Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu charakterisieren, wie Membranfächer sich in lebenden Zellen angehender Hefe bilden und transformieren. Viele intrazelluläre Kompartimente in Hefe sind dynamisch, und ein vollständiges Verständnis ihrer Eigenschaften erfordert Zeitraffer-Bildgebung. Die mehrfarbige 4D-Konfokalfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Verhaltens und der Zusammensetzung eines intrazellulären Fachs auf einer Zeitskala von 5-15 min. Eine strenge Analyse der Fachdynamik erfordert die Erfassung von Tausenden von optischen Bereichen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Photobleaching und Phototoxizität durch schnelles Scannen bei sehr geringer Laserleistung minimiert, und die Pixelabmessungen und Z-Schritt-Intervalle werden auf die größten Werte eingestellt, die mit der Probenahme des Bildes in voller Auflösung kompatibel sind. Die resultierenden 4D-Datensätze sind laut, können aber durch Dekonvolution geglättet werden. Selbst bei qualitativ hochwertigen Daten ist die Analysephase eine Herausforderung, da intrazelluläre Strukturen oft zahlreich, heterogen und mobil sind. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, wurden benutzerdefinierte ImageJ-Plugins in Array-4D-Daten auf einem Computerbildschirm geschrieben, Strukturen von Interesse identifiziert, die Daten bearbeitet, um einzelne Strukturen zu isolieren, die Fluoreszenzzeitkurse zu quantifizieren und Filme der projizierten Z-Stacks zu machen. 4D-Filme sind besonders nützlich, um stabile Kompartimente von transienten Fächern zu unterscheiden, die sich durch Reifung umdrehen. Solche Filme können auch verwendet werden, um Ereignisse wie Die Kompartimentfusion zu charakterisieren und die Auswirkungen bestimmter Mutationen oder anderer Störungen zu testen.
Introduction
Die Fächer des Endomembransystems befinden sich im ständigen Fluss, und ihre vollständige Charakterisierung erfordert eine Live-Zell-Bildgebung. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die konfokale 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D) verwendet, um fluoreszierend beschriftete Fächer in angehenden Hefen zu visualisieren. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Sekretoreifächer in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae1,2,3zu verfolgen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf S. cerevisiae, das einen nicht gestapelten Golgi hat, in dem die einzelnen Zisternen optisch auflösbar sind4. Die ungewöhnliche Golgi-Organisation in S. cerevisiae ermöglichte die Demonstration durch 4D-Mikroskopie, dass eine Golgi-Zisterne zunächst mit ansässigen frühen Golgi-Proteinen etikettiert und dann diese Proteine verliert, während sie ansässige späte Golgi-Proteine erwirbt3 ,5. Dieser Übergang kann durch die Schaffung eines Stammes visualisiert werden, bei dem das frühe Golgi-Protein Vrg4 mit GFP beschriftet wird, während das späte Golgi-Protein Sec7 mit einem monomeren roten fluoreszierenden Protein gekennzeichnet ist. Wenn einzelne Zisternen verfolgt werden, wird die Reifung als Grün-Rot-Umwandlung3beobachtet. Diese Art der Analyse kann wertvolle Informationen über die Proteinlokalisierung und die Identität des Kompartiments liefern. Beispielsweise können zwei Proteine mit leicht versetzten Ankunfts- und Abfahrtszeiten manchmal verschiedene Fächer in statischen Bildern zu kennzeichnen scheinen, können aber in 4D-Filmen gesehen werden, um dasselbe Fach zu verschiedenen Zeitpunkten zu beschriften6,7 . So zeigt die 4D-Mikroskopie Phänomene auf, die sonst nicht erkennbar wären.
