焦显微镜对萌芽酵母中荧光标记细胞内腔的分析。选择成像参数是为了捕捉足够的信号,同时限制光损伤。自定义 ImageJ 插件允许跟踪和定量分析标记的结构。
Abstract
该协议的目的是描述膜腔在萌芽酵母的活细胞中如何形成和转化。酵母中的许多细胞内腔是动态的,要充分了解其特性,需要延时成像。多色 4D 共聚焦荧光显微镜是一种强大的方法来跟踪细胞内隔间的行为和组成,时间尺度为 5-15 分钟。 严格分析隔间动力学需要捕获数千个光学部分。为了实现这一目标,光漂白和光毒性通过以极低的激光功率快速扫描而最小化,像素尺寸和 Z 步长间隔设置为与全分辨率采样图像兼容的最大值。生成的 4D 数据集是嘈杂的,但可以通过反卷积来平滑。即使使用高质量的数据,分析阶段也极具挑战性,因为细胞内结构通常数量众多、异构且具有流动性。为了满足这一需求,将自定义 ImageJ 插件写入计算机屏幕上的阵列 4D 数据、识别感兴趣的结构、编辑数据以隔离单个结构、量化荧光时间课程以及制作投影 Z 堆栈的影片。4D 电影特别适用于区分稳定隔间与通过成熟而翻过来的瞬态隔间。此类电影还可用于描述诸如隔间融合等事件,并测试特定突变或其他扰动的影响。
Introduction
内膜系统的隔间在不断变化,其完整的表征需要活细胞成像。此处描述的是使用 4D(延时 3D)共聚焦显微镜来可视化萌芽酵母中荧光标记的隔间的协议。该方法被开发来跟踪皮基亚牧师和萨查莫西斯塞雷维西亚1,2,3的分泌隔间的动态。该协议侧重于S.cerevisiae,它有一个非堆叠的Golgi,其中单个蓄水池是光学上可解析的4。S.cerevisiae的不寻常的戈尔吉组织通过 4D 显微镜演示了 Golgi csterna 最初与居民早期戈尔吉蛋白贴标签,然后在获取居民晚期戈尔吉蛋白 3 时丢失这些蛋白质 , 5.这种过渡可以通过创建一个菌株来可视化,其中早期的Golgi蛋白Vrg4被标记为GFP,而晚期的Golgi蛋白Sec7则标有单体红色荧光蛋白。当跟踪单个蓄水池时,成熟被观察为绿色到红色转换3。这种类型的分析可以提供有关蛋白质定位和隔间标识的宝贵信息。例如,两种稍微偏移到达和离开时间的蛋白质有时在静态图像中可能显示标记不同的隔间,但在 4D 电影中可以看到,可以在不同时间点6、7 标记同一隔间.因此,4D 显微镜揭示了其他不明显的现象。
酵母舱的信息4D显微镜可以通过适当的程序和设备2实现。只要有可能,荧光蛋白标记通过基因替换8执行,以避免过度表达伪影。由于细胞内结构通常非常动态,因此需要 4D 成像,以确保随着时间的推移可靠地跟踪结构。此处描述的协议采用激光扫描共聚焦显微镜,配备高灵敏度探测器。使用此装置,S.cerevisae的整个细胞体积大约每 1-3 秒可通过共聚焦显微镜成像,通常为 2 秒间隔。根据荧光水光水线的标签密度及其光物理特性,可以收集长达 5-15 分钟的数据。主要障碍是尽量减少光漂白。为此,激光强度尽可能低,共聚焦扫描速度最大化,光学参数配置为在奈奎斯特极限下成像,以便捕获相关信息,同时避免过度的光线照射。这些设置也有望减轻光毒性,在活细胞成像9,10,11中经常被忽视的因素。由此产生的噪声数据使用漂白剂校正和去卷积算法进行处理,以促进荧光强度的量化。
即使使用高质量的 4D 电影,分析也十分棘手,因为酵母隔间往往数量众多、异构且可移动。由于共聚焦显微镜的内在局限性以及长时间 4D 成像所需的非最佳设置,彼此接近的荧光结构难以解析。这个问题可以通过关注在标签期间保持光学可解的少量荧光结构来规避,并假定这些结构代表标签的全体人群车厢。通过观看投影 Z 堆栈的影片和创建一系列蒙太奇,将每个时间点的光学部分排列在计算机屏幕上,可以可靠地跟踪的荧光隔间可以识别。此分析采用自定义 ImageJ12插件,允许单独跟踪单个结构。
最近的方法论文涵盖了荧光蛋白在酵母13中的使用,以及酵母细胞2的4D共聚焦成像的理论与实践。该协议侧重于 4D 成像实验的关键实际方面。它包括以前描述的过程的一些增强功能,以及 ImageJ 插件代码和文档的更新版本。所示示例侧重于 Golgi 动力学,但此协议同样适用于成像其他酵母腔。
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Protocol
1. 准备
- 使非荧光最小 NSD 介质2.核黄素的缺乏有望减少细胞内背景绿色荧光和相关光毒性。
