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Biology

खमीर की 4D माइक्रोस्कोपी

Published: April 28, 2019 doi: 10.3791/58618
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

इस प्रोटोकॉल बहु रंग 4 डी (समय चूक 3 डी) confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नवोदित खमीर में फ्लोरोसेंट लेबल intracellular डिब्बों के विश्लेषण का वर्णन करता है। इमेजिंग पैरामीटर photodamage सीमित करते समय पर्याप्त संकेतों पर कब्जा करने के लिए चुना जाता है. कस्टम ImageJ plugins लेबल संरचनाओं पर नज़र रखी और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह विशेषता है कि झिल्ली के डिब्बे कैसे बनते हैं और नवोदित खमीर की जीवित कोशिकाओं में बदलना है। खमीर में कई intracellular डिब्बों गतिशील हैं, और उनके गुणों की एक पूरी समझ समय चूक इमेजिंग की आवश्यकता है. बहु रंग 4D confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 5-15 मिनट के एक समय पैमाने पर एक intracellular डिब्बे के व्यवहार और संरचना पर नज़र रखने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. डिब्बे गतिशीलता के कठोर विश्लेषण ऑप्टिकल के हजारों की कब्जा की आवश्यकता है अनुभागों. इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, photobleaching और phototoxicity बहुत कम लेजर शक्ति पर तेजी से स्कैनिंग से कम कर रहे हैं, और पिक्सेल आयाम और जेड कदम अंतराल सबसे बड़ा मूल्यों है कि पूर्ण संकल्प पर छवि नमूना के साथ संगत कर रहे हैं करने के लिए सेट कर रहे हैं. परिणामस्वरूप 4D डेटा सेट शोर कर रहे हैं, लेकिन deconvolution द्वारा smoothed किया जा सकता है. यहां तक कि उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के साथ, विश्लेषण चरण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इंट्रासेल्यूलर संरचनाएं अक्सर कई, विषम, और मोबाइल होती हैं। इस जरूरत को पूरा करने के लिए, कस्टम ImageJ plugins एक कंप्यूटर स्क्रीन पर सरणी 4D डेटा के लिए लिखा गया था, ब्याज की संरचनाओं की पहचान, व्यक्तिगत संरचनाओं को अलग करने के लिए डेटा संपादित करें, फ्लोरोसेंट समय पाठ्यक्रम मात्रा, और अनुमानित की फिल्में बनाने के लिए -stacks. 4D फिल्में विशेष रूप से क्षणिक डिब्बों कि परिपक्वता से अधिक बारी से स्थिर डिब्बों भेद के लिए उपयोगी होते हैं. इस तरह की फिल्मों को भी इस तरह के डिब्बे संलयन के रूप में घटनाओं की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विशिष्ट उत्परिवर्तनों या अन्य क्षोभ के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए.

Introduction

एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम के कंपार्टमेंट्स लगातार फ्रलक्स में होते हैं, और उनकी पूर्ण विशेषता को लाइव सेल इमेजिंग की आवश्यकता होती है। यहाँ वर्णित एक प्रोटोकॉल है कि रोजगार 4D (समय चूक 3 डी) confocal माइक्रोस्कोपी नवोदित खमीर में फ्लोरोसेंट लेबल डिब्बों कल्पना है. इस विधि को पिकिया पासारिस और सकहोमोमिक्स सेरेविसे1,2,3में स्रावी डिब्बों की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए विकसित किया गया था . इस प्रोटोकॉल एस सेरेविसियाई पर केंद्रित है, जिसमें एक nonstacked Golgi है जिसमें व्यक्तिगत कुंडी ऑप्टिकली resolvable4हैं. एस सेरेविएसिया में असामान्य Golgi संगठन 4D माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन सक्षम है कि एक Golgi cisterna शुरू में निवासी जल्दी Golgi प्रोटीन के साथ लेबल, और फिर उन प्रोटीन खो देता है, जबकि निवासी देर Golgi प्रोटीनप्राप्त 3 ,5. इस संक्रमण एक तनाव है जिसमें जल्दी Golgi प्रोटीन Vrg4 GFP के साथ लेबल है, जबकि देर Golgi प्रोटीन Sec7 एक monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल है बनाने के द्वारा कल्पना की जा सकती है. जब अलग-अलग कुंडों को ट्रैक किया जाता है, तो परिपक्वता को हरे-से-लाल रूपांतरण3के रूप में देखा जाता है। विश्लेषण के इस प्रकार प्रोटीन स्थानीयकरण और डिब्बे पहचान के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, थोड़ा ऑफसेट आगमन और प्रस्थान समय के साथ दो प्रोटीन कभी कभी स्थिर छवियों में विभिन्न डिब्बों लेबल प्रकट हो सकता है, लेकिन 4D फिल्मों में देखा जा सकता है अलग अलग समय अंक6,7 पर एक ही डिब्बे लेबल . इस प्रकार, 4D माइक्रोस्कोपी घटना है कि अन्यथा स्पष्ट नहीं होगा पता चलता है.