Informative 4D-Mikroskopie von Hefefächern kann mit geeigneten Verfahren und Ausrüstung2erreicht werden. Wann immer möglich, wird fluoreszierende Protein-Tagging durch Genersatz8 durchgeführt, um Überexpressionsartefakte zu vermeiden. Da intrazelluläre Strukturen oft sehr dynamisch sind, ist eine 4D-Bildgebung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine Struktur im Laufe der Zeit zuverlässig nachverfolgt wird. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein laserscannendes Konfokalmikroskop, das mit hochempfindlichen Detektoren ausgestattet ist. Mit diesem Gerät kann das gesamte Zellvolumen von S. cerevisiae durch konfokale Mikroskopie etwa alle 1-3 s abgebildet werden, wobei 2 s Intervalle typisch sind. Die Daten können je nach Beschriftungsdichten der Fluorophore und ihren photophysikalischen Eigenschaften bis zu 5-15 min gesammelt werden. Die Haupthürde ist die Minimierung der Photobleichung. Zu diesem Zweck werden die Laserintensitäten so gering wie möglich gehalten, die konfokale Scangeschwindigkeit maximiert und die optischen Parameter so konfiguriert, dass sie am Nyquist-Grenzwert abbilden, um die relevanten Informationen zu erfassen und gleichzeitig eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. Diese Einstellungen sollen auch die Phototoxizität lindern, ein Faktor, der bei der Live-Zell-Bildgebung oft übersehen wird9,10,11. Die resultierenden lauten Daten werden mit Bleichkorrektur- und Dekonvolutionalgorithmen verarbeitet, um die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten zu erleichtern.
Selbst bei hochwertigen 4D-Filmen ist die Analyse schwierig, da Hefefächer in der Regel zahlreich, heterogen und mobil sind. Aufgrund der intrinsischen Einschränkungen der konfokalen Mikroskopie und der nicht optimalen Einstellungen, die für eine längere 4D-Bildgebung erforderlich sind, sind fluoreszierende Strukturen, die nahe beieinander liegen, schwer zu lösen. Dieses Problem kann umgangen werden, indem man sich auf die geringe Anzahl von fluoreszierenden Strukturen konzentriert, die für die Dauer des Etikettierungszeitraums optisch lösbar bleiben, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Strukturen repräsentativ für die gesamte Population der markierten Fächer. Fluoreszierende Fächer, die zuverlässig nachverfolgt werden können, werden identifiziert, indem Filme von projizierten Z-Stacks angesehen und eine Reihe von Montagen erstellt werden, in denen die optischen Abschnitte für jeden Zeitpunkt auf einem Computerbildschirm angeordnet sind. Diese Analyse verwendet benutzerdefinierte ImageJ12 Plugins, die es ermöglichen, eine individuelle Struktur isoliert nachzuverfolgen.
Jüngste Methoden Papiere behandelt die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen in Hefe13 sowie die Theorie und Praxis der 4D konfokale Bildgebung von Hefezellen2. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die wichtigsten praktischen Aspekte eines 4D-Bildgebungsexperiments. Es enthält einige Verbesserungen an zuvor beschriebenen Verfahren sowie aktualisierte Versionen des ImageJ-Plugin-Codes und der Dokumentation. Das gezeigte Beispiel konzentriert sich auf die Golgi-Dynamik, aber dieses Protokoll eignet sich gleichermaßen für die Abbildung anderer Hefekomden.
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Protocol
1. Vorbereitung
- Machen Sie nicht fluoreszierendes minimales NSD-Medium2. Das Fehlen von Riboflavin wird voraussichtlich die intrazelluläre fluoreszenz und die damit verbundene Phototoxizität im Hintergrund verringern.
- Wachsen Sie den Hefestamm über Nacht bei 23 °C bis zur logarithmischen Phase in 5 ml NSD in einem 50 ml verwirrten Kolben mit guter Belüftung. Etwa 3-4 h vor der Analyse, verdünnen Sie die Hefekultur in frischem NSD, so dass die endgültige OD600 zum Zeitpunkt der Bildgebung 0,5-0,8 betragen wird.
