Summary
Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.
Abstract
Het doel van dit protocol is om te karakteriseren hoe membraan compartimenten vorm en transformeren in levende cellen van ontluikende gist. Veel intracellulaire compartimenten in gist zijn dynamisch, en een volledig begrip van hun eigenschappen vereist timelapse-beeldvorming. Multi-Color 4D confocale fluorescentiemicroscopie is een krachtige methode voor het bijhouden van het gedrag en de samenstelling van een intracellulaire compartiment op een tijdschaal van 5-15 min. een grondige analyse van het compartiment dynamiek vereist de vangst van duizenden optische Secties. Om dit doel te bereiken, worden fotobleaching en fototoxiciteit geminimaliseerd door snel te scannen bij zeer lage Laser stroom, en de pixelafmetingen en Z-stap intervallen worden ingesteld op de grootste waarden die compatibel zijn met het bemonsteren van de afbeelding met volledige resolutie. De resulterende 4D-datasets zijn luidruchtig, maar kunnen worden gladgestreden door deconvolutie. Zelfs met gegevens van hoge kwaliteit is de analyse fase uitdagend omdat intracellulaire structuren vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Om aan deze behoefte te voldoen, zijn aangepaste ImageJ-plug-ins geschreven naar array 4D-gegevens op een computerscherm, identificeren van belangen structuren, bewerken van de gegevens om individuele structuren te isoleren, kwantificeren de fluorescentie tijd cursussen en maken films van de geprojecteerde Z-stacks. 4D-films zijn vooral handig voor het onderscheiden van stabiele compartimenten van tijdelijke compartimenten die omkomen door rijping. Dergelijke films kunnen ook worden gebruikt om gebeurtenissen zoals compartiment fusie te karakteriseren en om de effecten van specifieke mutaties of andere verstoringen te testen.
Introduction
Compartimenten van het endomembraansysteem-systeem zijn in constante flux en hun volledige karakterisering vereist Live-celbeeldvorming. Hier beschreven is een protocol dat 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie gebruikt om fluorescently gelabelde compartimenten te visualiseren in ontluikende gisten. De methode werd ontwikkeld om de dynamiek van secretoire compartimenten in Pichia pastoris en Saccharomyces cerevisiae1,2,3te volgen. Dit protocol richt zich op S. cerevisiae, die een niet-gestapelde Golgi heeft waarin de individuele cisternae optisch resolveerbaar4zijn. De ongewone Golgi-organisatie in S. cerevisiae heeft de demonstratie van 4D microscopie mogelijk gemaakt dat een Golgi Cisterna aanvankelijk etiketten met Resident vroege Golgi-eiwitten, en vervolgens deze eiwitten verliest tijdens het verwerven van Resident late Golgi-eiwitten3 ,5. Deze overgang kan worden gevisualiseerd door het creëren van een stam waarin de vroege Golgi eiwit Vrg4 is gelabeld met GFP terwijl de late Golgi eiwit Sec7 is gelabeld met een monomere rode fluorescerende eiwitten. Wanneer individuele cisternae worden bijgehouden, rijping wordt waargenomen als een groen-naar-rood conversie3. Dit type analyse kan waardevolle informatie geven over de eiwit lokalisatie en de identiteit van het compartiment. Bijvoorbeeld, twee eiwitten met licht offset aankomst-en vertrektijden kunnen soms lijken om verschillende compartimenten te labelen in statische beelden, maar kunnen worden gezien in 4D-films om hetzelfde compartiment op verschillende tijdstippen te labelen6,7 . Zo onthult 4D microscopie verschijnselen die anders niet duidelijk zouden zijn.
