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Biology

Microscopía 4D de levadura

Published: April 28, 2019 doi: 10.3791/58618
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Abstract

El objetivo de este protocolo es caracterizar cómo se forman y transforman los compartimentos de membrana en células vivas de levadura en ciernes. Muchos compartimentos intracelulares en la levadura son dinámicos, y una comprensión completa de sus propiedades requiere imágenes de lapso de tiempo. La microscopía de fluorescencia confocal 4D multicolor es un método potente para rastrear el comportamiento y la composición de un compartimiento intracelular en una escala de tiempo de 5-15 min. El análisis riguroso de la dinámica del compartimiento requiere la captura de miles de Secciones. Para lograr este objetivo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se minimizan escaneando rápidamente a muy baja potencia láser, y las dimensiones en píxeles y los intervalos de paso en Z se establecen en los valores más grandes que son compatibles con el muestreo de la imagen a resolución completa. Los conjuntos de datos 4D resultantes son ruidosos, pero se pueden suavizar mediante la desconvolución. Incluso con datos de alta calidad, la fase de análisis es difícil porque las estructuras intracelulares son a menudo numerosas, heterogéneas y móviles. Para satisfacer esta necesidad, los plugins personalizados de ImageJ se escribieron en datos 4D de matriz en una pantalla de computadora, identificar estructuras de interés, editar los datos para aislar estructuras individuales, cuantificar los cursos de tiempo de fluorescencia y hacer películas de las pilas Z proyectadas. Las películas 4D son particularmente útiles para distinguir compartimentos estables de compartimentos transitorios que se vuelcan por maduración. Estas películas también se pueden utilizar para caracterizar eventos como la fusión de compartimentos, y para probar los efectos de mutaciones específicas u otras perturbaciones.

Introduction

Los compartimentos del sistema de endomembrana están en flujo constante, y su caracterización completa requiere imágenes celulares vivas. Aquí se describe un protocolo que emplea la microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) para visualizar compartimentos etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes. El método fue desarrollado para rastrear la dinámica de los compartimentos secretores en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Este protocolo se centra en S. cerevisiae, que tiene un Golgi no apilado en el que las cisternae individuales son ópticamente resolubles4. La inusual organización Golgi en S. cerevisiae permitió la demostración por microscopía 4D que una Golgi cisterna etiqueta inicialmente con proteínas Golgi tempranas residentes, y luego pierde esas proteínas mientras adquiere proteínas Golgi tardías residentes3 ,5. Esta transición se puede visualizar mediante la creación de una cepa en la que la proteína Golgi vrg4 temprano está etiquetada con GFP, mientras que la proteína Golgi tardía Sec7 está etiquetada con una proteína fluorescente roja monomérica. Cuando se realiza un seguimiento de cisternae individuales, se observa la maduración como una conversión de verde a rojo3. Este tipo de análisis puede proporcionar información valiosa sobre la localización de proteínas y la identidad del compartimiento. Por ejemplo, dos proteínas con tiempos de llegada y salida ligeramente compensados a veces pueden parecer etiquetar diferentes compartimentos en imágenes estáticas, pero se pueden ver en películas 4D para etiquetar el mismo compartimento en diferentes puntos de tiempo6,7 . Por lo tanto, la microscopía 4D revela fenómenos que de otra manera no serían evidentes.