खमीर डिब्बों की जानकारीपूर्ण 4D माइक्रोस्कोपी उचित प्रक्रियाओं और उपकरण2के साथ प्राप्त किया जा सकता है। जब भी संभव हो, फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैगिंग जीन प्रतिस्थापन8 द्वारा किया जाता है overexpression कलाकृतियों से बचने के लिए. क्योंकि intracellular संरचनाओं अक्सर बहुत गतिशील हैं, 4D इमेजिंग सुनिश्चित करें कि एक संरचना समय के साथ मज़बूती से ट्रैक किया जाता है की जरूरत है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टरों से लैस एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप कार्यरत हैं. इस डिवाइस के साथ, एस cerevisiae की पूरी सेल मात्रा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लगभग हर 1-3 s द्वारा छवि बनाई जा सकती है, 2 s अंतराल के साथ विशिष्ट जा रहा है. फ्लोरोफोर्स के लेबलिंग घनत्व और उनके फोटोफिजिकल गुणों के आधार पर 5-15 मिनट तक डेटा एकत्र किया जा सकता है। मुख्य बाधा photobleaching को कम करने के लिए है। इस उद्देश्य के लिए, लेजर तीव्रता के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाता है, confocal स्कैन गति अधिकतम है, और ऑप्टिकल पैरामीटर के लिए प्रासंगिक जानकारी पर कब्जा करने के क्रम में NyQuist सीमा पर छवि के लिए कॉन्फ़िगर कर रहे हैं, जबकि अत्यधिक प्रकाश जोखिम से परहेज. इन सेटिंग्स को भी phototoxicity को कम करने की उम्मीद कर रहे हैं, एक कारक है कि अक्सर लाइव सेल इमेजिंग9,10,11 केदौरान अनदेखी की है . परिणामस्वरूप शोर डेटा ब्लीच सुधार और deconvolution एल्गोरिदम के साथ संसाधित कर रहे हैं फ्लोरोसेंट तीव्रता के परिमाण की सुविधा के लिए.

यहां तक कि उच्च गुणवत्ता 4D फिल्मों के साथ, विश्लेषण मुश्किल है क्योंकि खमीर डिब्बों के लिए कई हो जाते हैं, विषम, और मोबाइल. confocal माइक्रोस्कोपी की आंतरिक सीमाओं और लंबे समय तक 4D इमेजिंग के लिए आवश्यक गैर इष्टतम सेटिंग्स के कारण, फ्लोरोसेंट संरचनाओं है कि एक दूसरे के पास हैं हल करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इस समस्या को फ्लोरोसेंट संरचनाओं की छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित करके दरकिनार किया जा सकता है जो लेबलिंग अवधि की अवधि के लिए ऑप्टिकली समाधान योग्य रहते हैं, इस धारणा के साथ कि उन संरचनाओं लेबल की पूरी आबादी के प्रतिनिधि हैं डिब्बों. फ्लोरिसेंट डिब्बों कि मज़बूती से ट्रैक किया जा सकता है प्रक्षेपित की फिल्मों को देखने के द्वारा की पहचान कर रहे हैं - stacks और montages की एक श्रृंखला है जिसमें प्रत्येक समय बिंदु के लिए ऑप्टिकल वर्गों एक कंप्यूटर स्क्रीन पर arrayed हैं बनाने के द्वारा. इस विश्लेषण कस्टम ImageJ12 plugins है, जो एक व्यक्तिगत संरचना अलगाव में ट्रैक किया जा करने की अनुमति कार्यरत हैं.

हाल के तरीकों के कागजात खमीर13 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के साथ ही सिद्धांत और खमीर कोशिकाओं के 4D confocal इमेजिंग के अभ्यास को कवरकिया 2. इस प्रोटोकॉल एक 4D इमेजिंग प्रयोग के प्रमुख व्यावहारिक पहलुओं पर केंद्रित है. यह पहले से वर्णित प्रक्रियाओं, साथ ही ImageJ प्लगइन कोड और प्रलेखन के अद्यतन संस्करणों के लिए कुछ एन्हांसमेंट्स शामिल हैं. दिखाया उदाहरण Golgi गतिशीलता पर केंद्रित है, लेकिन इस प्रोटोकॉल अन्य खमीर डिब्बों इमेजिंग के लिए समान रूप से उपयुक्त है.

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Protocol

1. तैयारी

  1. Nonfluorescent न्यूनतम NSD मध्यम2बनाओ | राइबोफ्लेविन की अनुपस्थिति से पृष्ठभूमि इंट्रासेल्यूलर ग्रीन फ्लोरोसेंट और संबद्ध फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने की उम्मीद है।
  2. 5 एमएल एनएसडी में 5 एमएल एनएसडी में लघुगणकीय चरण के लिए $ 23 डिग्री सेल्सियस पर रात भर खमीर तनाव बढ़ने अच्छा वातन के साथ एक 50 एमएल चकित फ्लास्क में। के बारे में 3-4 ज विश्लेषण से पहले, ताजा एनएसडी में खमीर संस्कृति को पतला इतना है कि अंतिम OD600 इमेजिंग के समय 0.5-0.8 हो जाएगा.
  3. कोनावेलिन ए (कोना) का 2 मिलीग्राम/एमएल समाधान तैयार करें। यदि वांछित हो, तो इस विलयन के एलिकोट्स को तरल नाइट्रोजन में स्थिर करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कण पदार्थ है कि इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटाने के लिए एक microcentrifuge में पूरी गति से 5 मिनट के लिए ConA समाधान स्पिन. फिर सुपरनेंट के 250 डिग्री एल को एक साफ 35 मिमी कवरग्लास बॉटम माइक्रोस्कोपी डिश में जोड़ें। 15 मिनट के बाद, 2 लाख 2 लाख2 ह. से 2-3 बार धोलें और सूख ने सुखा लें।
  5. कोना लेपित पकवान के लिए खमीर संस्कृति के 250 $L जोड़ें, 10 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति है, और धीरे 2 एमएल NSD के साथ 2-3 बार धो लो. 2 एमएल ताजा एनएसडी के साथ कोशिकाओं को कवर।

2. इमेजिंग

  1. एक 63x या 100x तेल विसर्जन लेंस का प्रयोग करें. 1ण्40 का एक संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर्याप्त है, लेकिन एक उच्च एनए लेंस भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. फ़्रेम आकार को 256 x 128 (चौड़ाई x ऊँचाई) में स्वरूपित करें. यदि एक बड़े फ्रेम आकार की जरूरत है, चौड़ाई बढ़ाने के रूप में लंबे समय के रूप में confocal माइक्रोस्कोप एक गुंजयमान स्कैनर के साथ सुसज्जित है स्कैन की गति को कम नहीं करेगा.
  3. पिक्सेल आकार $ 80 एनएम बनाने के लिए ज़ूम कारक समायोजित करें।
  4. अधिकतम स्कैन गति है, जो आम तौर पर 8 kHz के आदेश पर है का प्रयोग करें. यदि यह उपलब्ध है, तो द्विदिश एक्स स्कैनिंग चालू करें, और नियंत्रण प्रयोगों की पुष्टि करें कि दो दिशाओं से स्कैन रजिस्टर में हैं।
  5. 4 या 6 करने के लिए लाइन संचय सेट करें। औसत के बजाय संचय (सारांश) का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  6. 1.2 हवादार इकाइयों के लिए pinhole सेट करें. अनुभवजन्य रूप से, जब लाइव खमीर कोशिकाओं इमेजिंग, इस सेटिंग 1.0 एयरी इकाई के मानक विकल्प से अधिक फोटॉनों कब्जा जबकि संकल्प का कोई प्रशंसनीय नुकसान के कारण.
  7. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट, एक उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टर आवंटित, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य रेंज सेट, और यदि उपलब्ध फोटॉन गिनती मोड पर बारी. तरंगदैर्ध्य विकल्प फ्लोरोफोर पर निर्भर करेगा। एक उदाहरण के रूप में, 485 एनएम पर GFP फ्लोरोसेंट उत्तेजित और 495-550 एनएम से इकट्ठा, और 555 एनएम पर mScarlet फ्लोरोसेंट उत्तेजित और 562-625 एनएम से इकट्ठा.
  8. प्रत्येक लेजर की तीव्रता सेट के रूप में संभव के रूप में कम हो. यह सेटिंग अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए. एक उचित तीव्रता एक शोर लेकिन व्याख्या योग्य छवि अनुक्रम का कब्जा करने में परिणाम होगा, फ्लोरोसेंट संकेत ब्लीचिंग के साथ कोई अधिक से अधिक 50% एक 5 मिनट फिल्म के अंत तक. यहाँ इस्तेमाल किया confocal माइक्रोस्कोप पर (सामग्री की तालिकादेखें), इस तीव्रता 5% के आदेश पर एक लेजर शक्ति की स्थापना से मेल खाती है.
  9. coverslip से परावर्तित प्रकाश पर कब्जा करने से बचने के लिए पायदान फिल्टर या समय gating का प्रयोग करें। समय gating उपलब्ध है, तो 0.6-10.0 ns करने के लिए gating विंडो सेट करें।
  10. Brightfield इमेजिंग चालू करें और डेटा संग्रह के लिए एक कम संवेदनशीलता डिटेक्टर का उपयोग करें. लाभ को उस स्तर पर सेट करें जो कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) का उपयोग न करें क्योंकि प्रिज्म विश्वसनीय फ्लोरोसेंट डेटा के कैप्चर में हस्तक्षेप करेगा।
  11. $ चरण अंतराल को 0ण्25-0ण्35 उ पर सेट करें. प्रति $-स्टैक लगभग 20-25 ऑप्टिकल अनुभागों को एकत्रित करके खमीर कोशिकाओं की संपूर्ण मात्रा को छवि बनाएँ. इमेजिंग की दिशात्मकता इस तरह निर्दिष्ट करें कि "नीचे" कवरस्लिप की ओर ले जाता है।
  12. किसी विशिष्ट फिल्म के लिए, $-स्टैक के बीच का समय अंतराल 2 s पर सेट करें और फिल्म की अवधि को 5 से 10 मिनट तक सेट करें. अध्ययन के अधीन डिब्बे के आधार पर, अपेक्षाकृत तेज़ गतिशीलता की छोटी फिल्में बनाने के लिए अंतराल को कम करें, या अंतराल को बढ़ाकर लंबी फिल्में बनाने के लिए अपेक्षाकृत धीमी गति से गतिशीलता.
  13. अंतिम चैनल में brightfield छवियों के साथ एक LIF फ़ाइल के रूप में फिल्म सहेजें. उच्च बिट गहराई इस स्तर पर अनावश्यक हैं, और संसाधन पाइपलाइन 8-बिट TIFF डेटा स्वीकार करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है।

3. Deconevolution

  1. Deconvolution सॉफ्टवेयर लॉन्च (सामग्री की तालिकादेखें), क्लासिक अधिकतम संभावना अनुमान एल्गोरिथ्म का उपयोग कर.
  2. चरण 2.13 में जनरेट किया गया डेटा सेट खोलें. "Deconvolution विज़ार्ड" का चयन करें. "पैरामीटर विज़ार्ड" में प्रदर्शित मानों का निरीक्षण करें. इमेजिंग पैरामीटर का पता लगाया जाना चाहिए और सही ढंग से प्रदर्शित किया जाना चाहिए. "Refractive अनुक्रमणिका" के अंतर्गत, खमीर कोशिका द्रव्य का अनुमान लगाने के लिए 1.40 करने के लिए "एम्बेडिंग मेड." मान परिवर्तित करें। "कवरस्लिप" के अंतर्गत, कवरस्लिप स्थिति सेट करने के लिए "लॉन्च संपादक" और "अनुमान स्थिति" और "ठीक" का चयन करें. "सभी सत्यापित सेट करें" और "स्वीकार करें" चुनें.
  3. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए "Deconvolution विज़ार्ड" के माध्यम से आगे बढ़ें. पृष्ठभूमि अनुमान के लिए मोड के रूप में "मैन्युअल" का चयन करें। एक अनुमानित पृष्ठभूमि मान है, जो आम तौर पर 0.1 के बारे में है निर्धारित करने के लिए कच्चे डेटा फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफ़ाइल का निरीक्षण करें।
  4. deconvolution सेटअप मेनू में, 40 के एक "अधिकतम पुनरावृत्तियां" मूल्य दर्ज करें और ब्लीच सुधार बंद कर देते हैं. अनुमानित SNR मान दर्ज करें, जो आमतौर पर लगभग 5.0 होता है. "Deconvolve" क्लिक करें.
  5. यदि आवश्यक हो, मूल डेटा फ़ाइल पर लौटने, पृष्ठभूमि और SNR मूल्यों को समायोजित, और deconvolution दोहराने, जब तक शोर पर्याप्त मंद संरचनाओं से वास्तविक फ्लोरोसेंट को नष्ट करने के बिना हटा दिया जाता है.
  6. ब्राइटफील्ड और deconvolved फ्लोरोसेंट चैनलों विलय। ImageJ में बाद में फिल्म संपादन कदम के लिए, इस तरह के चैनलों की व्यवस्था है कि लाल पहले है, हरे (यदि वर्तमान) अगले है, नीले (यदि वर्तमान) अगले है, और brightfield पिछले है. छवि अनुक्रम एक 8-बिट TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें।

4. ब्लीच सुधार और मूवी पीढ़ी

  1. deconvolved छवि अनुक्रम ImageJ में आयात करें और इसे छवि का चयन करके हाइपरस्टैक में परिवर्तित करें। ड्रॉप-डाउन मेनू से "xyzct" का चयन करें, और चैनलों की संख्या में भरें, जेड-स्टैक स्लाइस, और समय फ्रेम (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. छवि का चयन करें और रंग gt; स्प्लिट चैनल।
  3. http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector से उपलब्ध ImageJ प्लगइन का उपयोग कर photobleaching के लिए फ्लोरोसेंट चैनलों को सही. एक बार जब कि प्लगइन डाउनलोड और स्थापित किया गया है, Plugins का चयन करें और EMBLtools और ब्लीच सुधार. "एक्सपोनेंशियल फ़िट" का चयन करें.
  4. एक hyperstack में brightfield और ब्लीच सही फ्लोरोसेंट चैनल ों विलय करने के लिए, छवि का चयन करें और रंग और मर्ज चैनल. परिणामी हाइपरस्टैक को 8-बिट TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  5. इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान की कस्टम ImageJ plugins स्थापित करें. छवि अनुक्रम को देखने, संपादित करने, और मात्रा निर्धारित करने के लिए, और अनुमानित $-स्टैक की अंतिम फिल्म बनाने के लिए, साथ दस्तावेज़ में दिए गए निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

यहाँ दिए गए उदाहरण दस्तावेजों और दो खमीर Golgi cisterae की परिपक्वता के रूप में दोहरी रंग 4D confocal माइक्रोस्कोपी3द्वारा कल्पना की मात्रा निर्धारित करता है. एक खमीर सेल 10-15 Golgi cisterae के आदेश पर शामिल है, जिनमें से प्रत्येक लगभग 2-4 मिनट के एक समय पाठ्यक्रम पर परिपक्व. परिपक्वता GFP के साथ जल्दी Golgi मार्कर Vrg4 टैगिंग द्वारा और एक लाल फ्लोरोसेंट के साथ देर Golgi मार्कर Sec7 टैगिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है एम चेरी या mScarlet के रूप में प्रोटीन. एक व्यक्ति cisterna Vrg4 मार्कर के साथ शुरू में लेबल, तो एक संक्षिप्त संक्रमण जिसमें मार्करों विमर्श कर रहे हैं से होकर गुजरती है, और फिर Sec7 मार्कर के साथ लेबल.

क्योंकि सेल में कई गोलगी सिस्टरनेस होते हैं जो काफी मोबाइल होते हैं, इसलिए पूरे लेबलिंग अवधि में एक व्यक्ति के सिस्टेरा का पालन करना चुनौतीपूर्ण है। Cisternae अक्सर भी एक साथ बंद कर रहे हैं स्पष्ट रूप से छवि डेटा के लौकिक और स्थानिक सीमाओं को देखते हुए हल किया जा करने के लिए. इसके अलावा, गोलगी कुंड कभी-कभी14फ्यूज हो जाते हैं और देर से गोलगी कुंड ध्रुवीकृत विकासकेस्थलों पर 15 समूह बनाते हैं . एक परिणाम के रूप में, एक 4D फिल्म शायद ही कभी मज़बूती से ट्रैक किया जा सकता है कि एक या दो से अधिक cisternae पैदावार. विधि में सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक के लिए जेड-स्टैक अनुमानों की प्रारंभिक फिल्म की जांच और cisternae है कि विश्लेषण के लिए उम्मीदवारों का वादा कर रहे हैं की पहचान है.

आंकड़े प्रक्रिया में अनुक्रमिक चरणों को दर्शाती हैं:

चित्रा 1 या तो कच्चे डेटा या deconvolved और ब्लीच-सही डेटा के जेड-स्टैक अनुमानों की फिल्मों से फ्रेम से पता चलता है। चित्र 1 एक कच्चे बनाम deconvolved डेटा के लिए पहले फ्रेम की तुलना करता है. चित्र 1 बी एक ही deconvolved फिल्म से है, और कई फ्रेम जिसमें दो cisternae कि हरी Vrg4 मार्कर के साथ पहले लेबल का विश्लेषण किया गया और बाद में लाल Sec7 मार्कर के साथ दिखाता है. उन cisternae चुना गया है क्योंकि वे स्पष्ट रूप से फिल्म के अधिकांश के लिए अन्य लेबल संरचनाओं से अलग कर रहे हैं. इस आंकड़े में छवियों या तो कच्चे या deconvolved और ब्लीच से उत्पन्न किए गए थे सही 4D झगड़ा hyperstacks का उपयोग कर "असेंबल श्रृंखला बनाओ", "एंटीज सीरीज हाइपरस्टैक करने के लिए", और "परियोजना Hyperstack" plugins.

चित्र 2 असेंबल का हिस्सा है कि समय अंक में से एक पर एक $-स्टैक के लिए बनाया गया था से पता चलता है, दोनों से पहले और संपादन के बाद चुना cisternae में से एक से संकेत को अलग करने के लिए. इस आंकड़े में छवियों deconvolved और ब्लीच सही 4D झगड़ा hyperstack से उत्पन्न किए गए थे "असेंबल श्रृंखला बनाओ" और "संपादन असेंबल श्रृंखला" plugins का उपयोग कर.

चित्र 3 में प्रक्षेपित -स्टैक (वीडियो 1) की अंतिम फिल्म से कई फ़्रेम्स दिखाई देती हैं, जिनमें शीर्ष पर मूल अनुमान और नीचे संपादित अनुमान होते हैं. इस आंकड़ा में छवियों को मूल और संपादित montages से उत्पन्न किए गए थे "मम्से श्रृंखला Hyperstacks के लिए", "मर्ज Hyperstacks", और "परियोजना Hyperstacks" plugins.

चित्र ााालक कक षष इस आंकड़े के लिए डेटा संपादित hyperstacks से उत्पन्न किए गए थे "विश्लेषण संपादित मूवी" प्लगइन का उपयोग कर.

इन Golgi cisternae के विश्लेषण से पता चला कि Vrg4 मार्कर आता है और के बारे में 80 s के लिए बनी रहती है, और फिर Sec7 मार्कर आता है और के बारे में 60 s के लिए बनी रहती है, दो मार्करों के बीच ओवरलैप की एक संक्षिप्त अवधि के साथ. जैसा कि इस उदाहरण द्वारा सचित्र, 4D इमेजिंग एक खमीर डिब्बे की गतिशीलता के बारे में दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है.

Figure 1
चित्र 1 : एक 4D फिल्म से जेड-स्टैक के अनुमान. (ए) कच्चे डेटा (बाएं) के अनुमान और एक 4D फिल्म में पहली जेड-स्टैक से deconvolved डेटा (दाएं)। हरी संकेत GFP-Vrg4 से है, लाल संकेत Sec7-mScarlet से है, और ग्रे संकेत खमीर कोशिकाओं के brightfield छवियों है. स्केल बार ] 2 m. (B) प्रतिनिधि फ्रेम प्रारंभिक फिल्म में दिखाया गया से (A) deconvolved और अनुमानित $-स्टैक. समय अंक संकेत दिए गए हैं। तीर विश्लेषण के लिए चुने गए दो कुंडों को चिह्नित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : 01:20 समय बिंदु के लिए इसी जेड-स्टैक से असेंबल का एक हिस्सा। असेंबल में प्रत्येक छवि एक ऑप्टिकल अनुभाग है। शीर्ष पैनल मूल असेंबल का हिस्सा दिखाने के लिए, और नीचे पैनल संपादित असेंबल के इसी भाग को दिखाने के जिसमें चुना कुंडाना से फ्लोरोसेंट संकेतों को चुनिंदा बनाए रखा गया था। प्रत्येक पैनल में, ऑप्टिकल वर्गों पहली पंक्ति में छोड़ दिया से सही करने के लिए और फिर दूसरी पंक्ति में बाएं से दाएं आदेश दिया जाता है। स्केल बार ] 2 m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : अनुमानित stacks की अंतिम फिल्म से फ्रेम्स. वीडियो 1 से इन अंश में, मूल छवियों संपादित छवियों के ऊपर दिखाए जाते हैं. पहले पांच फ्रेम एक कुंड दिखाते हैं जो हरे-से-लाल संक्रमण से गुजरता है, और अगले पांच फ्रेम एक दूसरे कुंड को दिखाते हैं जो इसी तरह के संक्रमण से गुजरता है। मूल छवियों पर मढ़ा तीर cisternae कि ट्रैक किए गए संकेत मिलता है. स्केल बार ] 2 m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : वीडियो 1 से फ्लोरोसेंट संकेतों की मात्रा. रेखांकन GFP-Vrg4 और Sec7-mScarlet विश्लेषण के लिए चुना दो cisternae से संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां शीर्ष पैनल cisterna कि फिल्म की शुरुआत में दिखाई हो जाता है और नीचे पैनल का प्रतिनिधित्व करता है cisterna कि दिखाई हो जाता है का प्रतिनिधित्व करता है बाद में फिल्म में. समय शून्य GFP-Vrg4 फ्लोरोसेंट पहले पता चला था पहले से पहले फ्रेम के रूप में प्रत्येक कुंडाना के लिए परिभाषित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video 1
वीडियो 1: अनुमानित जेड-स्टैक की अंतिम फिल्म। ऊपरी पैनल मूल अनुमानों से पता चलता है, और निचले पैनल संपादित अनुमानों जिसमें केवल दो cisternae विश्लेषण के लिए चुना दिखाई दे रहे हैं दिखाता है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

खमीर organelles के 4D confocal इमेजिंग कई मापदंडों के सावधान ट्यूनिंग की आवश्यकता है। प्रमुख चिंता photobleaching और phototoxicity है. एक ठेठ 4D फिल्म ऑप्टिकल वर्गों के हजारों इकट्ठा शामिल है, तो लेजर रोशनी के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए. Tandem फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि के बिना संकेत को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता16,17. स्कैन की गति को अधिकतम करने से फोटोडैमेज को सीमित करने में मदद मिलती है, और यह भी उपयुक्त कम अंतराल पर कब्जा कर लिया जा करने के लिए $-स्टैक की अनुमति देता है। Voxel आकार है कि दोनों XY और $ में NyQuist सीमा पर हैं प्रकाश जोखिम को कम करते हुए सैद्धांतिक रूप से जानकारी है कि ऑप्टिकल सेटअप18से उपलब्ध है ठीक . अंत में, एक ऑप्टिकल अनुभाग के एक संकेत युक्त क्षेत्र में प्रत्येक voxel आम तौर पर केवल 1-3 फोटॉनों प्राप्त होगा. जानकारी की यह राशि अभी तक क्या सामान्य रूप से एक एकल के साथ इष्टतम इमेजिंग के लिए सिफारिश की है नीचे है -stack, या deconvolution के लिए. लेकिन deconvolution अभी भी शोर संकेतों smoothing द्वारा मदद करता है, और इस तरह के डेटा सेट का विश्लेषण किया जा सकता है और मात्रा निर्धारित.

यहां तक कि एक उच्च गुणवत्ता 4D डेटासेट के साथ, लेबल organelles की ट्रैकिंग एक जटिल काम है. ImageJ plugins यहाँ प्रदान के साथ, एक शोधकर्ता कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रत्येक $-स्टैक सरणी कर सकते हैं और आसानी से समय अंक के बीच और मूल और संपादित डेटा के बीच आगे और पीछे स्थानांतरित कर सकते हैं. उन उपकरणों लेबल संरचनाओं उचित विश्वास के साथ समय और स्थान के माध्यम से ट्रैक किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, व्यक्तिपरक निर्णय एक आवश्यक भूमिका निभाता है, और पूर्वाग्रह से बचा जाना चाहिए जब भी संभव हो. कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर संभावित मदद कर सकता है, लेकिन अभी तक घटना है कि अध्ययन किया जा रहा है के अधिकांश के लिए पर्याप्त परिष्कृत नहीं है. इस सीमा को ऑफसेट करने के लिए, एकाधिक मार्करों की जांच करना और विभिन्न तरीकोंसे3,6,7में मॉडलों की भविष्यवाणियों का परीक्षण करना सबसे अच्छा है।

4D confocal इमेजिंग खमीर सचिव और endocytic रास्ते की विशेषता में एक निर्णायक भूमिका निभाई है. इस विधि से पता चला है किईआर निकास स्थल ों का निर्माण डी नोवो बनाते हैं और अनिश्चित काल तक बने रहते हैं , इस बात की पुष्टि करते हैं कि गोलगी सिस्टरने3,5, और गोलगी परिपक्वता7में COPI vesicle कोट की भूमिका को स्पष्ट किया, 19. हाल ही में, 4D इमेजिंग सबूत है कि खमीर जल्दी endosome देर Golgi के समान है प्रदान की है, और यह कि खमीर देर endosome एक लंबे समय तक रहने वाले डिब्बे6है. जबकि फ्लोरोसेंट टैग डिब्बों की स्थिर इमेजिंग मूल्यवान होना जारी है, 4D इमेजिंग खमीर organelles के ऑपरेटिंग सिद्धांतों में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

फ्लोरोसेंट टैगिंग20के लिए स्व-लेबलिंग प्रोटीन की उपलब्धता में एक रोमांचक हाल के विकास | SNAP-टैग खमीर में एक संलयन साथी के रूप में खराब व्यवहार करता है, लेकिन हेलोटैग अच्छी तरह से व्यवहार करता है। उज्ज्वल और photostable झिल्ली-परमेण्ट हेलोटैग substrates21 यह दूर लाल रंगों के साथ 4D confocal इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए संभव बना दिया है6. पहले से इस्तेमाल किया हरे और लाल इमेजिंग चैनलों के लिए एक दूर लाल इमेजिंग चैनल के अलावा मजबूत तीन रंग 4D माइक्रोस्कोपी23की अनुमति देता है, जिससे घटना है कि लाइव सेल इमेजिंग द्वारा खमीर में अध्ययन किया जा सकता है की सीमा का विस्तार.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम NIH अनुदान R01 GM104010 द्वारा समर्थित किया गया था. एकीकृत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा है, जो NIH वित्त पोषित कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30 CA014599 द्वारा समर्थित है पर Vytas Bindokas और क्रिस्टीन Labno को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 MatTek P35G-0.170-14-C Imaging dishes
Concanavalin A powder Sigma-Aldrich C2010
Trolox Vector Laboratories CB-1000
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite X  Leica Microsystems Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04 Scientific Volume Imaging Deconvolution software
ImageJ NIH Image processing and analysis software

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References

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जीव विज्ञान अंक 146 Confocal माइक्रोस्कोपी 4 D इमेजिंग फ्लोरोसेंट photobleaching deconvolution ImageJ खमीर
खमीर की 4D माइक्रोस्कोपी
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Johnson, N., Glick, B. S. 4D… More

Johnson, N., Glick, B. S. 4D Microscopy of Yeast. J. Vis. Exp. (146), e58618, doi:10.3791/58618 (2019).

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