Informatieve 4D microscopie van gist compartimenten kan worden bereikt met de juiste procedures en apparatuur2. Waar mogelijk wordt fluorescerende eiwit tagging uitgevoerd door Gene Replacement8 om overexpressie artefacten te voorkomen. Omdat intracellulaire structuren vaak zeer dynamisch zijn, is 4D-beeldvorming nodig om ervoor te zorgen dat een structuur na verloop van tijd betrouwbaar wordt bijgehouden. Het protocol hier beschreven maakt gebruik van een laser scanning confocale Microscoop uitgerust met hoge gevoeligheid detectoren. Met dit apparaat kan het volledige celvolume van S. cerevisiae worden afgebeeld met een confocale microscopie ongeveer elke 1-3 s, waarbij 2 S-intervallen kenmerkend zijn. Gegevens kunnen worden verzameld voor maximaal 5-15 min afhankelijk van de dichtheid van de fluoroforen en hun fotomophysical eigenschappen labelen. De belangrijkste hindernis is het minimaliseren van photobleaching. Voor dit doel worden de laser intensiteiten zo laag mogelijk gehouden, de confocale scansnelheid is gemaximaliseerd, en de optische parameters zijn geconfigureerd voorbeeld bij de Nyquist-limiet om de relevante informatie te vangen terwijl overmatige licht blootstelling wordt vermeden. Deze instellingen worden ook verwacht om de fototoxiciteit te verlichten, een factor die vaak over het hoofd wordt gezien tijdens Live-celbeeldvorming9,10,11. De resulterende lawaaierige gegevens worden verwerkt met bleekmiddel correctie en deconvolutie algoritmen om kwantificering van fluorescentie intensiteiten te vergemakkelijken.
Zelfs met 4D-films van hoge kwaliteit is de analyse lastig omdat gist compartimenten vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Vanwege de intrinsieke beperkingen van confocale microscopie en de niet-optimale instellingen die nodig zijn voor langdurige 4D-beeldvorming, zijn fluorescerende structuren die in de buurt van elkaar liggen moeilijk op te lossen. Dit probleem kan worden omzeild door zich te concentreren op het kleine aantal fluorescerende constructies dat voor de duur van de etiketterings periode optisch afwikkelbaar blijft, met de veronderstelling dat deze structuren representatief zijn voor de hele populatie van gelabelde Compartimenten. Fluorescerende compartimenten die betrouwbaar kunnen worden bijgehouden, worden geïdentificeerd door films van geprojecteerde Z-stacks te bekijken en door een reeks montages te maken waarin de optische secties voor elk tijdpunt op een computerscherm worden weergegeven. Deze analyse maakt gebruik van aangepaste ImageJ12 plugins, die het mogelijk maken een individuele structuur in afzondering worden bijgehouden.
Recente methodes papers bestreken het gebruik van fluorescerende eiwitten in gist13 , evenals de theorie en praktijk van 4D confocale beeldvorming van gistcellen2. Dit protocol richt zich op de belangrijkste praktische aspecten van een 4D Imaging experiment. Het bevat enkele verbeteringen aan eerder beschreven procedures, evenals bijgewerkte versies van de ImageJ-invoegtoepassing code en documentatie. Het getoonde voorbeeld richt zich op Golgi-dynamiek, maar dit protocol is ook geschikt voor de beeldvorming van andere gist compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
- Maak niet-fluorescerende minimale NSD-medium2. De afwezigheid van riboflavine wordt verwacht om achtergrond intracellulaire groene fluorescentie en bijbehorende fototoxiciteit te verminderen.
- Kweek de gist stam 's nachts bij ~ 23 °c tot logaritmische fase in 5 ml nsd in een verbijsterd kolf van 50 ml met goede beluchting. Over 3-4 h vóór de analyse, Verdun de gistcultuur in verse NSD zodat de uiteindelijke OD600 0,5-0,8 zal zijn op het moment van beeldvorming.
- Bereid een 2 mg/mL oplossing van concanavalin A (ConA). Indien gewenst, Vries aliquots van deze oplossing in vloeibare stikstof en bewaren bij-80 °C.
- Draai de ConA-oplossing gedurende 5 minuten op volle snelheid in een micro centrifuge om fijnstof te verwijderen die de beeldvorming kan verstoren. Voeg vervolgens 250 μL van de supernatant toe aan een schone 35 mm dekglas bodem microscopie schotel. Spoel na 15 minuten 2-3 keer met 2 mL dH2O en laat drogen.
- Voeg 250 μL gistcultuur toe aan de ConA-gecoate schaal, wacht 10 min zodat de cellen zich kunnen hechten en spoel 2-3 keer voorzichtig met 2 mL NSD. Bedek de cellen met 2 mL verse NSD.
2. Imaging
- Gebruik een 63x of 100x olie Dompel lens. Een numeriek diafragma (NA) van 1,40 is voldoende, maar een hogere NA lens kan ook worden gebruikt.
- Format teren van de framegrootte tot 256 x 128 (breedte x hoogte). Als een grotere framegrootte nodig is, zal het vergroten van de breedte de scansnelheid niet verminderen, zolang de confocale Microscoop is uitgerust met een resonante scanner.
- Pas de zoomfactor aan om de pixelgrootte ~ 80 nm te maken.
- Gebruik de maximale scansnelheid, die meestal op de volgorde van 8 kHz. Schakel bidirectionele X-scans in als deze beschikbaar is, en als controle experimenten bevestigen dat de scans van de twee richtingen zich in het register bevinden.
- Stel de accumulatie van de lijn in op 4 of 6. Zorg ervoor dat u accumulatie (optellen) gebruikt in plaats van gemiddelden.
- Stel de pinhole in op 1,2 luchtige units. Empirisch, bij het beeldvormende levende gistcellen, vangt deze instelling meer fotonen dan de standaard keuze van 1,0 luchtige eenheid, terwijl het geen merkbaar verlies van resolutie veroorzaakt.
- Stel voor elk fluorescentie kanaal de excitatie golflengte in, wijs een detector met hoge gevoeligheid toe, stel het Emissiegolflengte bereik in en schakel foton tellings modus in indien beschikbaar. De golflengte keuzes zijn afhankelijk van de fluoroforen. Als voorbeeld, Excite GFP fluorescentie bij 485 nm en verzamelen van 495-550 nm, en Excite mScarlet fluorescentie bij 555 nm en verzamelen van 562-625 nm.
- Stel de intensiteit van elke laser zo laag mogelijk in. Deze instelling moet empirisch worden bepaald. Een passende intensiteit zal resulteren in het vastleggen van een lawaaierige maar interpreteerbare beeld sequentie, waarbij het fluorescentie signaal niet meer dan 50% aan het einde van een film van 5 minuten bleken. Op de confocale Microscoop hier gebruikt (Zie tabel van de materialen), deze intensiteit correspondeert met een laser vermogen instelling op de orde van 5%.
- Gebruik notch filters of time gating om te voorkomen dat het gereflecteerde licht van de dekslip wordt vastgelegd. Als time gating beschikbaar is, stelt u het gating-venster in op 0,6-10,0 NS.
- Schakel brightfield imaging in en gebruik een detector met lage gevoeligheid voor het verzamelen van gegevens. Stel de versterking in op een niveau dat de cellen duidelijk zichtbaar maakt. Gebruik geen differentieel interferentie contrast (DIC) omdat het prisma de inname van betrouwbare fluorescentie gegevens zal verstoren.
- Stel het Z-stap interval in op 0,25-0,35 μm. beeld het volledige volume van de gistcellen door het verzamelen van ongeveer 20-25 optische secties per Z-stack. Specificeer de directionaliteit van Imaging zodanig dat "down" naar de dekslip beweegt.
- Voor een typische film stelt u het tijdsinterval tussen Z-stacks in op 2 s en stelt u de duur van de film in op 5 tot 10 min. afhankelijk van het compartiment onder studie, Verminder het interval om kortere films van relatief snelle dynamiek te maken, of verhoog het interval om langere films te maken van relatief trage dynamiek.
- Sla de film op als een LIF-bestand met de brightfield-afbeeldingen in het laatste kanaal. Hogere bitdiepten zijn in dit stadium overbodig en de verwerkingspijplijn is geconfigureerd voor het accepteren van 8-bits TIFF-gegevens.
3. deconvolutie
- Start de deconvolutie software (Zie tabel met materialen), met behulp van de klassieke maximale waarschijnlijkheid schatting algoritme.
- Open de gegevensset die is gegenereerd in stap 2,13. Selecteer "Deconvolution wizard". Inspecteer de waarden die worden weergegeven in de "parameter wizard". De beeldvormings parameters moeten worden gedetecteerd en correct worden weergegeven. Wijzig onder ' refractieve indexen ' de waarde ' insluiten med. ' naar 1,40 om het gist cytoplasma te benaderen. Selecteer onder "Afdek" de optie "Start editor" en "geschatte positie" en "OK" om de dekslip positie in te stellen. Selecteer "set all Verified" en "Accept".