- Bereiten Sie eine 2 mg/ml Lösung von Concanavalin A (ConA) vor. Auf Wunsch Aliquots dieser Lösung in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
- Drehen Sie die ConA-Lösung für 5 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, um Partikel zu entfernen, die die Bildgebung stören können. Dann fügen Sie 250 l des Überstandes zu einer sauberen 35 mm Deckglasbodenmikroskopieschale hinzu. Nach 15 min 2-3 mal mit 2 ml dH2O waschen und trocknen lassen.
- Fügen Sie der ConA-beschichteten Schale 250 l der Hefekultur hinzu, warten Sie 10 min, bis die Zellen haften bleiben, und waschen Sie 2-3 Mal mit 2 ml NSD. Bedecken Sie die Zellen mit 2 ml frischem NSD.
2. Imaging
- Verwenden Sie eine 63x- oder 100x Öl-Tauchlinse. Eine numerische Blende (NA) von 1,40 ist ausreichend, aber es kann auch ein höheres NA-Objektiv verwendet werden.
- Formatieren Sie die Rahmengröße auf 256 x 128 (Breite x Höhe). Wenn eine größere Rahmengröße benötigt wird, wird die Scangeschwindigkeit durch die Erhöhung der Breite nicht verringert, solange das konfokale Mikroskop mit einem Resonanzscanner ausgestattet ist.
- Passen Sie den Zoomfaktor so an, dass die Pixelgröße 80 nm beträgt.
- Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, die in der Regel in der Größenordnung von 8 kHz liegt. Aktivieren Sie das bidirektionale X-Scannen, wenn es verfügbar ist und Kontrollexperimente bestätigen, dass die Scans aus den beiden Richtungen registriert sind.
- Legen Sie die Zeilenakkumulation auf 4 oder 6 fest. Achten Sie darauf, Akkumulation (Summierung) anstelle der Mittelung zu verwenden.
- Stellen Sie das Loch auf 1.2 Airy-Einheiten ein. Empirisch erfasst diese Einstellung bei der Abbildung lebender Hefezellen mehr Photonen als die Standardauswahl von 1.0 Airy-Einheiten, während sie keinen nennenswerten Auflösungsverlust verursacht.
- Legen Sie für jeden Fluoreszenzkanal die Anregungswellenlänge fest, weisen Sie einen Hochempfindlichkeitsdetektor zu, stellen Sie den Emissionswellenlängenbereich ein, und aktivieren Sie den Photonenzählmodus, falls verfügbar. Die Wellenlängenauswahl hängt von den Fluorophoren ab. Als Beispiel, erregen SIE die GFP-Fluoreszenz bei 485 nm und sammeln sie von 495-550 nm, und erregen Sie die mScarlet-Fluoreszenz bei 555 nm und sammeln Sie von 562-625 nm.
- Legen Sie die Intensität jedes Lasers so niedrig wie möglich fest. Diese Einstellung muss empirisch bestimmt werden. Eine angemessene Intensität führt zur Erfassung einer lauten, aber interpretierbaren Bildsequenz, wobei das Fluoreszenzsignal bis zum Ende eines 5-min-Films nicht mehr als 50% bleicht. Auf dem hier verwendeten konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) entspricht diese Intensität einer Laserleistungseinstellung in der Größenordnung von 5%.
- Verwenden Sie Kerbfilter oder Zeitverzahnung, um zu vermeiden, dass reflektiertes Licht vom Deckschein erfasst wird. Wenn Zeit-Gating verfügbar ist, legen Sie das Gating-Fenster auf 0,6-10,0 ns fest.
- Schalten Sie die Lichtfeld-Bildgebung ein und verwenden Sie einen Detektor mit geringer Empfindlichkeit für die Datenerfassung. Legen Sie die Verstärkung auf eine Ebene fest, die die Zellen deutlich sichtbar macht. Verwenden Sie keinen Differential Interferenzkontrast (DIC), da das Prisma die Erfassung zuverlässiger Fluoreszenzdaten beeinträchtigt.
