Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

4D Микроскопия дрожжей

Published: April 28, 2019 doi: 10.3791/58618
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Этот протокол описывает анализ флуоресцентно помеченных внутриклеточных отсеков в подающих надежды дрожжей с помощью многоцветной 4D (промежуток времени 3D) конфокальной микроскопии. Параметры изображения выбираются для захвата адекватных сигналов, ограничивая при этом фотоповреждения. Пользовательские плагины ImageJ позволяют отслеживать и количественно анализировать помеченные структуры.

Abstract

Цель юристого протокола – охарактеризовать, как формируются и трансформируются в живые клетки подающих надежды дрожжей. Многие внутриклеточные отсеки в дрожжах динамичны, и полное понимание их свойств требует замедленной визуализации. Многоцветная 4D конфокальная флуоресценционная микроскопия является мощным методом отслеживания поведения и состава внутриклеточного отсека в временной шкале 5-15 мин. Строгий анализ динамики отсека требует захвата тысяч оптических Разделы. Для достижения этой цели фотоотбеление и фототоксичность сводятся к минимуму путем быстрого сканирования при очень низкой мощности лазера, а размеры пикселей и интервалы в шагах устанавливаются на самые большие значения, совместимые с выборкой изображения при полном разрешении. Полученные 4D наборы данных шумные, но могут быть сглажены путем деконволюции. Даже при высоком качестве данных, этап анализа является сложной задачей, поскольку внутриклеточные структуры часто многочисленны, неоднородны и мобильны. Для удовлетворения этой потребности, пользовательские плагины ImageJ были написаны для массива 4D данных на экране компьютера, определить структуры, представляющие интерес, отсеивать данные, чтобы изолировать отдельные структуры, количественно флуоресценции время курсы, и делать фильмы из прогнозируемых стеков. 4D-фильмы особенно полезны для различения стабильных отсеков от переходных отсеков, которые переворачиваются при созревании. Такие фильмы также могут быть использованы для характеристики таких событий, как слияние отсеков, и для проверки влияния конкретных мутаций или других возмущений.

Introduction

Сравнения эндомембранной системы находятся в постоянном движении, и их полная характеристика требует визуализации живых клеток. Описано здесь протокол, который использует 4D (замедленное 3D) конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентно помечены отсеков в подающих надежды дрожжей. Метод был разработан для отслеживания динамики секретных отсеков в Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Этот протокол фокусируется на S. cerevisiae, который имеет нестоечный Golgi, вкотором отдельные цистерны оптически разрешимы4 . Необычная организация Golgi в S. cerevisiae позволила демонстрацию 4D микроскопией что цистерна Golgi первоначально маркирует с протеинами резидента предыдущих протеинов Golgi, и после этого теряет те протеины пока приобретающ резидента последние протеины Golgi3 ,5. Этот переход можно визуализировать, создавая штамм, в котором ранний белок Golgi Vrg4 помечен GFP, в то время как поздний белок Golgi Sec7 помечен мономерным красным флуоресцентным белком. Когда отдельные цистерны отслеживаются, созревание наблюдается как зелено-красное преобразование3. Этот тип анализа может предоставить ценную информацию о локализации белка и идентичности отсека. Например, два белка с слегка смещенным временем прибытия и отъезда иногда могут показаться, что они маркируют разные отсеки в статических изображениях, но их можно увидеть в 4D-фильмах, чтобы обозначить один и тот же отсек в разных временных точках6,7 . Таким образом, 4D микроскопия выявляет явления, которые в противном случае не были бы очевидны.