- Doorloop de "Deconvolution wizard" voor elk fluorescentie kanaal. Selecteer "Manual" als de modus voor achtergrond schatting. Inspecteer het profiel van de onbewerkte gegevens fluorescentie intensiteit om een geschatte achtergrondwaarde te bepalen, meestal ongeveer 0,1.
- Voer in het menu deconvolutie Setup de waarde "maximum iterations" van 40 in en schakel bleekmiddel correctie uit. Voer een geschatte SNR-waarde in, meestal ongeveer 5,0. Klik op "Deconvolve".
- Keer zo nodig terug naar het oorspronkelijke gegevensbestand, pas de achtergrond-en SNR-waarden aan en herhaal de deconvolutie totdat ruis voldoende is verwijderd zonder echte fluorescentie van Dim structuren te elimineren.
- Voeg de brightfield-en deconvolved fluorescentie kanalen samen. Voor volgende filmbewerkingsstappen in ImageJ, rangschikt u de kanalen zodanig dat rood eerst is, groen (indien aanwezig) de volgende is, blauw (indien aanwezig) de volgende is en brightfield is de laatste. Sla de Afbeeldingsvolgorde op als een 8-bits TIFF-bestand.
4. bleken correctie en film generatie
- Importeer de deconvolved-Afbeeldingsvolgorde in ImageJ en converteer deze naar een Hyper stack door afbeelding > Hyper Stacks > stack te kiezen in Hyper stack. Selecteer "xyzct" in het dropdown-menu en vul het aantal kanalen, Z-stack segmenten en tijdframes in (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
- Kies Afbeelding > Kleur > gesplitste kanalen.
- Corrigeer de fluorescentie kanalen voor photobleaching met behulp van de ImageJ-plugin die beschikbaar is op http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Zodra die plugin is gedownload en geïnstalleerd, kies plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Selecteer ' exponentiële pasvorm '.
- Als u de fluorescentie kanalen van brightfield en Bleach wilt samenvoegen in een Hyper stack, kiest u Afbeelding > Kleur > kanalen samenvoegen. Sla de resulterende Hyper stack op als een 8-bits TIFF-bestand.
- Installeer de aangepaste ImageJ-plug-ins die bij dit protocol worden meegeleverd. Volg de instructies in het begeleidende document om de Afbeeldingsvolgorde te bekijken, te bewerken en te kwantificeren, en om een uiteindelijke film van de geprojecteerde Z-stacks te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het voorbeeld hier documenten gegeven en kwantificeert de rijping van twee gist Golgi cisternae als gevisualiseerd door Dual-Color 4D confocale microscopie3. Een gist cel bevat op de orde van 10-15 Golgi cisternae, elk van die rijpt over een tijdsverloop van ongeveer 2-4 min. rijping kan worden gevisualiseerd door het taggen van de vroege Golgi marker Vrg4 met GFP en door het taggen van de late Golgi marker Sec7 met een rode fluorescerende eiwitten zoals mCherry of mScarlet. Een individuele Cisterna-etiketten in eerste instantie met de Vrg4 marker, ondergaat vervolgens een korte overgang waarin de markers worden uitgewisseld, en vervolgens labels met de Sec7 marker.
Omdat de cel meerdere Golgi cisternae bevat die vrij mobiel zijn, is het uitdagend om een individuele Cisterna te volgen gedurende de hele etiketterings periode. Cisternae zijn vaak te dicht bij elkaar om ondubbelzinnig te worden opgelost, gezien de temporele en ruimtelijke beperkingen van de beeldgegevens. Bovendien smelt Golgi cisternae af en toe14, en laat Golgi cisternae hebben de neiging om te clusteren op sites van gepolariseerde groei15. Als gevolg hiervan levert een 4D-film zelden meer dan één of twee cisternae die betrouwbaar kunnen worden bijgehouden. Een van de meest uitdagende stappen in de methode is om de eerste film van de Z-stack projecties te onderzoeken en cisternae te identificeren die veelbelovende kandidaten zijn voor analyse.
