Summary
Detta protokoll beskriver analysen av fluorescerande märkta intracellulära fack i spirande jäst med flera färger 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi. Avbildnings parametrarna väljs för att fånga upp lämpliga signaler samtidigt som foto skador begränsas. Custom ImageJ plugins tillåta märkta strukturer spåras och kvantitativt analyseras.
Abstract
Målet med detta protokoll är att karakterisera hur membran avdelningar bildas och förvandlas i levande celler av spirande jäst. Många intracellulära fack i jäst är dynamiska, och en fullständig förståelse av deras egenskaper kräver tidsförlopp Imaging. Multi-Color 4D konfokal fluorescens mikroskopi är en kraftfull metod för att spåra beteendet och sammansättningen av ett intracellulärt fack på en tidsskala på 5-15 min. noggrann analys av utrymmets dynamik kräver avskiljning av tusentals optiska Sektioner. För att uppnå detta mål minimeras foto blekning och fototoxicitet genom att snabbt scanna med mycket låg lasereffekt, och pixeldimensionerna och Z-stegintervallen är inställda på de största värden som är kompatibla med sampling av bilden med full upplösning. De resulterande 4D datauppsättningarna är bullriga men kan utjämnas genom deconvolution. Även med hög kvalitet data, är analysfasen utmanande eftersom intracellulära strukturer är ofta många, heterogena, och mobila. För att tillgodose detta behov, anpassade ImageJ plugins skrevs till array 4D data på en datorskärm, identifiera strukturer av intresse, redigera data för att isolera enskilda strukturer, kvantifiera fluorescens tid kurser, och göra filmer av de projicerade Z-stackar. 4D-filmer är särskilt användbara för att särskilja stabila fack från övergående kupéer som förvandlas till mognad. Sådana filmer kan också användas för att karakterisera händelser som kupé fusion, och för att testa effekterna av specifika mutationer eller andra perturbations.
Introduction
Fack i endomembrane systemet är i konstant Flux, och deras fulla karakterisering kräver levande cell avbildning. Beskrivs här är ett protokoll som sysselsätter 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi att visualisera överföras märkta fack i spirande jäst. Metoden utvecklades för att spåra dynamiken i sekretoriska fack i Pichia pastoris och Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Detta protokoll fokuserar på S. Cerevisiae, som har en nonstacked Golgi där enskilda cisternae är optiskt matchas4. Den ovanliga Golgi organisation i S. cerevisiae möjliggjort demonstration av 4D mikroskopi att en Golgi Cisterna initialt etiketter med hemvist tidigt Golgi proteiner, och sedan förlorar dessa proteiner samtidigt förvärva bosatt sent Golgi proteiner3 ,5. Denna övergång kan visualiseras genom att skapa en stam där den tidiga Golgi proteinet Vrg4 är märkt med GFP medan den sena Golgi protein Sec7 är märkt med en monomera rött fluorescerande protein. När enskilda cisternae spåras, mognad observeras som en grön-till-röd omvandling3. Denna typ av analys kan ge värdefull information om protein lokalisering och kupé identitet. Till exempel kan två proteiner med något offset ankomst-och avgångstider ibland visas för att märka olika fack i statiska bilder, men kan ses i 4D-filmer för att märka samma fack vid olika tidpunkter6,7 . Således avslöjar 4D mikroskopi fenomen som annars inte skulle vara uppenbara.
Informativ 4D mikroskopi av jäst fack kan uppnås med lämpliga förfaranden och utrustning2. När det är möjligt, fluorescerande protein märkning utförs av Gene Replacement8 för att undvika överuttryck artefakter. Eftersom intracellulära strukturer är ofta mycket dynamiska, 4D Imaging behövs för att säkerställa att en struktur spåras tillförlitligt över tiden. Det protokoll som beskrivs här sysselsätter en laserskanning konfokal Mikroskop utrustad med hög känslighet detektorer. Med denna enhet, hela cell volymen av S. cerevisiae kan avbildas av konfokal mikroskopi ungefär varje 1-3 s, med 2 S intervall är typiska. Data kan samlas in för upp till 5-15 min beroende på märkningen tätheter av fluoroforer och deras foto fysikaliska egenskaper. Det huvudsakliga hindret är att minimera photoblekning. För detta ändamål är laser intensiteterna hålls så låg som möjligt, den konfokala skanningshastigheten är maximerad, och de optiska parametrarna är konfigurerade för att bilden på Nyquist gränsen för att fånga relevant information och samtidigt undvika överdriven ljus exponering. Dessa inställningar förväntas också lindra fototoxicitet, en faktor som ofta förbises under levande cell avbildning9,10,11. Den resulterande bullriga data bearbetas med blekmedel korrigering och deconvolution algoritmer för att underlätta kvantifiering av fluorescens intensiteter.
Även med hög kvalitet 4D filmer, är analysen knepigt eftersom jästen fack tenderar att vara många, heterogena, och mobila. På grund av de inneboende begränsningarna av konfokalmikroskopi och de icke-optimala inställningar som krävs för långvarig 4D-avbildning, är fluorescerande strukturer som är nära varandra svåra att lösa. Detta problem kan kringgås genom att fokusera på det lilla antalet fluorescerande strukturer som förblir optiskt matchas under märknings perioden, med antagandet att dessa strukturer är representativa för hela populationen av märkta Fack. Fluorescerande fack som kan spåras på ett tillförlitligt sätt identifieras genom att visa filmer av projicerade Z-stackar och genom att skapa en serie montage där de optiska avsnitten för varje tidspunkt är klädd på en datorskärm. Denna analys sysselsätter anpassade ImageJ12 plugins, som tillåter en individuell struktur som ska spåras i isolering.
Nya metoder Papers omfattade användning av fluorescerande proteiner i jäst13 samt teori och praktik av 4D konfokala avbildning av jästceller2. Detta protokoll fokuserar på de viktigaste praktiska aspekterna av en 4D Imaging experiment. Den innehåller vissa förbättringar av tidigare beskrivna procedurer, samt uppdaterade versioner av ImageJ plugin-koden och dokumentation. Det exempel som visas fokuserar på Golgi dynamik, men detta protokoll är lika lämplig för avbildning andra jästfack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser
- Gör icke fluorescerande minimal NSD medium2. Avsaknaden av riboflavin förväntas minska bakgrunden intracellulär grön fluorescens och tillhörande fototoxicitet.
- Odla jäststammen över natten vid ~ 23 ° c till logaritmisk fas i 5 mL NSD i en 50 mL förbryllad kolv med god luftning. Om 3-4 h före analys, späd jästkulturen i färskt NSD så att den slutliga OD600 kommer att vara 0,5-0,8 vid tidpunkten för avbildning.
- Bered en 2 mg/mL lösning av Concanavalin A (ConA). Om så önskas, frys alikvoter av denna lösning i flytande kväve och förvara vid-80 ° c.
- Snurra ConA-lösningen i 5 minuter med full hastighet i en mikrocentrifug för att avlägsna partiklar som kan störa bilden. Tillsätt sedan 250 μL av supernatanten till en ren 35 mm täckglasbotten mikroskopi skålen. Efter 15 min, tvätta 2-3 gånger med 2 mL dH2O och låt torka.
- Tillsätt 250 μL av jästkulturen till ConA-belagda skålen, vänta 10 min så att cellerna att fästa, och tvätta försiktigt 2-3 gånger med 2 mL NSD. Täck över cellerna med 2 mL färsk NSD.
2. avbildning
- Använd en 63x eller 100x Oil Immersion lins. En numerisk bländare (NA) på 1,40 är tillräcklig, men en högre NA-objektiv kan också användas.
- Formatera bildrutestorleken till 256 x 128 (bredd x höjd). Om en större ramstorlek behövs, ökar bredden inte minska skanningshastigheten så länge det konfokala mikroskopet är utrustad med en resonant scanner.
- Justera zoomfaktorn för att göra pixelstorleken ~ 80 Nm.
- Använd den maximala skanningshastigheten, som vanligtvis är i storleksordningen 8 kHz. Aktivera dubbelriktad X skanning om den är tillgänglig, och om kontroll experiment bekräftar att skanningar från de två riktningarna är i register.
- Ställ in linjens ackumulering till 4 eller 6. Var noga med att använda ackumulering (summering) i stället för medelvärdes.
- Ställ in hål till 1,2 luftiga enheter. Empiriskt, när Imaging levande jästceller, denna inställning fångar fler fotoner än standardvalet av 1,0 luftig enhet samtidigt orsakar ingen märkbar förlust av upplösning.
- För varje fluorescenskanal ställer du in magnetiseringsvåglängden, tilldelar en detektor med hög känslighet, anger våglängdsintervallet för utsläpp och aktiverar foto räknings läget om det finns tillgängligt. Våglängden val kommer att bero på fluoroforer. Som ett exempel excitera GFP fluorescens vid 485 nm och samla in från 495-550 Nm, och excitera mScarlet fluorescens vid 555 nm och samla in från 562-625 nm.
- Ställ in intensiteten på varje laser så att den blir så låg som möjligt. Denna inställning måste bestämmas empiriskt. En lämplig intensitet kommer att resultera i avskiljning av en bullrig men tolkningsbar bildsekvens, med fluorescenssignalen blekning inte mer än 50% i slutet av en 5 min film. På det konfokalmikroskopi Mikroskop som används här (se tabell över material), motsvarar denna intensitet en lasereffekt inställning på storleksordningen 5%.
- Använd notch filter eller tid gating att undvika att fånga reflekterat ljus från täckslip. Om tiden gating är tillgänglig, Ställ in gating fönstret till 0.6-10.0 ns.
- Aktivera brightfield Imaging och Använd en detektor med låg känslighet för datainsamling. Ställ in förstärkningen på en nivå som gör cellerna tydligt synliga. Använd inte differential störnings kontrast (DIC) eftersom prismat kommer att störa avskiljning av tillförlitliga fluorescensdata.
- Ställ in Z-stegintervallet på 0,25-0,35 μm. bild hela volymen av jästceller genom att samla in cirka 20-25 optiska sektioner per Z-stack. Ange riktningen för avbildning så att "down" rör sig mot täckslip.
- För en typisk film, ange tidsintervallet mellan Z-stackar till 2 s och Ställ in filmens varaktighet till 5 till 10 min. beroende på facket under studien, minska intervallet för att göra kortare filmer av relativt snabb dynamik, eller öka intervallet för att göra längre filmer av relativt långsam dynamik.
- Spara filmen som en LIF-fil med brightfield-bilderna i den sista kanalen. Högre bitdjup är onödiga i det här skedet och bearbetningen pipeline är konfigurerad för att acceptera 8-bitars TIFF-data.
3. deconvolution
- Starta deconvolution programvaran (se tabell över material), med hjälp av den klassiska maximala sannolikheten uppskattning algoritm.
- Öppna datauppsättningen som genererats i steg 2,13. Välj "deconvolution Wizard". Inspektera de värden som visas i "parameter guiden". Avbildnings parametrarna ska upptäckas och visas korrekt. Under "brytningsindex", ändra "inbäddning med." värdet till 1,40 att approximera jästen cytoplasma. Under "täckglas", välj "Launch Editor" och "ESTIMATE position" och "OK" för att ställa in täckslip position. Välj "Ställ in alla verifierade" och "Godkänn".
- Fortsätt genom "deconvolution Wizard" för varje fluorescens-kanal. Välj "Manual" som läge för bakgrunds uppskattning. Undersök den rådata fluorescens intensitet profil för att fastställa ett uppskattat bakgrundsvärde, vilket vanligtvis handlar om 0,1.
- I inställningsmenyn för avfaltning anger du värdet "maximum iterations" på 40 och inaktiverar korrigering av blekmedel. Ange ett uppskattat SNR-värde, som vanligtvis är cirka 5,0. Klicka på "Deconvolve".
- Om det behövs återgår du till den ursprungliga datafilen, justerar bakgrunden och SNR-värden och upprepar deconvolution, tills brus är tillräckligt borttaget utan att eliminera äkta fluorescens från Dim strukturer.
- Sammanfoga brightfield-och deconvolved-fluorescenskanalerna. För efterföljande filmredigering steg i ImageJ, ordna kanalerna så att rött är först, grön (om den finns) är nästa, blå (om det finns) är nästa, och brightfield är sist. Spara bildsekvensen som en 8-bitars TIFF-fil.
4. blekmedel korrigering och Filmgenerering
- Importera deconvolved bildsekvensen till ImageJ och omvandla den till en hyperstack genom att välja bild > Hyperstackar > stack till Hyperstack. Välj "xyzct" från rullgardinsmenyn och fyll i antalet kanaler, Z-stackskivor och tidsramar (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
- Välj bild > färg > delade kanaler.
- Korrigera fluorescenskanalerna för foto blekning med hjälp av ImageJ-pluginprogrammet som finns på http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. När plugin har hämtats och installerats, Välj plugins > EMBLtools > blekmedel korrigering. Välj "exponentiell passform".
- Om du vill sammanfoga brightfield-och Bleach-korrigerade fluorescenskanalerna till en hyperstack väljer du bild > färg > sammanfoga kanaler. Spara den resulterande hyperstacken som en 8-bitars TIFF-fil.
- Installera anpassade ImageJ-insticksmoduler som medföljer detta protokoll. Följ instruktionerna i följedokumentet för att visa, redigera och kvantifiera bildsekvensen och för att producera en slutlig film av de projicerade Z-stackarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det exempel som ges här dokument och kvantifierar mogningen av två jäst Golgi cisternae som visualiseras av Dual-Color 4D konfokalmikroskopi3. En jästcell innehåller på order av 10-15 Golgi cisternae, som alla mognar under en tidsperiod på cirka 2-4 min. mognad kan visualiseras genom att tagga den tidiga Golgi markör Vrg4 med GFP och genom att tagga den sena Golgi markören Sec7 med en röd fluorescerande protein som mCherry eller mScarlet. En individ Cisterna etiketter initialt med Vrg4 markören, genomgår sedan en kort övergång där markörer utbyts, och sedan etiketter med Sec7 markören.
Eftersom cellen innehåller flera Golgi cisternae som är ganska rörlig, är det utmanande att följa en enskild Cisterna under hela märkningen perioden. Cisternae är ofta för nära tillsammans för att lösas otvetydigt med tanke på temporala och rumsliga begränsningar av bilddata. Dessutom, Golgi cisternae ibland säkring14, och sena Golgi cisternae tenderar att klustret på platser av polariserad tillväxt15. Som ett resultat, en 4D film ger sällan mer än en eller två cisternae som kan spåras tillförlitligt. En av de mest utmanande stegen i metoden är att undersöka den första filmen av Z-stacken prognoser och identifiera cisternae som är lovande kandidater för analys.
Siffrorna skildrar sekventiella steg i förfarandet:
Bild 1 visar bildrutor från filmer av Z-stack projektioner av antingen rådata eller deconvolved och blek-korrigerade data. Figur 1 A jämför de första ramarna för RAW kontra deconvolved data. Figur 1 B är från samma deconvolved film, och visar flera bildrutor där de två cisternae som analyserades etiketten först med den gröna Vrg4 markören och senare med den röda Sec7 markören. De cisternae valdes eftersom de är tydligt åtskilda från andra märkta strukturer för de flesta av filmen. Bilderna i denna siffra har genererats från antingen RAW eller deconvolved och blekmedel korrigerade 4D TIFF hyperstackar med hjälp av "gör montage serie", "montage serie till Hyperstack", och "Project Hyperstack" plugins.
Figur 2 visar en del av montage som skapades för en Z-stack på en av de tidpunkter, både före och efter redigering för att isolera signalen från en av de valda cisternae. Bilderna i denna siffra har genererats från deconvolved och blekmedel korrigerade 4D TIFF hyperstack med hjälp av "gör montage serie" och "Edit montage serie" plugins.
Figur 3 visar flera bildrutor från den slutliga filmen av de projicerade Z-stackarna (video 1), med de ursprungliga projektionerna överst och de redigerade projektionerna längst ner. Bilderna i denna siffra har genererats från den ursprungliga och redigerade montage med hjälp av "montage serie till Hyperstack", "Sammanfoga Hyperstacks", och "Project Hyperstackar" plugins.
Figur 4 visar kvantifiering av de gröna och röda fluorescenssignalerna från den valda cisternae. Uppgifterna för denna siffra har genererats från de redigerade hyperstackarna med hjälp av insticksprogrammet "Analyze redigerade film".
Analys av dessa Golgi cisternae avslöjade att Vrg4 markören anländer och kvarstår i ca 80 s, och sedan Sec7 markören anländer och kvarstår i ca 60 s, med en kort period av överlappning mellan de två markörer. Som illustreras av detta exempel, 4D Imaging ger både kvalitativ och kvantitativ information om dynamiken i ett jästfack.
Figur 1 : Projektioner av Z-stackar från en 4D-film. (A) prognoser av rådata (vänster) och deconvolved data (höger) från den första Z-stacken i en 4D-film. Den gröna signalen är från GFP-Vrg4, den röda signalen är från Sec7-mScarlet, och den grå signalen är brightfield bilder av jästceller. Skalstapel = 2 μm. (B) representativa ramar från den ursprungliga filmen som visas i (a) av de deconvolved och projicerade Z-stackarna. Tidspunkter indikeras. Pilarna markerar de två cisternae som valdes för analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : En del av montage från Z-stacken som motsvarar 01:20 tid punkt. Varje bild i montage är en optisk sektion. Den övre panelen visar en del av den ursprungliga montage, och bottenpanelen visar motsvarande del av den redigerade montage där fluorescens signaler från de valda Cisterna var selektivt kvar. I varje panel sorteras de optiska avsnitten från vänster till höger i den första raden och sedan från vänster till höger i den andra raden. Scale bar = 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Bildrutor från den slutliga filmen av de projicerade Zstacks. I dessa utdrag från video 1 visas de ursprungliga bilderna ovanför de redigerade bilderna. De fem första ramarna visar en Cisterna som genomgår en grön-till-röd övergång, och de kommande fem ramarna visar en andra Cisterna som genomgår en liknande övergång. Pilar överlagda på de ursprungliga bilderna indikerar cisternae som spårades. Scale bar = 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kvantifiering av fluorescenssignalerna från video 1. Diagrammen representerar GFP-Vrg4 och Sec7-mScarlet signaler från de två cisternae valts för analys, där den övre panelen representerar Cisterna som blir synlig i början av filmen och den nedre panelen representerar Cisterna som blir synlig senare i filmen. Time Zero definieras för varje Cisterna som ramen precis innan GFP-Vrg4 fluorescens upptäcktes först. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Final film av de projicerade Z-stackarna. Den övre panelen visar de ursprungliga projektionerna, och den nedre panelen visar de redigerade projektionerna där endast de två cisternae som valts för analys är synliga. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4D konfokal avbildning av jäst organeller kräver noggrann trimning av flera parametrar. Det stora problemet är foto blekning och fototoxicitet. En typisk 4D-film innebär att samla tusentals optiska sektioner, så laser belysningen måste hållas så låg som möjligt. Tandem fluorescerande proteintaggar kan användas för att öka signalen utan att öka uttrycket av det taggade proteinet16,17. Maximera skanningshastigheten hjälper till att begränsa photodamage, och även tillåter Z-stackar fångas på lämpligt korta intervaller. Voxel-storlekar som ligger på Nyquist-gränsen i både XY och Z minimerar ljusexponeringen och i teorin återvinner den information som finns tillgänglig från Optical Setup18. I slutändan kommer varje Voxel i ett signal-innehållande område av en optisk sektion får normalt endast 1-3 fotoner. Denna mängd information är långt under vad som normalt rekommenderas för optimal avbildning med en enda Z-stack, eller för deconvolution. Men deconvolution hjälper fortfarande genom att jämna ut bullriga signaler, och sådana datamängder kan analyseras och kvantifieras.
Även med en hög kvalitet 4D DataSet, spårning av märkta organeller är en komplicerad uppgift. Med ImageJ plugins som finns här, kan en forskare array varje Z-stack på datorskärmen och kan enkelt flytta fram och tillbaka mellan tidspunkter och mellan den ursprungliga och redigerade data. Dessa verktyg gör att de märkta strukturerna kan spåras genom tid och rum med rimligt förtroende. Subjektiv bedömning spelar dock en nödvändig del, och bias måste undvikas när det är möjligt. Partikel spårningsprogram kan potentiellt hjälpa men är ännu inte tillräckligt sofistikerad för de flesta av de fenomen som studeras. För att kompensera denna begränsning är det bäst att undersöka flera markörer och att testa förutsägelser av modellerna på olika sätt3,6,7.
4D konfokalmikroskopi Imaging har spelat en central roll i att karakterisera jästen sekretoriska och endocytiska vägar. Denna metod visade att er Exit platser form de Novo och kvarstår på obestämd tid1, bekräftade att Golgi cisternae mogna3,5, och förtydligade rollen av COPI vesikel Coat i Golgi mognad7, 19. Mer nyligen, 4D Imaging som bevis för att jästen tidigt endosome är identisk med den sena Golgi, och att jästen sena endosome är en långlivad fack6. Även statisk avbildning av Fluorescent taggade fack fortsätter att vara värdefulla, 4D Imaging erbjuder unika insikter i de operativa principerna för jäst organeller.
En spännande ny utveckling i tillgången på självmärkning proteiner för fluorescerande märkning20. SNAP-tag beter sig dåligt som en fusion partner i jäst, men HaloTag beter sig väl. Bright och foto membran-permenade halotag substrat21 har gjort det möjligt att utföra 4D konfokal avbildning med far-röda färgämnen6. Tillsats av en far-röd bild kanal till den tidigare använda gröna och röda bild kanaler tillåter robust Trefärgad 4D mikroskopi23, och därmed utvidga utbudet av fenomen som kan studeras i jäst av levande cell avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant R01 GM104010. Tack för hjälp med fluorescens mikroskopi till Vytas bindokas och Christine labno på den integrerade mikroskopi Core Facility, som stöds av NIH-finansierade Cancer Center stöd Grant P30 CA014599.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).