- 在+23°C下一夜之间将酵母菌株生长在5mL NSD中的对数相中,在50 mL的挡争议烧瓶中具有良好的曝气。分析前约3-4小时,稀释新鲜NSD中的酵母培养,使最终的OD600在成像时为0.5-0.8。
- 制备2mg/mL的康卡纳林A(ConA)溶液。如果需要,将此溶液的等分液冷冻在液氮中,并储存在-80°C。
- 在微离心机中全速旋转 ConA 溶液 5 分钟,以去除可能干扰成像的颗粒物。然后,将250μL的上清液加入干净的35毫米盖玻璃底显微镜盘中。15分钟后,用2 mL的dH2O洗涤2-3次,然后晾干。
- 将 250 μL 的酵母培养液加入 ConA 涂层盘中,等待 10 分钟,让细胞粘附,用 2 mL NSD 轻轻洗涤 2-3 次。用2 mL新鲜NSD覆盖细胞。
2. 成像
- 使用 63x 或 100x 油浸透镜。数值光圈 (NA) 为 1.40 就足够了,但也可以使用较高的 NA 镜头。
- 将帧大小设置为 256 x 128(宽度 x 高度)。如果需要更大的帧大小,只要共聚焦显微镜配备谐振扫描仪,增加宽度不会降低扫描速度。
- 调整缩放系数,使像素大小为 ±80 nm。
- 使用最大扫描速度,通常为 8 kHz。打开双向 X 扫描(如果可用)以及控制实验确认来自两个方向的扫描已注册。
- 将行累积设置为 4 或 6。请务必使用累积(求和)而不是平均。
- 将针孔设置为 1.2 通风单元。经验上,当成像活酵母细胞时,此设置捕获的光子比标准选择的 1.0 Airy 单位多,同时不会造成明显的分辨率损失。
- 对于每个荧光通道,设置激发波长,指定高灵敏度探测器,设置发射波长范围,并打开光子计数模式(如果可用)。波长的选择将取决于荧光道。例如,在 485 nm 处激发 GFP 荧光,从 495-550 nm 收集,在 555 nm 时激发 mscarlet 荧光,从 562-625 nm 收集。
- 将每个激光的强度设置为尽可能低。此设置必须根据经验确定。适当的强度将导致捕获嘈杂但可解释的图像序列,到 5 分钟电影结束时,荧光信号漂白不超过 50%。在此处使用的共聚焦显微镜上(参见材料表),此强度对应于 5% 的激光功率设置。
- 使用陷波滤波器或时间浇注,以避免从盖玻片捕获反射光。如果时间浇注可用,则将浇注窗口设置为 0.6-10.0 ns。
- 打开亮场成像,并使用低灵敏度检测器进行数据收集。将增益设置为使单元格清晰可见的水平。请勿使用差分干涉对比度 (DIC),因为棱镜会干扰可靠荧光数据的捕获。
- 将 Z 步长间隔设置为 0.25-0.35 μm。通过收集每个 Z 堆栈大约 20-25 个光学部分来映像酵母细胞的整个体积。指定成像的方向性,以便"向下"向封面滑动移动。
- 对于典型的电影,将 Z 堆栈之间的时间间隔设置为 2 秒,并将影片持续时间设置为 5 到 10 分钟。 根据所研究的隔间,缩短间隔以制作相对快速动态的较短影片,或增加间隔以制作更长的影片。相对缓慢的动态。
- 将影片另存为 LIF 文件,最后一个通道中带有亮场图像。在此阶段不需要更高的位深度,并且处理管道配置为接受 8 位 TIFF 数据。
3. 递减
- 使用经典最大可能性估计算法启动去卷积软件(见材料表)。
- 打开步骤 2.13 中生成的数据集。选择"去卷积向导"。检查"参数向导"中显示的值。应检测并正确显示成像参数。在"折射量"下,将"嵌入 Med"值更改为 1.40 以近似酵母细胞质。在"封面滑动"下,选择"启动编辑器"和"估计位置"和"确定"以设置封面滑移位置。选择"设置所有已验证"和"接受"。
- 继续通过每个荧光通道的"去卷积向导"。选择"手动"作为背景估计的模式。检查原始数据荧光强度曲线以确定估计的背景值,通常约为 0.1。
- 在去卷积设置菜单中,输入"最大迭代次数"值 40 并关闭漂白剂校正。输入估计的 SNR 值,通常约为 5.0。单击"去向"。
- 如有必要,返回到原始数据文件,调整背景和 SNR 值,并重复去卷积,直到噪声充分消除,而不会消除昏暗结构的真荧光。
- 合并明场和去波荧光通道。对于 ImageJ 中的后续影片编辑步骤,请排列"红色第一",下一个为绿色(如果存在),下一个为蓝色(如果存在),将亮场为最后一个。将图像序列另存为 8 位 TIFF 文件。
4. 漂白校正和电影生成
- 将去向扫描图像序列导入 ImageJ,并通过选择"图像 > 超级堆栈 > 堆栈"转换为超堆栈将其转换为超堆栈。从下拉菜单中选择"xyzct",然后填写通道数、Z 堆栈切片和时间范围(http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector)。
- 选择图像 > 颜色 > 拆分通道。
- 使用http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector提供的 ImageJ 插件校正光漂白荧光通道。下载并安装该插件后,选择插件 > EMBLtools > 漂白校正。选择"指数拟合"。
- 要将亮场和漂白校正荧光通道合并到超堆栈中,请选择"图像 > 颜色 > 合并通道"。将生成的超堆栈另存为 8 位 TIFF 文件。
- 安装此协议提供的自定义 ImageJ 插件。按照随附文档中的说明查看、编辑和量化图像序列,并生成投影 Z 堆栈的最终影片。
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Representative Results
这里给出的例子文档并量化了双色4D共聚焦显微镜3所示的两个酵母Golgi蓄水池的成熟。酵母细胞含有10-15 Golgi蓄水池的顺序,每个细胞在大约2-4分钟的一段时间内成熟。 成熟可以通过用GFP标记早期的Golgi标记Vrg4和用红色荧光标记已故的Golgi标记Sec7来可视化蛋白质,如mCherry或mscarlet。单个蓄水池标签最初带有 Vrg4 标记,然后经历一个短暂的转换,其中标记被交换,然后使用 Sec7 标记标记。
由于该细胞包含多个 Golgi 蓄水池,相当可移动,因此在整个标记期间遵循单个蓄水池是具有挑战性的。由于图像数据的时间和空间限制,Cisternae 通常过于接近,无法明确解决。此外,戈尔吉蓄水池偶尔引信14,和晚期戈尔吉蓄水池往往聚集在两极生长15的部位。因此,4D 电影很少产生一个或两个可以可靠地跟踪的蓄水池。该方法中最具挑战性的步骤之一是检查 Z 堆栈投影的初始影片,并确定有希望进行分析的候选项的蓄水池。
这些图描述了过程中的顺序步骤:
图 1显示了来自原始数据或去卷和漂白校正数据的 Z-Stack 投影影片的帧。图 1A比较原始数据与去卷数据的第一帧。图 1B来自同一个 deonvolved 影片,并显示了几个帧,其中首先使用绿色 Vrg4 标记分析标签的两个蓄水池,后来又使用红色 Sec7 标记。之所以选择这些蓄水池,是因为它们在大部分电影中明显与其他标记结构分开。此图中的图像是使用"制作蒙太奇系列"、"蒙太奇系列到超堆栈"和"项目超堆栈"插件,从原始或去卷和漂白校正的 4D TIFF 超堆栈生成的。
图 2显示了在编辑之前和之后为其中一个时间点为 Z 堆栈创建的蒙太奇的一部分,以将信号与所选的 cisternae 之一隔离开来。下图中的图像是使用"制作蒙太奇系列"和"编辑蒙太奇系列"插件,从去水化和漂白校正的 4D TIFF 超堆栈生成的。
图 3显示了投影 Z 堆栈(视频 1)最终影片中的几帧,原始投影位于顶部,编辑的投影位于底部。此图中的图像是从原始和编辑蒙太奇使用"蒙太奇系列到超级堆栈","合并超堆栈"和"项目超堆栈"插件生成和编辑的蒙太奇。
图 4显示了所选蓄水池的绿色和红色荧光信号的定量。此图的数据是使用"分析编辑的影片"插件从编辑的超堆栈生成的。
对这些Golgi蓄水池的分析表明,Vrg4标记到达并持续约80秒,然后Sec7标记到达并持续约60秒,两个标记之间有短暂的重叠期。如本示例所示,4D 成像提供有关酵母腔室动力学的定性和定量信息。
图 1:4D 影片中 Z 堆栈的投影。(A) 从 4D 影片中的第一个 Z 堆栈中投影原始数据(左)和去卷数据(右)。绿色信号来自GFP-Vrg4,红色信号来自Sec7-mScarlet,灰色信号是酵母细胞的明场图像。比例条 = 2 μm . (B) 代表帧,代表性帧来自 (A) 中所示的解扫描和投影 Z 堆栈的初始影片。指示时间点。箭头标记了选择进行分析的两个蓄水池。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:与 01:20 时间点对应的 Z 堆栈中的蒙太奇部分。蒙太奇中的每个图像都是光学部分。