Информационная 4D микроскопия дрожжевых отсеков может быть достигнута с помощью соответствующих процедур и оборудования2. Когда это возможно, флуоресцентные пометки белка выполняется замена гена8, чтобы избежать переэкспрессии артефактов. Поскольку внутриклеточные структуры часто очень динамичны, 4D-изображение необходимо для обеспечения надежной обработки структуры с течением времени. В описанном здесь протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный детекторами высокой чувствительности. С помощью этого устройства, весь объем клеток S. cerevisiae может быть изображен конфокальной микроскопии примерно каждые 1-3 с, с 2 с интервалами является типичным. Данные могут быть собраны на срок до 5-15 мин в зависимости от плотности маркировки фторофоров и их фотофизических свойств. Основным препятствием является минимизация фотоотбелевания. Для этого интенсивность лазера сохраняется как можно ниже, скорость конфокального сканирования максимизируется, а оптические параметры настроены на изображение на пределе Nyquist, чтобы захватить соответствующую информацию, избегая при этом чрезмерного воздействия света. Эти настройки, как ожидается, также облегчить фототоксичность, фактор, который часто упускается из виду во время изображения живых клеток9,10,11. Полученные шумные данные обрабатываются с помощью алгоритмов коррекции отбеливателя и деконволюции для облегчения количественной оценки интенсивности флуоресценции.

Даже с высоким качеством 4D фильмов, анализ сложно, потому что дрожжевые отсеки, как правило, многочисленные, неоднородные, и мобильные. Из-за внутренних ограничений конфокальной микроскопии и неоптимальных настроек, необходимых для длительной 4D-визуализации, флуоресцентные структуры, которые находятся рядом друг с другом, трудно решить. Эту проблему можно обойти, сосредоточив внимание на небольшом количестве флуоресцентных структур, которые остаются оптически разрешимыми в течение периода маркировки, с предположением, что эти структуры являются репрезентативными для всей популяции маркированных Отделения. Флуоресцентные отсеки, которые можно надежно отслеживать, идентифицируются путем просмотра фильмов о проецируемом стеках и создания серии монтажей, в которых оптические секции для каждой временной точки выстраиваются на экране компьютера. В этом анализе используются пользовательские плагины ImageJ12, которые позволяют отслеживать индивидуальную структуру в изоляции.

Последние методы работы охватывает использование флуоресцентных белков в дрожжах13, а также теории и практики 4D конфокальной визуализации дрожжевых клеток2. Этот протокол фокусируется на ключевых практических аспектах эксперимента по визуализации 4D. Она включает в себя некоторые усовершенствования ранее описанных процедур, а также обновленные версии плагина ImageJ и документации. Показанный пример фокусируется на динамике Golgi, но этот протокол в равной степени подходит для визуализации других дрожжевых отсеков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. Сделать нефлуоресцентный минимальный NSD средний2. Отсутствие рибофлавина, как ожидается, приведет к снижению фоновой внутриклеточной зеленой флуоресценции и связанной с ней фототоксичности.
  2. Выращивайте дрожжи на ночь при 23 градусах по Цельсию до логарифмической фазы в 5 мл NSD в 50 мл озадачиваемой колбы с хорошей аэрацией. Около 3-4 ч до анализа, разбавить дрожжевой культуры в свежем NSD так, что окончательный OD600 будет 0,5-0,8 на момент изображения.
  3. Подготовка 2 мг/мл раствор конкановалина А (ConA). При желании заморозьте аликвоты этого раствора в жидком азоте и храните при -80 градусов по Цельсию.
  4. Спин ConA решение в течение 5 минут на полной скорости в микроцентрифуге, чтобы удалить твердые частицы, которые могут помешать визуализации. Затем добавьте 250 л супернатанта в чистую 35-мм покрывало нижней микроскопии. После 15 мин, мыть 2-3 раза с 2 мл dH2O и дайте высохнуть.
  5. Добавьте 250 кл культуры дрожжей к блюду с покрытием ConA, подождите 10 минут, чтобы позволить клеткам придерживаться, и аккуратно промыть 2-3 раза с 2 мл NSD. Обложка клетки с 2 мл свежих NSD.

2. Визуализация

  1. Используйте 63x или 100x масляный объектив погружения. Числовой диафрагмы (NA) 1,40 достаточно, но более высокий объектив NA также может быть использован.
  2. Формат размер кадра до 256 х 128 (ширина х высота). Если требуется больший размер кадра, увеличение ширины не уменьшит скорость сканирования до тех пор, пока конфокальный микроскоп оснащен резонансным сканером.
  3. Отрегулируйте коэффициент масштабирования, чтобы размер пикселя — 80 нм.
  4. Используйте максимальную скорость сканирования, которая обычно составляет порядка 8 кГц. Включите двунаправленное x сканирование, если оно доступно, и если контрольные эксперименты подтверждают, что сканирование с двух направлений находится в регистре.
  5. Установите накопление линии до 4 или 6. Не забудьте использовать накопление (суммирование) вместо усреднения.
  6. Установите пинхол до 1,2 Airy единиц. Эмпирически, при визуализации живых дрожжевых клеток, эта настройка захватывает больше фотонов, чем стандартный выбор 1.0 Airy единицы, не вызывая заметной потери разрешения.
  7. Для каждого канала флуоресценции установите длину волн возбуждения, назначайте детектор высокой чувствительности, установите диапазон длины эмиссии и включите режим подсчета фотонов, если это возможно. Выбор длины волны будет зависеть от фторфоров. В качестве примера, возбуждают флуоресценцию GFP при 485 нм и собирают от 495-550 нм, и возбуждают мскарм флуоресценцию при 555 нм и собирают с 562-625 нм.
  8. Установите интенсивность каждого лазера, чтобы быть как можно ниже. Эта настройка должна быть определена эмпирически. Соответствующая интенсивность приведет к захвату шумной, но интерпретируемой последовательности изображений, с отбеливанием сигнала флуоресценции не более чем на 50% к концу 5-минутного фильма. На конфокальном микроскопе, используемом здесь (см. ТаблицаМатериалов), эта интенсивность соответствует лазерной настройке мощности порядка 5%.
  9. Используйте фильтры выемки или время gating, чтобы избежать захвата отраженного света от coverslip. Если доступно время gating, установите окно gating до 0.6-10.0 ns.
  10. Включите яркое поле изображения и использовать детектор низкой чувствительности для сбора данных. Установите прибыль до уровня, который делает ячейки хорошо видны. Не используйте дифференциальный интерференционный контраст (DIC), поскольку призма будет мешать захвату надежных данных флуоресценции.
  11. Установите интервал с шагом до 0,25-0,35 мкм. Изображение всего объема дрожжевых клеток, собирая около 20-25 оптических секций на стек. Укажите направленность изображения таким образом, что "вниз" движется к coverslip.
  12. Для типичного фильма установите временной интервал между стеками до 2 с и установите продолжительность фильма до 5-10 мин. В зависимости от исследуемого отсека, уменьшите интервал, чтобы сделать более короткие фильмы относительно быстрой динамики, или увеличьте интервал, чтобы сделать более длинные фильмы относительно медленной динамики.
  13. Сохранить фильм в виде файла LIF с яркими изображениями поля на последнем канале. На данном этапе более высокие глубины бита не нужны, и конвейер обработки настроен на прием 8-битных данных TIFF.

3. Деконволюция

  1. Запуск деконволюционного программного обеспечения (см. Таблицаматериалов), используя алгоритм оценки классической максимальной вероятности.
  2. Откройте набор данных, созданный в шаге 2.13. Выберите "Деконволюция мастера". Проинспектировать значения, отображаемые в "Параметр мастер". Параметры изображения должны быть обнаружены и правильно отображены. В соответствии с "Рефракционными индексами" измените значение "Embedding med" на 1,40, чтобы приблизить дрожжевой цитоплазмы. Под "coverslip", выберите "Запуск редактор" и "Оценка позиции" и "OK", чтобы установить позицию coverslip. Выберите "Установить все проверенные" и "Принять".
  3. Пройдите через "Деконволюция мастера" для каждого канала флуоресценции. Выберите "Руководство" в качестве режима для фоновой оценки. Осмотрите профиль интенсивности флуоресценции необработанных данных, чтобы определить оценочное фоновое значение, которое обычно составляет около 0,1.
  4. В меню установки деконволюции введите значение "Максимальные итерации" 40 и выключите коррекцию отбеливателя. Введите оценочное значение SNR, которое обычно составляет около 5,0. Нажмите кнопку "Деконволв".
  5. При необходимости вернитесь к исходной файлу данных, отрегулируйте фон и значения SNR и повторите деконволюцию до тех пор, пока шум не будет достаточно удален, не исключив подлинную флуоресценцию из тусклых структур.
  6. Слияние ярко-поляных и деконволвных каналов флуоресценции. Для последующих шагов по редактированию фильмов в ImageJ, организовать каналы таким образом, что красный является первым, зеленый (если присутствует) является следующим, синий (если присутствует) является следующим, и яркое поле является последним. Сохранить последовательность изображений в виде 8-битного файла TIFF.

4. Отбеливатель коррекции и кино поколения

  1. Импорт deconvolved последовательности изображений в ImageJ и преобразовать его в гиперстек, выбрав изображение Выберите "xyzct" из выпадающего меню и заполните количество каналов, срезсов и временных рамок (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Выберите изображение
  3. Исправьте каналы флуоресценции для фотоотбеления с помощью плагина ImageJ, доступного из http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. После того, как плагин был загружен и установлен, выберите Плагины Выберите "Экспоненциальный Fit".
  4. Чтобы объединить яркое поле и отбеливатель исправлены каналы флуоресценции в гиперстек, выбрать изображение Сохранить полученный гиперстек в виде 8-битного файла TIFF.
  5. Установите пользовательские плагины ImageJ, предоставленные с этим протоколом. Следуйте инструкциям в сопроводительном документе для просмотра, отработки и количественной оценки последовательности изображений, а также для создания заключительного фильма о проецируемом стеках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Приведенный здесь пример документов и количественно созревания двух дрожжей Golgi цистерны, как визуализированы двойной цвет 4D конфокальной микроскопии3. Дрожжевой клетки содержит на заказ 10-15 Golgi cisternae, каждый из которых созревает в течение времени курс примерно 2-4 мин. Созревание может быть визуализировано путем пометки раннего Golgi маркер Vrg4 с GFP и пометки конце Golgi маркер Sec7 с красным флуоресцентным белок, такой как mCherry или mScarlet. Индивидуальные этикетки цистерны сначала с маркером Vrg4, а затем претерпевает краткий переход, в котором маркеры обмениваются, а затем этикетки с маркером Sec7.

Поскольку клетка содержит несколько цистерны Golgi, которые являются довольно мобильными, это сложно следовать отдельных цистерны на протяжении всего периода маркировки. Цистерны часто слишком близко друг к другу, чтобы быть решены однозначно с учетом временных и пространственных ограничений данных изображения. Кроме того, Golgi цистерны иногда предохранитель14, и конце Golgi цистерны, как правило, кластера на участках поляризованного роста15. В результате, 4D фильм редко дает более одной или двух цистерны, которые могут быть отслежены надежно. Одним из наиболее сложных шагов в этом методе является изучение первоначального фильма о проекциях стеков и выявление цистерны, которые являются перспективными кандидатами для анализа.

Цифры изображают последовательные шаги в процедуре:

На рисунке 1 показаны кадры из фильмов о проекциях стека, либо необработанных, либо деконволвированных и отбеливатель-исправленных данных. Рисунок 1 A сравнивает первые кадры для необработанных и деконволвированных данных. Рисунок 1 B из того же фильма deconvolved, и показывает несколько кадров, в которых две цистерны, которые были проанализированы этикетки сначала с зеленым маркером Vrg4, а затем с красным маркером Sec7. Эти цистерны были выбраны потому, что они четко отделены от других помеченных структур для большинства фильмов. Изображения на этой цифре были получены из сырых или deconvolved и отбеливатель исправлены 4D TIFF гиперстеки с использованием "Make Montage Series", "Montage Series к Hyperstack", и "Проект Hyperstack" плагины.

На рисунке 2 показана часть монтажа, созданного для стека в одном из временных точек, как до, так и после редактирования, чтобы изолировать сигнал от одной из выбранных цистерны. Изображения на этой цифре были получены из деконволвизированных и отбеливатель исправленных 4D TIFF гиперстек с использованием "Make Montage Series" и "Edit Montage Series" плагинов.

На рисунке 3 показаны несколько кадров из заключительного фильма о прогнозируемых стеках (Видео 1), с оригинальными проекциями вверху и отредактированными проекциями внизу. Изображения на этой цифре были получены из оригинальных и отредактированных монтажей с использованием плагинов "Montage Series to Hyperstack", "Merge Hyperstacks" и "Project Hyperstacks".

На рисунке 4 показана количественная оценка сигналов зеленой и красной флуоресценции от выбранных цистерны. Данные для этой цифры были получены из отредактированных гиперстеков с помощью плагина "Analyze Edited Movie".

Анализ этих цистерны Golgi показал, что маркер Vrg4 прибывает и сохраняется около 80 с, а затем маркер Sec7 прибывает и сохраняется около 60 с, с коротким периодом перекрытия между двумя маркерами. Как показано на этом примере, 4D-изображение обеспечивает качественную и количественную информацию о динамике дрожжевого отсека.

Figure 1
Рисунок 1 : Проекции стеков из 4D-фильма. (A) Проекции исходных данных (слева) и деконволвированных данных (справа) из первого стека в 4D-фильме. Зеленый сигнал от GFP-Vrg4, красный сигнал от Sec7-mScarlet, и серый сигнал яркие изображения дрожжевых клеток. Шкала бар No 2 мкм. (B) Представитель кадры из первоначального фильма показано в (A) из деконволвизированных и прогнозируемых стеков. Указаны очки времени. Стрелки отмечают две цистерны, которые были выбраны для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Часть монтажа из стека, соответствующая точке времени 01:20. Каждое изображение в монтаже представляет собой оптическую секцию. Верхняя панель показывает часть оригинального монтажа, а нижняя панель показывает соответствующую часть отредактированного монтажа, в которой флуоресцентные сигналы от выбранной цистерны были выборочно сохранены. В каждой панели оптические секции упорядочены слева направо в первом ряду, а затем слева направо во втором ряду. Шкала бар 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Кадры из заключительного фильма о прогнозируемых стогах. В этих отрывках из видео 1, оригинальные изображения показаны выше отредактированных изображений. На первых пяти кадрах показана одна цистерна, которая проходит переход от зеленого до красного цвета, а в следующих пяти кадрах показана вторая цистерна, которая подвергается аналогичному переходу. Стрелки, наложенные на исходные изображения, указывают на цистерны, которые отслеживались. Шкала бар 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Количественная оценка флуоресценции сигналов из видео 1. Графики представляют GFP-Vrg4 и Sec7-mScarlet сигналы от двух цистерны выбрали для анализа, где верхняя панель представляет цистерну, которая становится видимой в начале фильма и нижняя панель представляет цистерну, которая становится видимой позже в фильме. Для каждой цистерны определяется ноль времени как рамка перед тем, как была впервые обнаружена флуоресценция GFP-Vrg4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Video 1
Видео 1: Заключительный фильм о прогнозируемых стеках. Верхняя панель показывает исходные проекции, а нижняя панель показывает отредактированные проекции, в которых видны только две цистерны, выбранные для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D конфокальная визуализация дрожжевых органелл требует тщательной настройки нескольких параметров. Основной проблемой является фотоотбеление и фототоксичность. Типичный 4D фильм включает в себя сбор тысяч оптических секций, так что лазерное освещение должно быть как можно ниже. Тандем флуоресцентные теги белка могут быть использованы для повышения сигнала без увеличения экспрессии помечены белка16,17. Максимальное увеличение скорости сканирования помогает ограничить фотоповреждения, а также позволяет фиксировать стеки с соответствующими короткими интервалами. Voxel размеры, которые находятся на пределе Nyquist в обоих XY и ю минимизировать воздействие света при теоретически восстановления информации, которая доступна из оптической установки18. В конце концов, каждый воксель в сигналосодержащей области оптического сечения, как правило, получает только 1-3 фотона. Этот объем информации намного ниже того, что обычно рекомендуется для оптимальной визуализации с одним стеком или для деконволуации. Но деконволюция по-прежнему помогает путем сглаживания шумных сигналов, и такие наборы данных могут быть проанализированы и количественно.

Даже при высоком качестве 4D-набора данных отслеживание помеченных органелл является сложной задачей. С помощью плагинов ImageJ, предоставленных здесь, исследователь может массивкаждый каждый стек на экране компьютера и может легко перемещаться между точками времени и между исходными и отредактированными данными. Эти инструменты позволяют отслеживать помеченные структуры во времени и пространстве с разумной уверенностью. Однако субъективное суждение играет необходимую роль, и по возможности необходимо избегать предвзятости. Программное обеспечение для отслеживания частиц потенциально может помочь, но еще не достаточно сложным для большинства изученных явлений. Чтобы компенсировать это ограничение, лучше всего изучить несколько маркеров ипроверить прогнозы моделей по-разному 3,6,7.

4D конфокальная визуализация сыграла ключевую роль в характеристике дрожжей секреторных и эндоцитарных путей. Этот метод продемонстрировал, что ER выхода сайтов форме de novo и сохраняются на неопределенный срок1, подтвердил, что Golgi цистерны зрелые3,5, и уточнил роль COPI везикул пальто в Golgi созревания7, 19. Совсем недавно, 4D изображений при условии, что дрожжи ранней эндосомы идентична конце Golgi, и что дрожжи конце эндосомы является долгоживущим отсек6. В то время как статическое изображение флуоресцентно помеченных отсеков продолжает оставаться ценным, 4D-изображение предлагает уникальную информацию о принципах работы дрожжевых органелл.

Захватывающее недавнее развитие в наличии самомаркировки белков для флуоресцентных пометки20. SNAP-тег ведет себя плохо, как партнер по слиянию дрожжей, но HaloTag ведет себя хорошо. Яркие и фототаблица мембраны-пермяк HaloTag субстраты21 сделали возможным для выполнения 4D конфокальной визуализации с далеко-красные красители6. Добавление дальневосточного канала визуализации к ранее используемым зеленым и красным каналам изображения позволяет надежной трехцветной 4D микроскопии23,тем самым расширяя спектр явлений, которые могут быть изучены на дрожжах с помощью живой визуализации клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM104010. Спасибо за помощь с флуоресценцией микроскопии Витас Bindokas и Кристин Лабно на комплексной микроскопии Основной фонд, который поддерживается NIH финансируемых онкологический центр Поддержка Грант P30 CA014599.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 MatTek P35G-0.170-14-C Imaging dishes
Concanavalin A powder Sigma-Aldrich C2010
Trolox Vector Laboratories CB-1000
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite X  Leica Microsystems Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04 Scientific Volume Imaging Deconvolution software
ImageJ NIH Image processing and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).

Tags

Биология Выпуск 146 Конфокальная микроскопия 4D-изображение флуоресценция фотоотбойка деконволюция ImageJ дрожжи
4D Микроскопия дрожжей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, N., Glick, B. S. 4D… More

Johnson, N., Glick, B. S. 4D Microscopy of Yeast. J. Vis. Exp. (146), e58618, doi:10.3791/58618 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter