Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

4D mikroskopi av gjær

Published: April 28, 2019 doi: 10.3791/58618
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Denne protokollen beskriver analyse av fluorescensmerkete merket intracellulære rom i spirende gjær ved hjelp av multi-farge 4D (time-lapse 3D) konfokalmikroskopi mikroskopi. Bilde parametrene er valgt for å fange opp tilstrekkelige signaler samtidig som de begrenser photoskade. Tilpasset ImageJ plugins tillate merket strukturer som skal spores og kvantitativt analysert.

Abstract

Målet med denne protokollen er å karakterisere hvordan membran rom form og transformere i levende celler av spirende gjær. Mange intracellulære rom i gjær er dynamiske, og en full forståelse av deres egenskaper krever time-lapse Imaging. Multi-Color 4D konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi er en kraftfull metode for å spore atferden og sammensetningen av en intracellulære kupé på en tidsskala på 5-15 min. grundig analyse av kupé dynamikk krever fangst av tusenvis av optiske Deler. For å oppnå dette målet minimeres photobleaching og Phototoksisitet ved å skanne raskt ved svært lav laser effekt, og pikseldimensjonene og Z-trinns intervallene er satt til de største verdiene som er kompatible med prøvetaking av bildet i full oppløsning. Den resulterende 4D datasettene er bråkete, men kan glattet av deconvolution. Selv med data av høy kvalitet er analysefasen utfordrende fordi intracellulære strukturer ofte er mange, heterogene og mobile. For å møte dette behovet, tilpasset ImageJ plugins ble skrevet til array 4D data på en dataskjerm, identifisere strukturer av interesse, redigere data for å isolere enkelte strukturer, kvantifisere fluorescens tid kurs, og lage filmer av den projiserte Z-stabler. 4D-filmer er spesielt nyttige for å skille stabile rom fra forbigående rom som snur ved modning. Slike filmer kan også brukes til å karakterisere hendelser som kupé fusjon, og for å teste effekten av spesifikke mutasjoner eller andre forstyrrelser.

Introduction

Seksjoner av endomembrane systemet er i konstant forandring, og deres fulle karakterisering krever Live celle Imaging. Beskrevet her er en protokoll som sysselsetter 4D (time-lapse 3D) konfokalmikroskopi mikroskopi å visualisere fluorescensmerkete merket avdelinger i spirende gjær. Metoden ble utviklet for å spore dynamikken i sekretoriske rom i Pichia Pastoris og Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Denne protokollen fokuserer på S. cerevisiae, som har en arealdiagram Golgi der den enkelte cisternae er optisk kan løses4. Den uvanlige Golgi organisasjonen i S. cerevisiae aktivert demonstrasjonen av 4d mikroskopi at en Golgi Cisterna først etiketter med bosatt tidlig Golgi proteiner, og deretter mister disse proteinene mens anskaffe bosatt sent Golgi proteiner3 ,5. Denne overgangen kan bli visualisere ved å skape en belastning der tidlig Golgi protein Vrg4 er merket med GFP mens sent Golgi protein Sec7 er merket med en monomere rødt fluorescerende protein. Når individuelle cisternae spores, er modning observert som en grønn-til-rød konvertering3. Denne typen analyser kan gi verdifull informasjon om protein lokalisering og kupé identitet. For eksempel, to proteiner med litt offset ankomst og avgang kan noen ganger synes å merke forskjellige rom i statiske bilder, men kan sees i 4d filmer å merke det samme rommet på ulike tidspunkt poeng6,7 . Således, 4D mikroskopi avslører fenomener som ellers ikke ville være tydelig.

Informativ 4D mikroskopi av gjær rom kan oppnås med egnede prosedyrer og utstyr2. Når det er mulig, er fluorescerende protein merking utført av gen erstatning8 for å unngå overuttrykte gjenstander. Fordi intracellulære strukturer er ofte svært dynamiske, er 4D Imaging nødvendig for å sikre at en struktur spores pålitelig over tid. Protokollen som beskrives her benytter en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop utstyrt med høy følsomhet detektorer. Med denne enheten, kan hele celle volumet av S. cerevisiae bli avbildet av konfokalmikroskopi mikroskopi omtrent hver 1-3 S, med 2 S intervaller som er typisk. Data kan samles inn for opptil 5-15 min avhengig av merkings tettheten til fluorophores og deres photophysical egenskaper. Det viktigste hinderet er å minimere photobleaching. For dette formålet er laser intensiteten holdt så lavt som mulig, konfokalmikroskopi skannehastigheten er maksimert, og de optiske parametrene er konfigurert til bildet på Nyquist grensen for å fange opp relevant informasjon og samtidig unngå overdreven lys eksponering. Disse innstillingene er også forventet å lindre Phototoksisitet, en faktor som ofte blir oversett under Live Cell Imaging9,10,11. Den resulterende støyende data behandles med blekemiddel korreksjon og deconvolution algoritmer for å lette kvantifisering av fluorescens intensitet.

Selv med høy kvalitet 4D filmer, er analysen vanskelig fordi gjær avdelinger tendens til å være mange, heterogene og mobil. På grunn av den iboende begrensninger av konfokalmikroskopi mikroskopi og de ikke-optimale innstillingene som kreves for langvarig 4D Imaging, fluorescerende strukturer som er nær hverandre er vanskelig å løse. Dette problemet kan være omgås ved å fokusere på det lille antallet av fluorescerende strukturer som forblir optisk kan løses for varigheten av merkingen perioden, med den forutsetning at disse strukturene er representative for hele befolkningen i merket Rom. Fluorescerende rom som kan spores på en pålitelig måte, identifiseres ved å se på filmer med projiserte Z-stabler og ved å lage en serie montasjer der de optiske seksjonene for hvert tids punkt er plassert på en dataskjerm. Denne analysen sysselsetter egendefinerte ImageJ12 plugins, som gjør at en enkelt struktur som skal spores i isolasjon.

Nyere metoder papirer dekket bruken av fluorescerende proteiner i gjær13 , samt teori og praktisering av 4d konfokalmikroskopi Imaging av gjærceller2. Denne protokollen fokuserer på de viktigste praktiske aspektene ved en 4D Imaging eksperiment. Den inneholder noen forbedringer av tidligere beskrevne prosedyrer, samt oppdaterte versjoner av ImageJ plugin-kode og dokumentasjon. Eksempelet vist fokuserer på Golgi dynamikk, men denne protokollen er like egnet for Imaging andre gjær-avdelinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse

  1. Gjør nonfluorescent minimalt med NSD medium2. Fraværet av riboflavin ventes å redusere bakgrunnen intracellulære grønne fluorescens og tilhørende Phototoksisitet.
  2. Voks gjær belastningen over natten ved ~ 23 ° c til logaritmisk fase i 5 mL NSD i en 50 mL forbløffet kolbe med god lufting. Om 3-4 h før analyse, fortynne gjær kulturen i frisk NSD slik at den endelige OD600 vil være 0,5-0.8 på tidspunktet for Imaging.
  3. Forbered en 2 mg/mL oppløsning av concanavalin A (ConA). Hvis ønskelig, fryse alikvoter av denne løsningen i flytende nitrogen og lagre ved-80 ° c.
  4. Snurr ConA-løsningen i 5 minutter med full hastighet i en mikrosentrifugen for å fjerne partikler som kan forstyrre bildebehandling. Deretter legges 250 μL av supernatanten til en ren 35 mm dekkglass bunn mikroskopi parabolen. Etter 15 minutter, vask 2-3 ganger med 2 mL dH2O og la tørke.
  5. Tilsett 250 μL av gjær kulturen i ConA-belagt rett, vent 10 min for å la cellene følge, og vask forsiktig 2-3 ganger med 2 mL NSD. Dekk til cellene med 2 mL fersk NSD.

2. avbildning

  1. Bruk en 63x eller 100 a olje nedsenking linse. En numerisk blenderåpning (NA) på 1,40 er tilstrekkelig, men en høyere NA-linse kan også brukes.
  2. Formater rammestørrelsen til 256 x 128 (bredde x høyde). Hvis det er behov for en større rammestørrelse, vil det å øke bredden ikke redusere skannehastigheten så lenge det konfokalmikroskopi mikroskopet er utstyrt med en skanner som er resonans.
  3. Juster zoomfaktoren for å gjøre pikselstørrelsen ~ 80 NM.
  4. Bruk den maksimale skannehastigheten, som vanligvis er på rekkefølgen av 8 kHz. Slå på toveis X-skanning hvis den er tilgjengelig, og hvis kontroll eksperimenter bekrefter at skanningen fra de to retningene er i register.
  5. Angi linje akkumulering til 4 eller 6. Pass på å bruke akkumulering (summering) i stedet for snitt.
  6. Sett pinhole til 1,2 luftige enheter. Empirisk, når Imaging levende gjærceller, fanger denne innstillingen mer fotoner enn standard valg av 1,0 luftig enhet og forårsaker ingen merkbar tap av oppløsning.
  7. For hver fluorescens kanal, angi eksitasjon bølgelengde, tilordne en høy følsomhet detektor, angi utslipps bølgelengdeområdet, og slå på Foton telle modus hvis tilgjengelig. Bølgelengde valgene vil avhenge av fluorophores. Som et eksempel, opphisse GFP fluorescens på 485 NM og samle fra 495-550 NM, og opphisse mScarlet fluorescens på 555 NM og samle inn fra 562-625 NM.
  8. Sett intensiteten på hver laser for å være så lav som mulig. Denne innstillingen må bestemmes empirisk. En passende intensitet vil resultere i fangst av en bråkete, men interpretable bildesekvens, med fluorescens signal bleking ikke mer enn 50% ved slutten av en 5 min film. På konfokalmikroskopi mikroskop som brukes her (se tabell over materialer), tilsvarer denne intensiteten en laser effekt på rekkefølgen av 5%.
  9. Bruk hakk filtre eller tid gating for å unngå å fange reflektert lys fra dekkglass. Hvis tiden gating er tilgjengelig, sett gating vinduet til 0,6-10.0 NS.
  10. Slå på brightfield avbildning og bruk en detektor med lav følsomhet for datainnsamling. Angi forsterkningen til et nivå som gjør cellene tydelig synlige. Ikke bruk differensial forstyrrelser kontrast (DIC) fordi prisme vil forstyrre fangst av pålitelige fluorescens data.
  11. Sett Z-trinn-intervallet til 0,25-0.35 μm. image hele volumet av gjær cellene ved å samle inn om 20-25 optiske seksjoner per Z-stakken. Angi retningen for bildebehandling slik at "down" beveger seg mot dekkglass.
  12. For en typisk film, Angi tidsintervallet mellom Z-stabler til 2 s og Still filmen varighet til 5 til 10 min. avhengig av kupeen under studien, redusere intervallet for å gjøre kortere filmer av relativt rask dynamikk, eller øke intervallet for å gjøre lengre filmer av relativt langsom dynamikk.
  13. Lagre filmen som en LIF-fil med de brightfield bildene i den siste kanalen. Høyere bitdybder er unødvendige på dette stadiet, og behandlingsforløpet er konfigurert til å godta 8-biters TIFF-data.

3. deconvolution

  1. Start deconvolution programvare (se tabell over materialer) ved hjelp av algoritmen klassisk Maksimal sannsynlighet estimering.
  2. Åpne datasettet som ble generert i trinn 2,13. Velge â € deconvolution Wizard. Inspiser verdiene som vises i "parameter veiviseren". Bilde parametrene bør oppdages og vises korrekt. Under "brytnings indekser" endrer du verdien "embedding med." til 1,40 for å anslå gjær cytoplasma. Under «dekkglass» velger du «Start redigering» og «estimat posisjon» og «OK» for å angi dekkglass posisjon. Velg "sett alle bekreftede" og "godta".
  3. Fortsett gjennom "deconvolution Wizard" for hver fluorescens kanal. Velg "Manual" som modus for bakgrunn estimering. Inspiser rå data fluorescens intensitet profil for å bestemme en anslått bakgrunns verdi, som vanligvis er ca 0,1.
  4. I oppsettsmenyen for deconvolution skriver du inn en «maksimumsverdi for gjentakelser» i 40 og deaktiverer korrigering av blekemidler. Angi en estimert SNR-verdi, som vanligvis er omtrent 5,0. Klikk på "Deconvolve".
  5. Om nødvendig går du tilbake til den opprinnelige datafilen, justerer bakgrunnen og SNR-verdiene, og gjentar deconvolution, til støyen er tilstrekkelig fjernet uten å fjerne ekte fluorescens fra svake strukturer.
  6. Flett brightfield og deconvolved fluorescens kanaler. For etterfølgende film redigere bort skritt inne ImageJ, ordne kanalene som rød er for det første, grønn (hvis gave) er neste, blåfarge (hvis gave) er neste, og brightfield er vare. Lagre bildesekvensen som en 8-biters TIFF-fil.

4. Bleach korreksjon og Movie Generation

  1. Importer den deconvolved bildesekvensen til ImageJ, og konverter den til en hyperstack ved å velge Bilde > Hyperstacks > stable til Hyperstack. Velg "xyzct" fra rullegardinmenyen, og fyll inn antall kanaler, Z-stack-skiver og tidsrammer (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Velg bilde > farge > del kanaler.
  3. Korriger fluorescens kanaler for photobleaching ved hjelp av ImageJ plugin tilgjengelig fra http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Når det plugg har blitt lastet ned og installert, velger plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Velg "eksponentiell Fit."
  4. Hvis du vil flette brightfield og bleke korrigerte fluorescens kanaler til en hyperstack, velger du bilde > farge > slå sammen kanaler. Lagre den resulterende hyperstack som en 8-biters TIFF-fil.
  5. Installere den egendefinerte ImageJ plugins følger med denne protokollen. Følg instruksjonene i det vedlagte dokumentet for å vise, redigere og kvantifisere bildesekvensen, og til å lage en endelig film av de projiserte Z-bunkene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempelet gitt her dokumenter og kvantifiserer modning av to gjær Golgi cisternae som visualisere av dual-farge 4D konfokalmikroskopi mikroskopi3. En gjær celle inneholder på rekkefølgen av 10-15 Golgi cisternae, som hver modnes over en tid løpet av ca 2-4 min. modning kan bli visualisere ved å tagge tidlig Golgi markør Vrg4 med GFP og ved å merke den avdøde Golgi markør Sec7 med en rød fluorescerende protein som mCherry eller mScarlet. En individuell Cisterna etiketter i utgangspunktet med Vrg4 markør, deretter gjennomgår en kort overgang der markørene er utvekslet, og deretter etiketter med Sec7 markør.

Fordi cellen inneholder flere Golgi cisternae som er ganske mobil, er det utfordrende å følge en individuell Cisterna gjennom hele merkings perioden. Cisternae er ofte for tett sammen for å bli løst entydig gitt den timelige og romlige begrensninger av bildedataene. Videre Golgi cisternae tidvis sikring14, og sent Golgi cisternae tendens til å klynge på områder med polarisert vekst15. Som et resultat, gir en 4D film sjelden mer enn en eller to cisternae som kan spores pålitelig. En av de mest utfordrende trinnene i metoden er å undersøke den første filmen av Z-stakken anslag og identifisere cisternae som er lovende kandidater til analyse.

Tallene skildrer sekvensielle trinn i prosedyren:

Figur 1 viser rammer fra filmer av Z-stakken anslag av enten rådata eller deconvolved og bleke-korrigert data. Figur 1 A sammenligner de første rammene for de rå versus deconvolved dataene. Figur 1 B er fra samme deconvolved filmen, og viser flere rammer der de to cisternae som ble analysert etiketten først med den grønne Vrg4 markør og senere med den røde Sec7 markør. De cisternae ble valgt fordi de er klart adskilt fra andre merket strukturer for det meste av filmen. Bildene i dette tallet ble generert fra enten rå eller deconvolved og blekemiddel-korrigert 4D TIFF-hyperstacks ved hjelp av "Make Montage Series", "Montage serie til Hyperstack" og "Project Hyperstack" plugins.

Figur 2 viser en del av Montage som ble opprettet for en Z-stabel på en av tiden poeng, både før og etter redigering for å isolere signalet fra en av de valgte cisternae. Bildene i dette tallet ble generert fra deconvolved og blekemiddel-korrigert 4D TIFF-hyperstack ved hjelp av "Make Montage Series" og "Edit Montage Series" plugins.

Figur 3 viser flere bilder fra den endelige filmen av den projiserte Z-stabler (video 1), med de opprinnelige anslagene øverst og redigerte anslag nederst. Bildene i dette tallet ble generert fra den opprinnelige og redigerte montasjer ved hjelp av "Montage serie til Hyperstack", "Flett Hyperstacks", og "Project Hyperstacks" plugins.

Figur 4 viser kvantifisering av de grønne og røde fluorescens signalene fra den valgte cisternae. Dataene for dette tallet ble generert fra den redigerte hyperstacks ved hjelp av «analyser redigert film»-plugin-modulen.

Analyse av disse Golgi cisternae avslørte at Vrg4 markør ankommer og vedvarer i ca 80 s, og deretter Sec7 markør kommer og vedvarer i ca 60 s, med en kort periode med overlapping mellom de to markører. Som illustrert av dette eksempelet, gir 4D Imaging både kvalitativ og kvantitativ informasjon om dynamikken i en gjær kupé.

Figure 1
Figur 1 : Projeksjoner av Z-stabler fra en 4d-film. (A) projeksjoner av rådata (venstre) og deconvolved data (høyre) fra den første Z-stabelen i en 4d-film. Det grønne signalet er fra GFP-Vrg4, det røde signalet er fra Sec7-mScarlet, og det grå signalet er brightfield bilder av gjær cellene. Skala bar = 2 μm. (B) representative bilder fra den første filmen vist i (A) i deconvolved og prosjekterte Z-stabler. Tids punkter indikeres. Pilene markerer de to cisternae som ble valgt for analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : En del av Montage fra Z-stakken tilsvarer 01:20 tid punkt. Hvert bilde i Montage er en optisk seksjon. Den øverste panelet viser en del av den opprinnelige montasje, og det nederste panelet viser tilsvarende del av den redigerte montasje der fluorescens signalene fra den valgte Cisterna ble selektivt beholdt. I hvert panel er de optiske seksjonene ordnet fra venstre til høyre i den første raden og deretter fra venstre til høyre i den andre raden. Scale bar = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Rammer fra den endelige filmen av den projiserte Zstacks. I disse utdrag fra video 1, de opprinnelige bildene er vist over de redigerte bildene. De første fem rammene viser en Cisterna som gjennomgår en grønn-til-rød overgang, og de neste fem rammene viser en andre Cisterna som gjennomgår en lignende overgang. Piler som er overlappet på de opprinnelige bildene, angir cisternae som ble sporet. Scale bar = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Kvantifisering av de fluorescens signalene fra video 1. Grafene representerer GFP-Vrg4 og Sec7-mScarlet signaler fra de to cisternae valgt for analyse, der den øverste panelet representerer Cisterna som blir synlig i begynnelsen av filmen, og det nederste panelet representerer Cisterna som blir synlig senere i filmen. Tid null er definert for hver Cisterna som rammen like før GFP-Vrg4 fluorescens ble først oppdaget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: Final film av den projiserte Z-stabler. Den øvre panelet viser de opprinnelige anslagene, og det nederste panelet viser de redigerte anslagene der bare de to cisternae som er valgt for analyse, er synlige. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D konfokalmikroskopi avbildning av gjær organeller krever nøye tuning av flere parametre. Den store bekymringen er photobleaching og Phototoksisitet. En typisk 4D film innebærer å samle tusenvis av optiske seksjoner, slik at laser belysningen må holdes så lavt som mulig. Tandem fluorescerende protein koder kan brukes til å øke signalet uten å øke uttrykket av Tagged protein16,17. Å maksimere skannehastigheten bidrar til å begrense photoskade, og tillater også Z-stabler å bli tatt med passende korte intervaller. Voxel størrelser som er på Nyquist grensen i både XY og Z minimere lys eksponering mens teoretisk utvinne informasjon som er tilgjengelig fra den optiske Setup18. Til slutt, hver Voxel i et signal som inneholder området av en optisk seksjon vil vanligvis bare motta 1-3 fotoner. Denne mengden informasjon er langt under det som vanligvis anbefales for optimal bildebehandling med en enkelt Z-stabel, eller for deconvolution. Men deconvolution hjelper fortsatt ved å jevne ut de støyende signalene, og slike datasett kan analyseres og kvantifisert.