顶部面板显示原始蒙太奇的一部分,底部面板显示编辑的蒙太奇的相应部分,其中选择性地保留来自所选蓄水池的荧光信号。在每个面板中,光学部分在第一行中从左到右排序,然后在第二行中从左到右排序。比例尺 = 2 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:投影 Zstack 的最后一部电影中的帧。在 Video 1 中的这些摘录中,原始图像显示在编辑的图像上方。前五个帧显示一个经过绿色到红色过渡的蓄水池,接下来的五个帧显示经历类似过渡的第二个蓄水池。原始图像上覆盖的箭头表示被跟踪的蓄水池。比例尺 = 2 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:视频1的荧光信号的量化。图表表示从选择用于分析的两个蓄水池的 GFP-Vrg4 和 Sec7-mscarlet 信号,其中顶部面板表示在电影开头可见的蓄水池,底部面板表示可见的蓄水池稍后在电影。在首次检测到 GFP-Vrg4 荧光之前,每个蓄水池的时间为帧定义零。请点击此处查看此图的较大版本。
视频 1:投影 Z 堆栈的最终影片。上部面板显示原始投影,下面板显示编辑的投影,其中仅显示为分析而选择的两个蓄水池。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
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Discussion
酵母细胞器的4D共聚焦成像需要仔细调整多个参数。主要问题是光漂白和光毒性。典型的 4D 影片涉及收集数千个光学部分,因此激光照明必须保持在尽可能低的位。串联荧光蛋白标记可用于增强信号,而不会增加标记蛋白16、17的表达。最大化扫描速度有助于限制光损伤,还允许在适当的短间隔内捕获 Z 堆栈。在XY和Z中,在奈奎斯特极限处的体素尺寸最小化了光暴露,同时理论上可以恢复光学设置18中的信息。最后,光学部分包含信号区域中的每个体素通常只接收 1-3 个光子。此信息量远低于通常建议使用单个 Z 堆栈进行最佳成像或反卷积时建议的信息量。但是,去卷积仍然有助于平滑噪声信号,并且此类数据集可以进行分析和量化。
即使使用高质量的 4D 数据集,跟踪标记的细胞器也是一项复杂的任务。使用此处提供的 ImageJ 插件,研究人员可以在计算机屏幕上阵列每个 Z 堆栈,并可以轻松地在时间点之间以及原始数据和编辑的数据之间来回移动。这些工具允许通过时间和空间以合理的信心跟踪标记的结构。然而,主观判断起着必要的作用,必须尽可能避免偏见。粒子跟踪软件可能会有所帮助,但还不足以解决正在研究的大多数现象。为了抵消这一限制,最好检查多个标记,并以不同的方式测试模型的预测3、6、7。
4D共聚焦成像在描述酵母分泌和内分泌途径方面起着关键作用。这种方法证明,ER出口场形成de novo和无限期坚持1,确认戈尔吉囊成熟3,5,并澄清了COPI囊泡涂层在戈尔吉成熟7的作用, 19.最近,4D成像提供了证据,酵母早期内生体是相同的晚期戈尔吉,并且酵母晚期内质体是一个长寿的隔间6。虽然荧光标记隔间的静态成像仍然很有价值,但 4D 成像提供了对酵母细胞器操作原理的独特见解。
一个令人兴奋的最近发展在荧光标记20的自我标记蛋白质的可用性。SNAP 标签作为酵母中的融合伙伴表现不佳,但 HaloTag 表现良好。明亮和光稳定膜的HaloTag基板21使得使用远红色染料6进行4D共聚焦成像成为可能。在以前使用的绿色和红色成像通道中添加远红成像通道,允许强大的三色4D显微镜23,从而扩大可以通过活细胞成像在酵母中研究的现象范围。
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Disclosures
提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH赠款R01 GM104010的支持。感谢在综合显微镜核心设施为Vytas Bindokas和Christine Labno提供荧光显微镜帮助,该设施由NIH资助的癌症中心支持赠款P30 CA014599提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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