De cijfers verbeelden sequentiële stappen in de procedure:
Figuur 1 toont frames uit films van de Z-stack projecties van onbewerkte gegevens of deconvolved en Bleach-gecorrigeerde gegevens. Figuur 1 A vergelijkt de eerste frames voor de onbewerkte versus deconvolved gegevens. Figuur 1 B is uit dezelfde deconvolved film, en toont verschillende frames waarin de twee cisternae die zijn geanalyseerd label eerst met de groene Vrg4 marker en later met de rode Sec7 marker. Die cisternae werden gekozen omdat ze duidelijk gescheiden zijn van andere gelabelde structuren voor het grootste deel van de film. De beelden in deze figuur werden gegenereerd uit RAW of deconvolved en Bleach-gecorrigeerde 4D TIFF hyperstacks met behulp van de "Maak montage serie", "montage serie naar Hyperstack", en "project Hyperstack" plugins.
Afbeelding 2 toont een deel van de montage die is gemaakt voor een Z-stack op een van de tijdpunten, zowel voor als na het bewerken om het signaal te isoleren van een van de gekozen cisternae. De beelden in deze figuur werden gegenereerd uit de deconvolved en Bleach-gecorrigeerde 4D TIFF Hyper stack met behulp van de "Maak montage serie" en "Edit serie" plugins.
Figuur 3 toont verschillende frames uit de uiteindelijke film van de geprojecteerde Z-Stacks (video 1), met de originele projecties bovenaan en de bewerkte projecties onderaan. De afbeeldingen in deze afbeelding zijn gegenereerd op basis van de originele en bewerkte montages met behulp van de "montage serie naar Hyper stack", "merge Hyperstacks" en "project Hyperstacks" plugins.
Figuur 4 toont de kwantificering van de groene en rode fluorescentie signalen van de gekozen cisternae. De gegevens voor deze afbeelding zijn gegenereerd op basis van de bewerkte Hyper stacks met behulp van de plug-in "analyze bewerkte Movie".
Analyse van deze Golgi cisternae bleek dat de Vrg4 marker aankomt en aanhoudt voor ongeveer 80 s, en dan de Sec7 marker arriveert en aanhoudt voor ongeveer 60 s, met een korte periode van overlapping tussen de twee markers. Zoals geïllustreerd in dit voorbeeld, biedt 4D Imaging zowel kwalitatieve als kwantitatieve informatie over de dynamiek van een gist compartiment.
Figuur 1 : Projecties van Z-stacks uit een 4D-film. (A) projecties van de onbewerkte gegevens (links) en deconvolved gegevens (rechts) van de eerste Z-stack in een 4D-film. Het groene signaal is van GFP-Vrg4, het rode signaal is van Sec7-mScarlet, en het grijze signaal is de brightfield-beelden van de gistcellen. Schaalbalk = 2 μm.B) representatieve kaders uit de eerste film die in (a) van de deconvolved en geprojecteerde Z-stapels worden weergegeven. Tijdpunten worden aangegeven. De pijlen markeren de twee cisternae die voor analyse werden gekozen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Een deel van de montage uit de Z-stack overeenkomend met het tijdpunt 01:20. Elke afbeelding in de montage is een optisch gedeelte. Het bovenste paneel toont een deel van de originele montage, en het onderste paneel toont het corresponderende deel van de bewerkte montage waarin de fluorescentie signalen van de gekozen Cisterna selectief werden behouden. In elk paneel worden de optische secties van links naar rechts in de eerste rij geordend en vervolgens van links naar rechts in de tweede rij. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Frames uit de uiteindelijke film van de geprojecteerde Zstacks. In deze fragmenten uit video 1 worden de originele afbeeldingen boven de bewerkte afbeeldingen weergegeven. De eerste vijf frames tonen een Cisterna dat een groen-naar-rode overgang ondergaat, en de volgende vijf frames tonen een tweede Cisterna die een soortgelijke overgang ondergaat. Pijlen die op de originele afbeeldingen zijn gelegd, geven de cisternae aan die werden bijgehouden. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Kwantificering van de fluorescentie signalen van video 1. De grafieken vertegenwoordigen de GFP-Vrg4 en Sec7-mScarlet signalen van de twee cisternae gekozen voor analyse, waarbij het bovenste paneel vertegenwoordigt de Cisterna die zichtbaar wordt aan het begin van de film en het onderste paneel vertegenwoordigt de Cisterna die zichtbaar wordt later in de film. Tijd nul wordt voor elke Cisterna gedefinieerd als het frame net voordat GFP-Vrg4 fluorescentie voor het eerst werd gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: laatste film van de geprojecteerde Z-stacks. Het bovenste paneel toont de originele projecties, en het onderste paneel toont de bewerkte projecties waarin alleen de twee cisternae gekozen voor analyse zichtbaar zijn. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4D confocale beeldvorming van gist organellen vereist zorgvuldige afstemming van meerdere parameters. De belangrijkste zorg is fotobleaching en fototoxiciteit. Een typische 4D-film omvat het verzamelen van duizenden optische secties, zodat de laser verlichting zo laag mogelijk moet worden gehouden. Tandem fluorescerende eiwit Tags kunnen worden gebruikt om het signaal te stimuleren zonder de expressie van het gelabelde eiwit16,17te verhogen. Het maximaliseren van de scansnelheid helpt bij het beperken van foto schade en maakt het ook mogelijk om Z-stacks met voldoende korte intervallen op te vangen. Voxel-maten die bij de Nyquist-limiet liggen in zowel XY als Z minimaliseren de belichting van licht, terwijl ze theoretisch de informatie herstellen die beschikbaar is via de optische instelling18. Uiteindelijk zal elke Voxel in een signaal-bevattende gebied van een optisch gedeelte meestal slechts 1-3 fotonen ontvangen. Deze hoeveelheid informatie is ver beneden wat normaalgesproken wordt aanbevolen voor optimale beeldvorming met een enkele Z-stack, of voor deconvolutie. Maar deconvolutie helpt nog steeds door het verzachten van de lawaaierige signalen, en dergelijke datasets kunnen worden geanalyseerd en gekwantificeerd.
Zelfs met een 4D dataset van hoge kwaliteit is het volgen van gelabelde organellen een complexe taak. Met de ImageJ-plugins die hier worden geleverd, kan een onderzoeker elke Z-stack op het computerscherm array en kan gemakkelijk heen en weer schakelen tussen de tijdpunten en tussen de originele en bewerkte gegevens. Deze tools kunnen de gelabelde structuren worden gevolgd door tijd en ruimte met redelijk vertrouwen. Echter, subjectieve oordeel speelt een noodzakelijk onderdeel, en bias moet worden vermeden waar mogelijk. Particle tracking software kan mogelijk helpen, maar is nog niet verfijnd genoeg voor de meeste van de verschijnselen die worden bestudeerd. Om deze beperking te compenseren, is het het beste om meerdere markeringen te onderzoeken en voorspellingen van de modellen op verschillende manieren te testen3,6,7.
4D confocale beeldvorming heeft een cruciale rol gespeeld bij het karakteriseren van de gist secretoire en endocytische trajecten. Deze methode toonde aan dat er exit sites vormen de Novo en aanhouden voor onbepaalde tijd1, bevestigd dat Golgi cisternae volwassen3,5, en verduidelijkte de rol van de Copi blaasje vacht in Golgi rijping7, 19. Meer recentelijk, 4D Imaging verstrekt bewijs dat de gist vroege endosome is identiek aan de late Golgi, en dat de gist laat endosome is een langlevende compartiment6. Hoewel statische beeldvorming van fluorescently gelabelde compartimenten waardevol blijft, biedt 4D Imaging unieke inzichten in de werkingsprincipes van gist organellen.
Een spannende recente ontwikkeling in de beschikbaarheid van Self-labeling eiwitten voor fluorescerende tagging20. SNAP-tag gedraagt zich slecht als een fusie partner in gist, maar HaloTag gedraagt zich goed. Helder en fotostabiel membraan-perbetekende HaloTag substraten21 hebben het mogelijk gemaakt om 4D confocale beeldvorming met verre rode kleurstoffen6uit te voeren. Toevoeging van een ver-rood beeld kanaal aan de eerder gebruikte groene en rode beeldvormings kanalen maakt robuuste driekleurige 4D microscopie23mogelijk, waardoor het bereik van verschijnselen die kunnen worden bestudeerd in gist door Live-celbeeldvorming, wordt uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM104010. Bedankt voor de hulp met fluorescentiemicroscopie aan Vytas Bindokas en Christine labno op de geïntegreerde microscopie kern faciliteit, die wordt ondersteund door de door NIH gefinancierde Cancer Center ondersteuning Grant P30 CA014599.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).