La microscopía 4D informativa de los compartimentos delevadura se puede lograr con los procedimientos y equipos adecuados 2. Siempre que sea posible, el etiquetado de proteínas fluorescentes se realiza mediante reemplazo genético8 para evitar artefactos de sobreexpresión. Debido a que las estructuras intracelulares son a menudo muy dinámicas, se necesitan imágenes 4D para garantizar que una estructura se rastree de forma fiable a lo largo del tiempo. El protocolo descrito aquí emplea un microscopio confocal de escaneo láser equipado con detectores de alta sensibilidad. Con este dispositivo, todo el volumen celular de S. cerevisiae se puede escanear mediante microscopía confocal aproximadamente cada 1-3 s, con intervalos de 2 s siendo típicos. Los datos se pueden recopilar durante un máximo de 5-15 minutos dependiendo de las densidades de etiquetado de los fluoróforos y sus propiedades fotofísicas. El principal obstáculo es minimizar el fotoblanqueo. Para ello, las intensidades láser se mantienen lo más bajas posible, se maximiza la velocidad de escaneo confocal y los parámetros ópticos se configuran para crear imágenes en el límite de Nyquist con el fin de capturar la información relevante evitando una exposición excesiva a la luz. Estos ajustes también se espera que alivien la fototoxicidad,un factor que a menudo se pasa por alto durante las imágenes de células vivas 9,10,11. Los datos de ruidoso resultantes se procesan con algoritmos de corrección de lejía y desconvolución para facilitar la cuantificación de las intensidades de fluorescencia.

Incluso con películas 4D de alta calidad, el análisis es complicado porque los compartimentos de levadura tienden a ser numerosos, heterogéneos y móviles. Debido a las limitaciones intrínsecas de la microscopía confocal y los ajustes no óptimos necesarios para la toma de imágenes 4D prolongada, las estructuras fluorescentes que están cerca unas de otras son difíciles de resolver. Este problema puede eludirse centrándose en el pequeño número de estructuras fluorescentes que permanecen fijamente resueltas ópticamente durante el período de etiquetado, suponiendo que esas estructuras son representativas de toda la población de Compartimientos. Los compartimentos fluorescentes que se pueden rastrear de forma fiable se identifican mediante la visualización de películas de pilas Z proyectadas y mediante la creación de una serie de montajes en los que las secciones ópticas para cada punto de tiempo se agrupan en una pantalla de ordenador. Este análisis emplea plugins personalizados de ImageJ12, que permiten realizar un seguimiento de una estructura individual de forma aislada.

Los documentos de métodos recientes cubrieron el uso de proteínas fluorescentes en la levadura13, así como la teoría y práctica de la imagen confocal 4D de células de levadura2. Este protocolo se centra en los aspectos prácticos clave de un experimento de imágenes 4D. Incluye algunas mejoras a los procedimientos descritos anteriormente, así como versiones actualizadas del código y documentación del plugin ImageJ. El ejemplo mostrado se centra en la dinámica de Golgi, pero este protocolo es igualmente adecuado para la toma de imágenes de otros compartimentos de levadura.

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Protocol

1. Preparación

  1. Hacer no fluorescentes mínimos NSD medio2. Se espera que la ausencia de riboflavina reduzca la fluorescencia verde intracelular de fondo y la fototoxicidad asociada.
  2. Cultivar la cepa de levadura durante la noche a 23 oC en fase logarítmica en 5 ml de NSD en un matraz desfofado de 50 ml con buena aireación. Aproximadamente 3-4 h antes del análisis, diluir el cultivo de levadura en NSD fresco para que la OD final600 será 0.5-0.8 en el momento de la toma de imágenes.
  3. Preparar una solución de 2 mg/ml de concanavalina A (ConA). Si lo desea, congele las alícuotas de esta solución en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 oC.
  4. Gire la solución de ConA durante 5 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden interferir con las imágenes. A continuación, agregue 250 s de la supernatonción a un plato limpio de microscopía inferior de vidrio de 35 mm. Después de 15 min, lavar 2-3 veces con 2 mL de dH2O y dejar secar.
  5. Agregue 250 s de la levadura al plato recubierto con ConA, espere 10 minutos para permitir que las células se adhieran y lave suavemente 2-3 veces con 2 ml de NSD. Cubra las células con 2 ml de NSD fresco.

2. Imágenes

  1. Utilice una lente de inmersión en aceite de 63x o 100x. Una apertura numérica (NA) de 1.40 es suficiente, pero también se puede utilizar una lente NA más alta.
  2. Formatee el tamaño del fotograma a 256 x 128 (ancho x alto). Si se necesita un tamaño de bastidor más grande, aumentar la anchura no reducirá la velocidad de escaneo siempre y cuando el microscopio confocal esté equipado con un escáner resonante.
  3. Ajuste el factor de zoom para que el tamaño de píxel sea de 80 nm.
  4. Utilice la velocidad máxima de escaneo, que normalmente está en el orden de 8 kHz. Active el escaneo X bidireccional si está disponible y, si los experimentos de control confirman que los análisis de las dos direcciones están registrados.
  5. Establezca la acumulación de línea en 4 o 6. Asegúrese de usar la acumulación (sumando) en lugar de promediar.
  6. Establezca el agujero en 1,2 unidades ventiladas. Empíricamente, cuando se toma imágenes de células de levadura vivas, este ajuste captura más fotones que la opción estándar de 1.0 Unidad airy mientras no causa ninguna pérdida apreciable de resolución.
  7. Para cada canal de fluorescencia, establezca la longitud de onda de excitación, asigne un detector de alta sensibilidad, establezca el rango de longitud de onda de emisión y active el modo de recuento de fotones si está disponible. Las opciones de longitud de onda dependerán de los fluoróforos. Por ejemplo, excitar la fluorescencia GFP a 485 nm y recoger de 495-550 nm, y excitar la fluorescencia mScarlet a 555 nm y recoger de 562-625 nm.
  8. Ajuste la intensidad de cada láser para que sea lo más baja posible. Esta configuración debe determinarse empíricamente. Una intensidad adecuada dará lugar a la captura de una secuencia de imagen ruidoso pero interpretable, con la señal de fluorescencia blanqueando no más del 50% al final de una película de 5 minutos. En el microscopio confocal utilizado aquí (ver Tabla de Materiales), esta intensidad corresponde a un ajuste de potencia láser en el orden del 5%.
  9. Utilice filtros de muesca o tiempo para evitar capturar la luz reflejada del cubreobjetos. Si el tiempo está disponible, establezca la ventana de gating en 0.6-10.0 ns.
  10. Active las imágenes de campo brillante y utilice un detector de baja sensibilidad para la recopilación de datos. Establezca la ganancia en un nivel que haga que las celdas sean claramente visibles. No utilice contraste de interferencia diferencial (DIC) porque el prisma interferirá con la captura de datos de fluorescencia fiables.
  11. Establezca el intervalo del paso Z en 0,25-0,35 m. Imagen de todo el volumen de las células de levadura mediante la recopilación de unas 20-25 secciones ópticas por pila Z. Especifique la direccionalidad de las imágenes de forma que "abajo" se mueva hacia la cubierta.
  12. Para una película típica, establezca el intervalo de tiempo entre las pilas Z en 2 s y establezca la duración de la película en 5 a 10 min. Dependiendo del compartimiento en estudio, reduzca el intervalo para hacer películas más cortas de dinámica relativamente rápida, o aumente el intervalo para hacer películas más largas de dinámica relativamente lenta.
  13. Guarde la película como un archivo LIF con las imágenes de campo brillante en el último canal. Las profundidades de bits más altas son innecesarias en esta etapa y la canalización de procesamiento está configurada para aceptar datos TIFF de 8 bits.

3. Desconvolución

  1. Inicie el software de desconvolución (consulte Tabla de materiales), utilizando el algoritmo de estimación de máxima probabilidad clásica.
  2. Abra el conjunto de datos generado en el paso 2.13. Seleccione "Asistente de desconvolución". Inspeccione los valores mostrados en el "Asistente de parámetros". Los parámetros de imagen deben detectarse y mostrarse correctamente. En "Índices de refracción", cambie el valor "Embedding med." a 1.40 para aproximar el citoplasma de levadura. En "coverslip", seleccione "Launch editor" y "Estimate position" y "OK" para establecer la posición de coverslip. Seleccione "Establecer todo verificado" y "Aceptar".
  3. Proceda a través del "Asistente de desconvolución" para cada canal de fluorescencia. Seleccione "Manual" como el modo para la estimación de fondo. Inspeccione el perfil de intensidad de fluorescencia de datos sin procesar para determinar un valor de fondo estimado, que suele ser de aproximadamente 0,1.
  4. En el menú de configuración de desconvolución, introduzca un valor "Iteraciones máximas" de 40 y desactive la corrección de lejía. Ingrese un valor estimado Del SNR, que es típicamente alrededor de 5.0. Haga clic en "Deconvolve".
  5. Si es necesario, vuelva al archivo de datos original, ajuste los valores de fondo y SNR y repita la desconvolución, hasta que el ruido se elimine lo suficiente sin eliminar la fluorescencia genuina de las estructuras tenues.
  6. Combinar el campo brillante y los canales de fluorescencia desconvolved. Para los siguientes pasos de edición de películas en ImageJ, organice los canales de modo que el rojo sea el primero, el verde (si está presente) es el siguiente, el azul (si está presente) es el siguiente y el campo brillante es el último. Guarde la secuencia de imágenes como un archivo TIFF de 8 bits.

4. Corrección de lejía y generación de películas

  1. Importe la secuencia de imágenes desconvolved en ImageJ y conviértala en un hiperstack eligiendo Imagen > Hiperpilas > Apilar en Hyperstack. Seleccione "xyzct" en el menú desplegable y rellene el número de canales, sectores de pila Z y marcos de tiempo (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Elija Imagen > Color > Dividir canales.
  3. Corrija los canales de fluorescencia para el fotoblanqueo utilizando el plugin ImageJ disponible en http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Una vez que ese plugin se ha descargado e instalado, elija Plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Seleccione "Ajuste exponencial."
  4. Para fusionar los canales de fluorescencia de campo brillante y corregidos por lejía en un hiperstack, elija Imagen > Color > Fusionar canales. Guarde el hiperstack resultante como un archivo TIFF de 8 bits.
  5. Instale los plugins Personalizados de ImageJ proporcionados con este protocolo. Siga las instrucciones del documento adjunto para ver, editar y cuantificar la secuencia de imágenes y producir una película final de las pilas Z proyectadas.

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Representative Results

El ejemplo dado aquí documenta y cuantifica la maduración de dos levaduras Golgi cisternae visualizadas por la microscopía confocal 4D de doble color3. Una célula de levadura contiene en el orden de 10-15 Golgi cisternae, cada uno de los cuales madura en un curso de tiempo de aproximadamente 2-4 min. La maduración se puede visualizar etiquetando el marcador Golgi temprano Vrg4 con GFP y etiquetando el marcador Golgi tardío Sec7 con un fluorescente rojo fluorescente proteínacomo mCherry o mScarlet. Una cisterna individual etiqueta inicialmente con el marcador Vrg4, luego se somete a una breve transición en la que se intercambian los marcadores, y luego etiquetas con el marcador Sec7.

Debido a que la celda contiene varias cisternae Golgi que son bastante móviles, es difícil seguir una cisterna individual durante todo el período de etiquetado. Las cisternas a menudo están demasiado juntas para resolverse inequívocamente dadas las limitaciones temporales y espaciales de los datos de imagen. Por otra parte, Golgi cisternae ocasionalmente fusible14, y los cisternae Golgi tardío tienden a agruparse en sitios de crecimiento polarizado15. Como resultado, una película 4D rara vez produce más de una o dos cisternae que se pueden rastrear de forma confiable. Uno de los pasos más desafiantes en el método es examinar la película inicial de las proyecciones de la pila Z e identificar cisternae que son candidatos prometedores para el análisis.

Las figuras representan pasos secuenciales en el procedimiento:

La Figura 1 muestra fotogramas de películas de las proyecciones de la pila Z de datos sin procesar o datos desconvodos y corregidos por lejía. Figura 1 A compara los primeros fotogramas de los datos sin procesar frente a los datos desconvolved. Figura 1 B es de la misma película deconvolved, y muestra varios fotogramas en los que las dos cisternae que se analizaron etiqueta primero con el marcador Verde Vrg4 y más tarde con el marcador rojo Sec7. Esas cisternae fueron elegidas porque están claramente separadas de otras estructuras etiquetadas para la mayor parte de la película. Las imágenes de esta figura se generaron a partir de hiperpilas TIFF 4D crudas o desconvolved y corregidas por lejía utilizando los plugins "Make Montage Series", "Montage Series to Hyperstack" y "Project Hyperstack".

La Figura 2 muestra parte del montaje que se creó para una pila Z en uno de los puntos de tiempo, tanto antes como después de la edición para aislar la señal de una de las cisternae elegidas. Las imágenes de esta figura se generaron a partir de la hiperpila TIFF 4D desconvolved y corregida por lejía utilizando los plugins "Make Montage Series" y "Edit Montage Series".

La Figura 3 muestra varios fotogramas de la película final de las pilas Z proyectadas (Vídeo 1), con las proyecciones originales en la parte superior y las proyecciones editadas en la parte inferior. Las imágenes de esta figura se generaron a partir de los montajes originales y editados utilizando los plugins "Montage Series to Hyperstack", "Merge Hyperstacks" y "Project Hyperstacks".

La Figura 4 muestra la cuantificación de las señales de fluorescencia verde y roja de las cisternae elegidas. Los datos de esta figura se generaron a partir de las hiperpilas editadas utilizando el plugin "Analyze Edited Movie".

El análisis de estas cisternas Golgi reveló que el marcador Vrg4 llega y persiste durante unos 80 s, y luego el marcador Sec7 llega y persiste durante unos 60 s, con un breve período de superposición entre los dos marcadores. Como se ilustra en este ejemplo, las imágenes 4D proporcionan información cualitativa y cuantitativa sobre la dinámica de un compartimento de levadura.

Figure 1
Figura 1 : Proyecciones de pilas Z de una película 4D. (A) Proyecciones de los datos sin procesar (izquierda) y datos desconvolved (derecha) de la primera pila Z en una película 4D. La señal verde es de GFP-Vrg4, la señal roja es de Sec7-mScarlet, y la señal gris son las imágenes de campo brillante de las células de levadura. Barra de escala de2 m. (B ) Fotogramas representativos de la película inicial que se muestra en (A) de las pilas Z desconvoludas y proyectadas. Se indican los puntos de tiempo. Las flechas marcan las dos cisternae que fueron elegidas para el análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Una porción del montaje de la pila Z correspondiente al punto de tiempo 01:20. Cada imagen del montaje es una sección óptica. El panel superior muestra parte del montaje original, y el panel inferior muestra la parte correspondiente del montaje editado en el que se mantuvieron selectivamente las señales de fluorescencia de la cisterna elegida. En cada panel, las secciones ópticas se ordenan de izquierda a derecha en la primera fila y luego de izquierda a derecha en la segunda fila. Barra de escala de 2 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fotogramas de la película final de los Zstacks proyectados. En estos extractos de Video 1, las imágenes originales se muestran encima de las imágenes editadas. Los primeros cinco cuadros muestran una cisterna que sufre una transición de verde a rojo, y los siguientes cinco fotogramas muestran una segunda cisterna que sufre una transición similar. Las flechas superpuestas en las imágenes originales indican las cisternas que fueron rastreadas. Barra de escala de 2 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Cuantificación de las señales de fluorescencia del vídeo 1. Los gráficos representan las señales GFP-Vrg4 y Sec7-mScarlet de las dos cisternae elegidas para el análisis, donde el panel superior representa la cisterna que se hace visible al principio de la película y el panel inferior representa la cisterna que se hace visible más tarde en la película. El tiempo cero se define para cada cisterna como el marco justo antes de que se detectara por primera vez la fluorescencia GFP-Vrg4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Video 1: Película final de las pilas Z proyectadas. El panel superior muestra las proyecciones originales y el panel inferior muestra las proyecciones editadas en las que solo están visibles las dos cisternae elegidas para el análisis. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

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Discussion

La toma de imágenes confocales 4D de los orgánulos de levadura requiere una afinación cuidadosa de múltiples parámetros. La principal preocupación es el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una película 4D típica implica la recopilación de miles de secciones ópticas, por lo que la iluminación láser debe mantenerse lo más baja posible. Las etiquetas de proteínas fluorescentes tándem se pueden utilizar para aumentar la señal sin aumentar la expresión de la proteína etiquetada16,17. Maximizar la velocidad de escaneo ayuda a limitar el fotodaño, y también permite que las pilas Z se capturen a intervalos convenientemente cortos. Los tamaños de Voxel que están en el límite Nyquist tanto en XY como en Z minimizan la exposición a la luz mientras se recupera teóricamente la información disponible en la configuración óptica18. Al final, cada voxel en un área que contiene señal de una sección óptica normalmente recibirá sólo 1-3 fotones. Esta cantidad de información está muy por debajo de lo que normalmente se recomienda para obtener imágenes óptimas con una sola pila Z o para la desconvolución. Pero la desconvolución sigue ayudando al suavizar las señales ruidosos, y estos conjuntos de datos se pueden analizar y cuantificar.

Incluso con un conjunto de datos 4D de alta calidad, el seguimiento de orgánulos etiquetados es una tarea compleja. Con los plugins ImageJ proporcionados aquí, un investigador puede hacer arreglos de discos de cada pila Z en la pantalla del ordenador y puede moverse fácilmente entre puntos de tiempo y entre los datos originales y editados. Estas herramientas permiten rastrear las estructuras etiquetadas a través del tiempo y el espacio con una confianza razonable. Sin embargo, el juicio subjetivo juega un papel necesario, y el sesgo debe evitarse siempre que sea posible. El software de seguimiento de partículas podría ayudar potencialmente, pero aún no es lo suficientemente sofisticado para la mayoría de los fenómenos que se están estudiando. Para compensar esta limitación, es mejor examinar varios marcadores y probar las predicciones de los modelos de diferentes maneras3,6,7.

Las imágenes confocales 4D han desempeñado un papel fundamental en la caracterización de las vías secretoras y endocíticas de la levadura. Este método demostró que los sitios de salida de ER forman de novo y persisten indefinidamente1, confirmó que Golgi cisternae maduro3,5, y aclaró el papel de la capa de vesícula COPI en la maduración de Golgi7, 19. Más recientemente, las imágenes 4D proporcionaron evidencia de que el endosoma temprano de la levadura es idéntico al Golgi tardío tardío, y que la levadura tardía endosoma es un compartimentodelarga duración 6. Mientras que las imágenes estáticas de compartimentos con etiqueta fluorescente siguen siendo valiosas, las imágenes 4D ofrecen información única sobre los principios de funcionamiento de los orgánulos de levadura.

Un emocionante desarrollo reciente en la disponibilidad de proteínas autoetiquetados para el etiquetado fluorescente20. La etiqueta SNAP se comporta mal como un socio de fusión en levadura, pero HaloTag se comporta bien. Los sustratos HaloTag21 con membrana brillante y fotostable han hecho posible realizar imágenes confocales 4D con colorantes rojos lejanos6. La adición de un canal de imágenes de color rojo lejano a los canales de imágenes verdes y rojos utilizados anteriormente permite una robusta microscopía 4D de tres colores23,ampliando así la gama de fenómenos que se pueden estudiar en levaduras mediante imágenes de células vivas.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01 GM104010. Gracias por la ayuda con la microscopía de fluorescencia a Vytas Bindokas y Christine Labno en Integrated Microscopy Core Facility, que cuenta con el apoyo de la subvención de apoyo a cancercenteros P30 CA014599, financiada por NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 MatTek P35G-0.170-14-C Imaging dishes
Concanavalin A powder Sigma-Aldrich C2010
Trolox Vector Laboratories CB-1000
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite X  Leica Microsystems Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04 Scientific Volume Imaging Deconvolution software
ImageJ NIH Image processing and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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