- Stellen Sie das Z-Schritt-Intervall auf 0,25-0,35 m ein. Stellen Sie das gesamte Volumen der Hefezellen ab, indem Sie etwa 20-25 optische Abschnitte pro Z-Stack sammeln. Geben Sie die Richtung der Bildgebung so an, dass sich "nach unten" in Richtung des Deckslips bewegt.
- Legen Sie für einen typischen Film das Zeitintervall zwischen Z-Stacks auf 2 s fest und stellen Sie die Filmdauer auf 5 bis 10 min. Je nach untersuchtem Fach reduzieren Sie das Intervall, um kürzere Filme mit relativ schneller Dynamik zu machen, oder erhöhen Sie das Intervall, um längere Filme von relativ langsame Dynamik.
- Speichern Sie den Film als LIF-Datei mit den Hellfeldbildern im letzten Kanal. Höhere Bittiefen sind in dieser Phase nicht erforderlich, und die Verarbeitungspipeline ist so konfiguriert, dass 8-Bit-TIFF-Daten akzeptiert werden.
3. Dekonvolution
- Starten Sie die Dekonvolution-Software (siehe Tabelle der Materialien), mit dem klassischen Maximum Likelihood Estimation-Algorithmus.
- Öffnen Sie den in Schritt 2.13 generierten Datensatz. Wählen Sie "Dekonvolution-Assistent". Überprüfen Sie die im "Parameter-Assistenten" angezeigten Werte. Die Bildparameter sollten erkannt und korrekt angezeigt werden. Ändern Sie unter "Refraktive Indizes" den Wert "Embedding med." auf 1,40, um das Hefezytoplasma anzunähern. Wählen Sie unter "coverslip" "Launch editor" und "Estimate position" und "OK", um die Coverslip-Position festzulegen. Wählen Sie "Alle verifiziert enstatten" und "Akzeptieren".
- Fahren Sie durch den "Dekonvolution-Assistenten" für jeden Fluoreszenzkanal. Wählen Sie "Manuell" als Modus für die Hintergrundschätzung. Überprüfen Sie das Rohdatenfluoreszenzintensitätsprofil, um einen geschätzten Hintergrundwert zu ermitteln, der in der Regel etwa 0,1 beträgt.
- Geben Sie im Menü für die Dekonvolution-Einrichtung den Wert "Maximale Iterationen" von 40 ein und deaktivieren Sie die Bleichkorrektur. Geben Sie einen geschätzten SNR-Wert ein, der in der Regel etwa 5,0 beträgt. Klicken Sie auf "Deconvolve".
- Kehren Sie ggf. zur ursprünglichen Datendatei zurück, passen Sie die Hintergrund- und SNR-Werte an, und wiederholen Sie die Dekonvolution, bis das Rauschen ausreichend entfernt wird, ohne die tatsächliche Fluoreszenz von dämmernden Strukturen zu beseitigen.
- Verschmelzen Sie die hellen Undfeld- und Dekonvolid-Fluoreszenzkanäle. Ordnen Sie für nachfolgende Filmbearbeitungsschritte in ImageJ die Kanäle so an, dass Rot zuerst, Grün (falls vorhanden) als nächstes, blau (falls vorhanden) als nächstes und hellfeld als letztes ist. Speichern Sie die Bildsequenz als 8-Bit-TIFF-Datei.
4. Bleichkorrektur und Filmgenerierung
- Importieren Sie die dekonvolvede Bildsequenz in ImageJ, und konvertieren Sie sie in einen Hyperstack, indem Sie Bild > Hyperstacks > Stapeln in Hyperstack auswählen. Wählen Sie "xyzct" aus dem Dropdown-Menü, und füllen Sie die Anzahl der Kanäle, Z-Stack-Slices und Zeitrahmen (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
- Wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle teilen.
- Korrigieren Sie die Fluoreszenzkanäle für photobleaching mit dem ImageJ-Plugin, das von http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector verfügbar ist. Sobald dieses Plugin heruntergeladen und installiert wurde, wählen Sie Plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Wählen Sie "Exponential Fit".
- Um die hellfeld- und bleichkorrigierten Fluoreszenzkanäle zu einem Hyperstack zusammenzuführen, wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen. Speichern Sie den resultierenden Hyperstack als 8-Bit-TIFF-Datei.
- Installieren Sie die benutzerdefinierten ImageJ-Plugins, die mit diesem Protokoll bereitgestellt werden. Befolgen Sie die Anweisungen im Begleitdokument, um die Bildsequenz anzuzeigen, zu bearbeiten und zu quantifizieren und einen fertigen Film der projizierten Z-Stacks zu erstellen.
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Representative Results
Das hier gegebene Beispiel dokumentiert und quantifiziert die Reifung von zwei Hefe Golgi Zisternen, wie durch zweifarbige 4D konfokale Mikroskopie3visualisiert. Eine Hefezelle enthält in der Größenordnung von 10-15 Golgi-Zisternen, von denen jede über einen Zeitverlauf von ca. 2-4 min reift. Die Reifung kann durch Taggen des frühen Golgi-Markers Vrg4 mit GFP und durch Taggen des späten Golgi-Markers Sec7 mit einem roten Fluoreszenz-Marker sec7 visualisiert werden. Protein wie mCherry oder mScarlet. Eine einzelne Zisterne beschriftet zunächst mit dem Vrg4-Marker, dann einen kurzen Übergang, bei dem die Marker ausgetauscht werden, und dann Beschriftungen mit dem Sec7-Marker.
Da die Zelle mehrere Golgi-Zisternen enthält, die ziemlich mobil sind, ist es eine Herausforderung, einer einzelnen Zisterne während der gesamten Etikettierungsperiode zu folgen. Zisternen sind oft zu nah beieinander, um eindeutig gelöst zu werden, da die zeitlichen und räumlichen Grenzen der Bilddaten eindeutig gelöst werden. Darüber hinaus verschmelzen Golgi-Zisternen gelegentlich14, und späte Golgi-Zisternen neigen dazu, sich an Standorten mit polarisiertem Wachstum zu gruppieren15. Dadurch liefert ein 4D-Film selten mehr als eine oder zwei Zisternen, die zuverlässig nachverfolgt werden können. Einer der schwierigsten Schritte der Methode ist es, den ersten Film der Z-Stack-Projektionen zu untersuchen und Zisternen zu identifizieren, die vielversprechende Kandidaten für die Analyse sind.
Die Abbildungen zeigen sequenzielle Schritte im Verfahren:
Abbildung 1 zeigt Frames aus Filmen der Z-Stack-Projektionen von Rohdaten oder dekonvolveden und bleichkorrigierten Daten. Abbildung 1 A vergleicht die ersten Frames für die rohen und dekonvolveden Daten. Abbildung 1 B stammt aus demselben dekonvolved Film und zeigt mehrere Frames, in denen die beiden Zisternen, die analysiert wurden, zuerst mit dem grünen Vrg4-Marker und später mit dem roten Sec7-Marker beschriftet wurden. Diese Zisternen wurden ausgewählt, weil sie für den größten Teil des Films klar von anderen beschrifteten Strukturen getrennt sind. Die Bilder in dieser Abbildung wurden entweder aus rohen oder dekonvolved und bleichkorrigierten 4D-TIFF-Hyperstacks mit den Plugins "Make Montage Series", "Montage Series to Hyperstack" und "Project Hyperstack" generiert.
Abbildung 2 zeigt einen Teil der Montage, der für einen Z-Stack an einem der Zeitpunkte erstellt wurde, sowohl vor als auch nach der Bearbeitung, um das Signal von einer der ausgewählten Zisternen zu isolieren. Die Bilder in dieser Abbildung wurden aus dem dekonvolved und bleichkorrigierten 4D TIFF Hyperstack mit den Plugins "Make Montage Series" und "Edit Montage Series" generiert.
Abbildung 3 zeigt mehrere Bilder aus dem letzten Film der projizierten Z-Stacks (Video 1), mit den Originalprojektionen oben und den bearbeiteten Projektionen unten. Die Bilder in dieser Abbildung wurden aus den Original- und bearbeiteten Montagen mit den Plugins "Montage Series to Hyperstack", "Merge Hyperstacks" und "Project Hyperstacks" generiert.
Abbildung 4 zeigt die Quantifizierung der grünen und roten Fluoreszenzsignale der gewählten Cistern. Die Daten für diese Zahl wurden aus den bearbeiteten Hyperstacks mit dem Plugin "Analyze Edited Movie" generiert.
Die Analyse dieser Golgi-Zisternen ergab, dass der Vrg4-Marker etwa 80 s ankommt und anhält, und dann kommt der Sec7-Marker an und bleibt etwa 60 s, mit einer kurzen Überlappungsphase zwischen den beiden Markern. Wie in diesem Beispiel veranschaulicht, liefert die 4D-Bildgebung sowohl qualitative als auch quantitative Informationen über die Dynamik eines Hefefachs.
Abbildung 1 : Projektionen von Z-Stacks aus einem 4D-Film. (A) Projektionen der Rohdaten (links) und dekonvolved daten (rechts) aus dem ersten Z-Stack in einem 4D-Film. Das grüne Signal stammt von GFP-Vrg4, das rote Signal von Sec7-mScarlet und das graue Signal sind die Hellfeldbilder der Hefezellen. Skala bar = 2 m . (B) Repräsentative Rahmen aus dem ersten Film in (A) der dekonvolveden und projizierten Z-Stacks gezeigt. Zeitpunkte werden angegeben. Die Pfeile markieren die beiden Cisternae, die für die Analyse ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Ein Teil der Montage aus dem Z-Stack, der dem Zeitpunkt 01:20 entspricht. Jedes Bild in der Montage ist ein optischer Abschnitt. Das obere Panel zeigt einen Teil der Originalmontage und das untere Panel den entsprechenden Teil der bearbeiteten Montage, in dem die Fluoreszenzsignale der gewählten Zisterne selektiv beibehalten wurden. In jedem Panel werden die optischen Abschnitte von links nach rechts in der ersten Zeile und dann von links nach rechts in der zweiten Zeile angeordnet. Maßstabsleiste = 2 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Frames aus dem letzten Film der projizierten Zstacks. In diesen Auszügen aus Video 1 werden die Originalbilder über den bearbeiteten Bildern gezeigt. Die ersten fünf Bilder zeigen eine Zisterne, die einen grün-roten Übergang durchläuft, und die nächsten fünf Frames zeigen eine zweite Zisterne, die einen ähnlichen Übergang durchläuft. Pfeile, die auf den Originalbildern überlagert sind, zeigen die Zisternen, die verfolgt wurden. Maßstabsleiste = 2 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Quantifizierung der Fluoreszenzsignale aus Video 1. Die Graphen stellen die GFP-Vrg4- und Sec7-mScarlet-Signale der beiden für die Analyse ausgewählten Zisternen dar, wobei das obere Panel die Zisterne darstellt, die am Anfang des Films sichtbar wird, und die untere Platte die Zisterne darstellt, die sichtbar wird. später im Film. Die Zeit Null wird für jede Zisterne als Rahmen definiert, kurz bevor die GFP-Vrg4-Fluoreszenz zum ersten Mal nachgewiesen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Letzter Film der projizierten Z-Stacks. Das obere Panel zeigt die ursprünglichen Projektionen, und das untere Panel zeigt die bearbeiteten Projektionen, in denen nur die beiden Cisternae sichtbar sind, die für die Analyse ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Die konfokale 4D-Bildgebung von Hefeorganellen erfordert eine sorgfältige Abstimmung mehrerer Parameter. Das Hauptanliegen ist Photobleaching und Phototoxizität. Ein typischer 4D-Film beinhaltet das Sammeln von Tausenden von optischen Abschnitten, so dass die Laserbeleuchtung so gering wie möglich gehalten werden muss. Tandem fluoreszierende Protein-Tags können verwendet werden, um das Signal zu steigern, ohne die Expression des markierten Proteins16,17zu erhöhen. Die Maximierung der Scangeschwindigkeit hilft, Photoschäden zu begrenzen, und ermöglicht es auch, Z-Stacks in entsprechend kurzen Intervallen einzufangen. Voxel-Größen, die sowohl in XY als auch in Z am Nyquist-Grenzwert liegen, minimieren die Lichteinwirkung, während die Informationen, die aus dem optischen Setup18verfügbar sind, theoretisch wiederhergestellt werden. Am Ende erhält jeder Voxel in einem signalhaltigen Bereich eines optischen Abschnitts in der Regel nur 1-3 Photonen. Diese Menge an Informationen liegt weit unter dem, was normalerweise für eine optimale Bildgebung mit einem einzelnen Z-Stack oder für die Dekonvolution empfohlen wird. Aber die Dekonvolution hilft immer noch, indem die lauten Signale geglättet werden, und solche Datensätze können analysiert und quantifiziert werden.
Selbst bei einem hochwertigen 4D-Datensatz ist die Nachverfolgung von beschrifteten Organellen eine komplexe Aufgabe. Mit den hier bereitgestellten ImageJ-Plugins kann ein Forscher jeden Z-Stack auf dem Computerbildschirm anstellen und leicht zwischen Zeitpunkten und zwischen den ursprünglichen und bearbeiteten Daten hin und her bewegen. Diese Werkzeuge ermöglichen es, die beschrifteten Strukturen mit angemessenem Vertrauen durch Zeit und Raum zu verfolgen. Subjektives Urteilsvermögen spielt jedoch eine notwendige Rolle, und Voreingenommenheit muss nach Möglichkeit vermieden werden. Partikel-Tracking-Software könnte potenziell helfen, ist aber noch nicht ausgeklügelt genug für die meisten der Phänomene, die untersucht werden. Um diese Einschränkung auszugleichen, ist es am besten, mehrere Marker zu untersuchen und Vorhersagen der Modelle auf verschiedene Weise zu testen3,6,7.
4D konfokale Bildgebung hat eine zentrale Rolle bei der Charakterisierung der Hefe sekretonierenden und endozytischen Bahnen gespielt. Diese Methode zeigte, dass ER Ausgangsstellen bilden de novo und bestehen unbegrenzt1, bestätigt, dass Golgi Cisternae reifen3,5, und verdeutlichte die Rolle der COPI Vesikelschicht in Golgi Reifung7, 19. In jüngerer Zeit lieferte die 4D-Bildgebung Beweise dafür, dass das Hefe-Frühenddosom mit dem späten Golgi identisch ist und dass das Hefe-Spätenddosom ein langlebiges Fachist 6. Während die statische Bildgebung von fluoreszierend markierten Fächern weiterhin wertvoll ist, bietet die 4D-Bildgebung einzigartige Einblicke in die Funktionsprinzipien von Hefeorganellen.
Eine aufregende jüngste Entwicklung in der Verfügbarkeit von selbstkennzeichnenden Proteinen für fluoreszierende Tagging20. SNAP-tag verhält sich schlecht als Fusionspartner in Hefe, aber HaloTag verhält sich gut. Helle und fotoierbare, membrandurchlässige HaloTag-Substrate21 haben es ermöglicht, 4D-Konfokalbildgebung mit weitroten Farbstoffendurchzuführen 6. Die Zugabe eines weitroten Bildkanals zu den bisher verwendeten grünen und roten Bildkanälen ermöglicht eine robuste dreifarbige 4D-Mikroskopie23und erweitert so die Bandbreite der Phänomene, die in Hefe durch Live-Zell-Bildgebung untersucht werden können.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01 GM104010 unterstützt. Vielen Dank für die Unterstützung bei der Fluoreszenzmikroskopie an Vytas Bindokas und Christine Labno in der Integrated Microscopy Core Facility, die vom NIH-finanzierten Cancer Center Support Grant P30 CA014599 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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