Selv med en høy kvalitet 4D datasett, sporing av merket organeller er en kompleks oppgave. Med det ImageJ plugg forsynt her over, en forsker kanne oppstille hver Z-stabel på computer skjermen og kanne lett bevege frem og tilbake imellom tid meningene og imellom originalen og redigert data. Disse verktøyene lar de merkede strukturene spores gjennom tid og rom med rimelig tillit. Imidlertid spiller subjektive dømme en nødvendig del, og bias må unngås når det er mulig. Partikkel Tracking programvare kan potensielt hjelpe, men er ennå ikke sofistikert nok for de fleste av fenomener som blir studert. For å kompensere for denne begrensningen, er det best å undersøke flere markører og teste spådommer av modellene på forskjellige måter3,6,7.

4D konfokalmikroskopi Imaging har spilt en sentral rolle i karakteriserer av gjær sekretoriske og endocytic trasé. Denne metoden viste at er exit nettsteder form de Novo og vedvarer på ubestemt tid1, bekreftet at Golgi cisternae modne3,5, og avklart rollen til COPI vesicle pels i Golgi modning7, 19i denne. Flere nylig, forutsatt 4D Imaging bevis for at gjær tidlig endosome er identisk med den avdøde Golgi, og at gjær sent endosome er en lang levetid kupé6. Mens statisk bildebehandling av fluorescensmerkete merkede avdelinger fortsetter å være verdifulle, tilbyr 4D Imaging unik innsikt i drifts prinsippene for gjær organeller.

En spennende ny utvikling i tilgjengeligheten av selv merkingsteknikker proteiner for fluorescerende merking20. SNAP-tag oppfører seg dårlig som en fusjon partner i gjær, men HaloTag oppfører seg bra. Bright og bred membran-permeant HaloTag underlag21 har gjort det mulig å utføre 4d konfokalmikroskopi Imaging med langt-røde fargestoffer6. Tilsetting av en langt-rød Imaging kanal til tidligere brukte grønne og røde Imaging kanaler tillater robust tre-farge 4D mikroskopi23, og dermed utvide omfanget av fenomener som kan bli studert i gjær av levende celle Imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01 GM104010. Takk for hjelp med fluorescens mikroskopi til Vytas Bindokas og Christine Labno på Integrated mikroskopi Core Facility, som er støttet av NIH-finansiert Cancer Center support Grant P30 CA014599.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 MatTek P35G-0.170-14-C Imaging dishes
Concanavalin A powder Sigma-Aldrich C2010
Trolox Vector Laboratories CB-1000
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite X  Leica Microsystems Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04 Scientific Volume Imaging Deconvolution software
ImageJ NIH Image processing and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).

Tags

Biologi Konfokalmikroskopi mikroskopi 4D Imaging fluorescens photobleaching deconvolution ImageJ gjær
4D mikroskopi av gjær
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, N., Glick, B. S. 4D… More

Johnson, N., Glick, B. S. 4D Microscopy of Yeast. J. Vis. Exp. (146), e58618, doi:10.3791/58618 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter