Summary
このプロトコルは、多色4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いた発芽酵母における蛍光標識細胞内コンパートメントの分析について説明する。イメージ投射パラメータは、光の損傷を制限しながら、適切な信号をキャプチャするために選択されます。カスタム ImageJ プラグインを使用すると、ラベル付き構造体を追跡し、定量的に分析できます。
Abstract
このプロトコルの目的は、発芽酵母の生細胞における膜コンパートメントの形成と形質転換を特徴付けることを特徴付ける。酵母の多くの細胞内コンパートメントは動的であり、その特性を完全に理解するには、タイムラプスイメージングが必要です。マルチカラー4D共焦点蛍光顕微鏡は、5-15分の時間スケールで細胞内コンパートメントの挙動と組成を追跡するための強力な方法です。セクション。この目的を達成するために、光漂白と光毒性は非常に低いレーザーパワーで急速にスキャンすることによって最小化され、ピクセルの次元およびZステップ間隔はフル解像度でイメージをサンプリングすることと互換性がある最も大きい値に設定される。結果として得られる 4D データ セットはノイズが多いですが、デコンボリューションによってスムージングできます。質の高いデータであっても、細胞内構造は多く、異種的で、移動性が高いため、分析段階は困難です。このニーズを満たすために、カスタムImageJプラグインは、コンピュータ画面上のアレイ4Dデータに書き込まれ、対象の構造を特定し、個々の構造を分離するためにデータを編集し、蛍光時間コースを定量化し、投影されたZスタックのムービーを作りました。4D ムービーは、成熟によってひっくり返る一時的なコンパートメントと安定したコンパートメントを区別する場合に特に便利です。このようなムービーは、コンパートメント融合などのイベントを特徴付けたり、特定の突然変異やその他の摂動の影響をテストするためにも使用できます。
Introduction
エンドメンブレンシステムのコンパートメントは一定のフラックスにあり、その完全な特性は生細胞イメージングを必要とします。ここでは、4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いて、発芽酵母の蛍光標識されたコンパートメントを可視化するプロトコルを説明します。この方法は、ピチア・パスマティスとサッカロマイセス・セレビシエ1、2、3の分泌コンパートメントのダイナミクスを追跡するために開発された。このプロトコルは、個々のシスターナが光学的に溶解可能である非積層ゴルジを有するS.セレビシアeに焦点を当てています。S.セレビシエの珍しいゴルジ組織は、ゴルジ・シスターナが最初に常駐初期ゴルジタンパク質とラベルを付け、その後、常駐後期ゴルジタンパク質を獲得しながら、それらのタンパク質を失う4D顕微鏡によるデモンストレーションを可能にしました3 、5.この遷移は、初期のゴルジタンパク質Vrg4がGFPで標識され、後期ゴルジタンパク質Sec7が単光赤色蛍光タンパク質で標識される歪みを作り出すことによって可視化することができる。個々のシスターナを追跡すると、成熟は緑から赤への変換3として観察される。このタイプの分析は、タンパク質の局在化とコンパートメントの同一性に関する貴重な情報を提供できます。たとえば、到着時刻と出発時刻をわずかにオフセットした 2 つのタンパク質は、静止画像で異なるコンパートメントにラベルを付ける場合がありますが、4D ムービーでは、異なる時点 6、 7 で同じコンパートメントにラベルを付けることができます。.したがって、4D顕微鏡検査は、そうでなければ明らかではない現象を明らかにする。
酵母コンパートメントの有益な4D顕微鏡検査は、適切な手順と機器2で達成することができます。可能な限り、蛍光タンパク質タグは、過剰発現アーティファクトを回避するために遺伝子置換8によって行われる。細胞内構造は非常に動的であることが多いため、時間の経過と同時に構造を確実に追跡するためには、4Dイメージングが必要です。ここで説明するプロトコルは、高感度検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を採用しています。この装置によって、S.cerevisiaeの全細胞容積は、2つのs間隔が典型的である、ほぼ1〜3秒ごとに共焦点顕微鏡によってイメージ化することができる。データは、蛍光体の標識密度とその光物理学的特性に応じて、最大5〜15分間収集することができます。主なハードルは、光漂白を最小限に抑えることです。この目的のために、レーザー強度を可能な限り低く保ち、共焦点スキャン速度を最大化し、光学パラメータは、過度の光暴露を避けながら関連情報をキャプチャするためにナイキスト限界で画像するように構成されています。これらの設定はまた、光毒性を緩和することが期待され、生細胞イメージング9、10、11の間にしばしば見落とされる要因である。得られた騒々しいデータは、蛍光強度の定量を容易にするために漂白剤補正および破壊アルゴリズムで処理されます。
高品質の 4D ムービーでも、酵母コンパートメントは多数、異機種混在、およびモバイルである傾向があるため、分析は難しくなります。共焦点顕微鏡検査の本質的な制限と、長時間の4Dイメージングに必要な非最適な設定のために、互いに近い蛍光構造を解決することは困難です。この問題は、標識期間中に光学的に溶解可能な少数の蛍光構造に焦点を当てることで回避できる。コンパートメント。確実に追跡できる蛍光コンパートメントは、投影されたZスタックのムービーを見て、各時間ポイントの光学セクションがコンピュータ画面上に配列される一連のモンタージュを作成することによって識別されます。この分析では、カスタム ImageJ12プラグインを使用して、個々の構造を単独で追跡できます。
最近の方法論文は、酵母13における蛍光タンパク質の使用ならびに酵母細胞2の4D共焦点イメージングの理論および実践をカバーした。このプロトコルは、4Dイメージング実験の主要な実用的な側面に焦点を当てています。これには、前述のプロシージャに対するいくつかの機能強化と、ImageJ プラグイン コードとドキュメントの更新されたバージョンが含まれています。示されている例はゴルジダイナミクスに焦点を当てていますが、このプロトコルは他の酵母コンパートメントのイメージングにも同様に適しています。
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Protocol
1. 準備
- 非蛍光最小NSD培地2を作る。リボフラビンの不在は、バックグラウンド細胞内緑色蛍光および関連する光毒性を減少させるものと予想される。
- 酵母株を~23°Cで一晩成長させ、良好な通気性を持つ50mLのバッフルフラスコで5mL NSDで対数相にする。分析の約3〜4時間前に、最終的なOD600がイメージング時に0.5〜0.8となるように、新鮮なNSDで酵母培養を希釈する。
- コンカバリンA(ConA)の2mg/mL溶液を調調す。必要に応じて、液体窒素でこの溶液のアリコートを凍結し、-80 °Cで保存します。
- ConA溶液をマイクロ遠心分離機で5分間全速力で回し、イメージングを妨げる可能性のある粒子状物質を除去します。その後、きれいな35ミリメートルカバーグラス底部顕微鏡皿に上清の250 μLを追加します。15分後、dH2 Oの2mLで2〜3回洗浄し、乾燥させます。
- ConAコーティングされた皿に酵母培養物の250 μLを追加し、細胞が付着できるように10分待ち、2mL NSDで2〜3回静かに洗浄します。細胞を2 mLの新鮮なNSDで覆います。
2. イメージング
- 63xまたは100xオイル浸漬レンズを使用してください。1.40の数値絞り(NA)で十分ですが、より高いNAレンズも使用できます。
- フレーム サイズを 256 x 128 (幅 x 高さ) にフォーマットします。フレームサイズを大きくする必要がある場合、共焦点顕微鏡に共振スキャナーが装備されている限り、幅を大きくしてもスキャン速度は低下しません。
- ズーム係数を調整して、ピクセルサイズを~80 nmにします。
- 最大スキャン速度(通常は8 kHz)を使用します。双方向Xスキャンが使用可能な場合はオンにし、制御実験で2方向からのスキャンがレジスタに登録されていることを確認する場合。
- ラインの累積を 4 または 6 に設定します。平均化の代わりに累積 (合計) を使用してください。
- ピンホールを 1.2 エアリー ユニットに設定します。経験的に、生きた酵母細胞をイメージングする場合、この設定は1.0 Airyユニットの標準的な選択よりも多くの光子を捕捉し、解像度の顕著な損失を引き起こしません。
- 各蛍光チャネルについて、励起波長を設定し、高感度検出器を割り当て、発光波長範囲を設定し、可能な場合はフォトン計数モードをオンにする。波長の選択は、蛍風素に依存します。一例として、485nmでGFP蛍光を励起し、495〜550nmから集め、555nmでmScarlet蛍光を励起し、562〜625nmから集める。
- 各レーザーの強度をできるだけ低く設定します。この設定は経験的に決定する必要があります。適切な強度は、5分のムービーの終わりまでに蛍光シグナル漂白を50%以下で、騒々しいが解釈可能な画像配列を捕捉します。ここで使用される共焦点顕微鏡(材料の表を参照)では、この強度は5%の順序でレーザーパワー設定に対応しています。
- カバースリップから反射光を取り込まないように、ノッチフィルタまたはタイムゲーティングを使用します。タイム ゲーティングが使用可能な場合は、ゲーティング ウィンドウを 0.6 ~ 10.0 ns に設定します。
- ブライトフィールドイメージングをオンにし、データ収集に低感度検出器を使用します。ゲインをセルをはっきりと見えるレベルに設定します。プリズムは信頼性の高い蛍光データの捕捉を妨げるため、差動干渉コントラスト(DIC)を使用しないでください。
- Zステップ間隔を0.25~0.35μmに設定し、Zスタックあたり約20~25の光学切片を収集して酵母細胞全体の体積を画像化します。「下」がカバースリップに向かって移動するようなイメージングの方向性を指定します。
- 一般的なムービーの場合は、Z スタック間の時間間隔を 2 秒に設定し、ムービーの再生時間を 5 ~ 10 分に設定します。比較的遅いダイナミクス。
- 最後のチャンネルの明るいフィールド画像を含むLIFファイルとしてムービーを保存します。この段階では、より高いビット深度は不要であり、処理パイプラインは 8 ビット TIFF データを受け入れるように構成されています。
3. デコンボリューション
- 従来の最大尤度推定アルゴリズムを使用して、逆畳み込みソフトウェアを起動します(「材料の表」を参照)。
- ステップ 2.13 で生成されたデータ・セットを開きます。「デコンボリューション ウィザード」を選択します。「パラメータ ウィザード」に表示される値を調べます。イメージング パラメータを検出し、正しく表示する必要があります。「屈折率」の下で、酵母細胞質を近似するために「埋め込みメッド」の値を1.40に変更します。[カバースリップ] で「起動エディタ」と「推定位置」と「OK」を選択し、カバースリップ位置を設定します。[すべての検証済み設定] と [同意] を選択します。
- 各蛍光チャネルの「デコンボリューションウィザード」に進みます。背景推定モードとして「手動」を選択します。生データ蛍光強度プロファイルを調べて、推定背景値(通常は約0.1)を決定します。
- 逆畳み込み設定メニューに「最大反復」値40を入力し、漂白剤補正をオフにします。推定 SNR 値 (通常は約 5.0) を入力します。「デコンボルブ」をクリックします。
- 必要に応じて、元のデータファイルに戻り、背景とSNR値を調整し、薄暗い構造から本物の蛍光を除去することなくノイズが十分に除去されるまで、逆畳み込みを繰り返します。
- ブライトフィールドとデコンボルブ蛍光チャンネルをマージします。ImageJ の後続のムービー編集手順では、赤が最初、緑(存在する場合)が次に、青 (存在する場合) が次に、明るいフィールドが最後になるようなチャンネルを配置します。イメージ シーケンスを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。
4. 漂白剤補正とムービー生成
- デコンボルブされたイメージ シーケンスを ImageJ に読み込み、[イメージ > ハイパースタック > スタック] を選択してハイパースタックに変換します。ドロップダウンメニューから「xyzct」を選択し、チャンネル数、Zスタックスライス、タイムフレーム(http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector)を入力します。
- [イメージ > カラー > チャンネルを分割] を選択します。
- http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_correctorから入手可能なImageJプラグインを使用して、光漂白のための蛍光チャネルを修正します。そのプラグインがダウンロードされ、インストールされたら、プラグイン > EMBLtools > 漂白剤補正を選択します。[指数フィット] を選択します。
- ブライトフィールドと漂白剤補正蛍光チャンネルをハイパースタックにマージするには、[イメージ > カラー > マージ チャネル] を選択します。結果のハイパースタックを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。
- このプロトコルで提供されるカスタム ImageJ プラグインをインストールします。付属のドキュメントの指示に従って、イメージ シーケンスを表示、編集、および定量化し、投影された Z スタックの最終的なムービーを作成します。
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Representative Results
ここで与えられた例は、デュアルカラー4D共焦点顕微鏡3によって可視化された2つの酵母ゴルジ・シスターナの成熟を定量化する。酵母細胞には10-15ゴルジ・シスターナエの順序で含まれており、それぞれが約2-4分の時間の経過とともに成熟し、初期のゴルジマーカーVrg4をGFPでタグ付けし、後期ゴルジマーカーSec7を赤色蛍光でタグ付けすることで可視化することができます。mCherryやmScarletなどのタンパク質。個々のcisternaラベルは、最初にVrg4マーカーでラベルを付け、次にマーカーが交換される短い遷移を経て、Sec7マーカーでラベルを付けます。
細胞は非常に移動性である複数のゴルジ・シスターナを含んでいるので、ラベリング期間全体を通して個々のシスターナに従うことを困難です。シスターナエは、多くの場合、画像データの時間的および空間的な制限を考えると、明確に解決するには近すぎます。また、ゴルジ・シスターナエは時折14を融合し、後期ゴルジ・シスターナは偏光成長15の部位に集積する傾向がある。その結果、4D ムービーでは、確実に追跡できる 1 つまたは 2 つ以上のシスターナが得られることはほとんどありません。この方法の最も困難なステップの1つは、Zスタック投影の初期ムービーを調べ、分析の有望な候補であるcisternaeを特定することです。
図は、手順の順次ステップを示しています。
図 1は、生データまたはデコンボルブおよび漂白剤補正データの Z スタック投影のムービーのフレームを示しています。図 1Aは、未加工データとデコンボルブ データの最初のフレームを比較します。図 1Bは同じデコンボルブされたムービーからのもので、緑色のVrg4マーカーで最初にラベルを分析した2つのシスターナエが赤いSec7マーカーで後に表示されるいくつかのフレームを示しています。これらのシスターナは、映画のほとんどのために明らかに他のラベル付き構造から分離されているので、選択されました。この図の画像は、「Make Montage シリーズ」、「モンタージュ シリーズ から ハイパースタックへのモンタージュ シリーズ」、「プロジェクト ハイパースタック」プラグインを使用して、生またはデコンボルブおよび漂白剤補正された 4D TIFF ハイパースタックから生成されました。
図 2は、選択した cisternae のいずれかから信号を分離するために、編集前と編集後の両方の時点で Z スタック用に作成されたモンタージュの一部を示しています。この図の画像は、「Make Montage シリーズ」および「モンタージュ シリーズの編集」プラグインを使用して、デコンボルブおよび漂白剤補正された 4D TIFF ハイパースタックから生成されました。
図 3は、投影された Z スタック (ビデオ 1) の最終ムービーのフレーム数を示し、元の投影法を上部に、編集した投影を下部に表示します。この図の画像は、「モンタージュシリーズからハイパースタック」、「ハイパースタックのマージ」、「プロジェクトハイパースタック」プラグインを使用して、元のモンタージュと編集されたモンタージュから生成されました。
図4は、選択したシスターナからの緑色および赤色蛍光シグナルの定量化を示す。この図のデータは、"編集されたムービーの分析" プラグインを使用して編集されたハイパースタックから生成されました。
これらのゴルジ・シスターナエの分析により、Vrg4マーカーが到着し、約80秒持続し、Sec7マーカーが到着し、約60秒持続し、2つのマーカー間に短いオーバーラップが生えます。この例で示すように、4Dイメージングは酵母コンパートメントのダイナミクスに関する定性的および定量的情報の両方を提供します。
図 1: 4D ムービーからの Z スタックの投影。(A) 4D ムービーの最初の Z スタックからの生データ(左)とデコンボルブデータ(右)のプロジェクション。緑色の信号はGFP-Vrg4、赤色信号はSec7-mScarletから、灰色の信号は酵母細胞の明視野画像です。スケールバー = 2 μm(B)デコンボルブおよび投影された Z スタックの (A) に示す最初のムービーの代表フレーム。時間ポイントが示されます。矢印は、解析のために選択された 2 つのシスターナをマークします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 01:20 の時点に対応する Z スタックからのモンタージュの一部。モンタージュ内の各画像は光学セクションです。上のパネルは元のモンタージュの一部を示し、下のパネルは、選択したシスターナからの蛍光信号が選択的に保持された編集されたモンタージュの対応する部分を示しています。各パネルでは、光学セクションは最初の行で左から右に並べられ、次に 2 行目で左から右に並べ替えられます。スケールバー = 2 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 投影された Zstacks の最後のムービーからのフレーム。ビデオ1からのこれらの抜粋では、元の画像は編集された画像の上に表示されます。最初の 5 つのフレームは、緑から赤への遷移を受ける 1 つのシスターナを示し、次の 5 つのフレームは同様の遷移を受ける 2 番目のシスターナを示します。元の画像に重ね合わされた矢印は、追跡されたシスターナを示します。スケールバー = 2 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: ビデオ1からの蛍光シグナルの定量。グラフは、分析のために選択された2つのシスターナからのGFP-Vrg4およびSec7-mScarlet信号を表し、トップパネルは映画の冒頭に表示されるシスターナを表し、下のパネルは表示されるシスターナを表します。映画の後半で。時間ゼロは、GFP-Vrg4蛍光が最初に検出される直前のフレームとして、各シスターナに対して定義されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:投影されたZスタックの最終ムービー。上のパネルは元の投影を示し、下のパネルは、分析のために選択された2つのcisternaeだけが表示される編集された投影を示しています。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
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Discussion
酵母オルガネラの4D共焦点イメージングは、複数のパラメータの慎重なチューニングを必要とします。主な懸念は、光漂白と光毒性です。一般的な 4D ムービーでは、何千もの光学セクションを収集する必要があるため、レーザー照明はできるだけ低く抑える必要があります。タンパク質蛍光タンパク質タグは、タグ付けされたタンパク質16、17の発現を増加させることなくシグナルを増強するために使用することができる。スキャン速度を最大化すると、写真のダメージを抑え、Zスタックを適切に短い間隔でキャプチャできます。XYとZの両方でナイキスト限界にあるボクセルサイズは、理論的には光学セットアップ18から入手可能な情報を回復しながら、光の露出を最小限に抑えます。最終的には、光部の信号含有領域の各ボクセルは、通常、1~3個のフォトンのみを受け取ります。この情報量は、単一の Z スタックで最適なイメージングを行う場合、またはデコンボリューションに対して通常推奨される情報量をはるかに下回っています。しかし、デコンボリューションはノイズの多い信号を平滑化することで依然として役立ち、そのようなデータセットを分析および定量化することができます。
高品質の4Dデータセットであっても、ラベル付き小器官の追跡は複雑な作業です。ここで提供される ImageJ プラグインを使用すると、研究者はコンピュータ画面上の各 Z スタックを配列し、タイム ポイント間と元のデータと編集されたデータの間を簡単に移動できます。これらのツールを使用すると、ラベル付き構造体を時間と空間を通じて合理的な自信を持って追跡できます。しかし、主観的な判断は必要な部分を果たし、バイアスは可能な限り避けなければなりません。パーティクルトラッキングソフトウェアは、潜在的に役立つ可能性がありますが、研究されている現象のほとんどのためにまだ十分に洗練されていません。この制限を相殺するには、複数のマーカーを調べ、異なる方法でモデルの予測をテスト 3,6,7.
4D共焦点イメージングは、酵母分泌経路およびエンドサイトー経路を特徴付ける上で重要な役割を果たしてきた。この方法は、ER出口部位がデノボを形成し、無期限に持続することを実証し、ゴルジ・シスターナエが成熟3、5を確認し、ゴルジ成熟7におけるCOPIベシクルコートの役割を明らかにした。 19.さらに最近では、4Dイメージングは、酵母初期エンドソームが後期ゴルジと同一であり、酵母後期エンドソームが長生きするコンパートメント6であることを証明した。蛍光タグ付きコンパートメントの静的イメージングは引き続き価値がありますが、4Dイメージングは酵母オルガネラの動作原理に関するユニークな洞察を提供します。
蛍光タグ付け20のための自己標識タンパク質の利用可能性におけるエキサイティングな最近の開発.SNAPタグは酵母の融合パートナーとしてあまり振る舞いが悪いが、HaloTagはよく振る舞う。明るく、フォトテーブルの膜パーエンダクションハロタグ基板21は、遠赤色染料6で4D共焦点イメージングを行うことを可能にした。以前に使用された緑と赤のイメージングチャネルに遠赤のイメージングチャネルを加えることで、堅牢な3色4D顕微鏡検査23が可能となり、生細胞イメージングにより酵母で研究できる現象の範囲が広がります。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この作業は、NIH助成金R01 GM104010によってサポートされました。NIHが出資するがんセンターサポートグラントP30 CA014599が支援する統合顕微鏡コア施設で、Vytas Bindokasとクリスティン・ラボノへの蛍光顕微鏡検査の支援をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
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