Summary
線虫の大規模な集団のハイスループット表現型解析を可能にする広い視野線虫追跡プラットフォーム (WF-NTP) を使用するプロトコルについて述べる。これらのプロトコルは突然変異系統または拡張性の高いファッションの薬理学的治療への反応の微妙な行動変化の特性評価に使用できます。
Abstract
線虫は、生物医学研究、機能ゲノム学と老化研究で広く採用されている老舗動物モデルです。健康とフィットネスの調査の下で動物を評価するために 1 つは通常運動読み出し、体曲がりの数や動きの速度の測定などに依存します。これらの測定は通常手動カウントを含む、25 以下各実験での動物の数を制限時間として、良いの統計的有意性を取得し、制約の多い労働を困難に作る。努力が最近増加に焦点を当てて自動プロトコルを開発に加えられた高い統計的検出力は、再現可能な結果を取得し、弱い表現型効果を調査したときに偽の正と負の結果を制限する必要は、以来、パラメトリック最適化を用いた行動プロファイリング.運動検出感度遺伝学的研究と創薬の重要なことが多い小型の表現型の変化をキャプチャするために必要なレベルに検出限界を拡張するために述べるここまで 5,000 個々 の動物の研究を可能にする技術の開発同時に、による測定の統計的検出力を増加約 1,000 倍手動の試金に比較し、約 100 倍、その他の自動化された方法と比較しています。
Introduction
約半世紀前、シドニー ・ ブレナーは開発とこの小さなとして、神経生物学を研究するモデル システムとして線虫(C. elegans) を導入 (1 mm の長さ)、透明な線虫は操作が容易です遺伝子研究室1を維持します。今日では、線虫アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、遺伝子調節、代謝、自然老化2などの生物学的プロセスの様々 な研究に使用されます。さらに、線虫と高等生物 (ワーム遺伝子の 80% がある人間細胞)、間病経路の細胞およびティッシュの複雑な蛋白質の表現パターン省シンプルさとリンクと栽培の費用対効果は、生体内で効果的なモデル生物高スループット遺伝3,4,5,6,7、に従う8,9,10,11,12,13薬14,15,16上映。これらすべての理由から、線虫正常と病気関連の分子経路の特性評価に採用されています。神経変性のフィールド、たとえば、それが有効になってタンパク質凝集3,4,7,15,17の老化の影響の調査 18, とプロモーターの解析、タンパク質凝集3,4,5,6,7,14、阻害剤 18。
このタイプの調査で定義される重要な行動パラメーターであるみみずの全体的なフィットネスで測定できます手動でさまざまな方法でよう分 (BPM)4,6,ごと体曲がりの数を数える19、または運動20,21,22, の速度を測定することにより、平均寿命と麻痺の率を測定することによって。様々 な分子経路とメカニズム3,4,14,19、多くの重要な洞察をもたらした体曲がりの手動測定と運動の速度が 20,23, 手動の試金のまま現在低スループット、非常に手間と時間のかかるながらエラーや人間バイアスする傾向があります。これらの問題は微妙な行動の変化を区別するために十分な検定力とデータの収集にかなりの課題を提示します。この制限は、薬物分子が多い表現型変化の小さい24につながる潜在的な薬剤の処置としてスクリーニング、そのため再現性のある結果を得るために動物の多数の研究を必要とするために特に関連します。このポイントを示すためには、検出 (POD) の高出力動作に自信を持って重要な変更を定義して偽陽性の結果25を制限する必要がある最近の研究を示しています。手動カウント測定再現性、自動化、時間- とよりよい成果を交換する線虫のコミュニティで強い動機になりました。この需要を満たすためには、いくつかの研究所は最近高感度測定とワーム22,26,27,28 の大きい数の正確なワームの追跡の方法を開発しました。 ,29,30,31,32,33。
統計的に有意な測定に必要な動物の大規模なコホートにオートメーションのプロセスをさらに拡大、する追跡プラットフォーム (WF NTP)15,34 広い視野線虫を最近開発しました。、35,36, 非常に大規模なワーム個体群の複数表現型読み出し、統計的に関連する表現型検出25のキーファクターの同時調査を可能にします。WF NTP は現在並行して、最大 5,000 動物監視できますだけでなく、表現型の読み出しも体曲がり、動きの速度、麻痺は人口のごく一部の振幅率など、複数のパラメーターを含めると、動物のサイズ。したがって、容易に並列的多次元指紋36を作成する行動マップに別のリードアウトを結合するワームの何千もの画面に不可能です。関連付けられているオープン ソースのソフトウェアは、それを運用する必要がまた、完全にカスタマイズ可能な Python で書かれています。この技術を採用するユーザーを有効にするのには、グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) があります。
WF NTP の潜在的なアプリケーションのいくつかを示すプロトコルのシリーズを紹介します。特に、化合物、低分子化合物からタンパク質医薬品に至るまでの管理を議論し、小さなサンプルする必要性を効果的に除去するワームの大規模な集団に直接その効果を画面に説明サブ集団。WF NTP のような目的のための使用は、既にアルツハイマー病 (AD)15,34,35パーキンソン病 (PD)18 の創薬プログラムを設計する手順を目指したに重要な利点をもたらした治療候補35,37の評価のため体内のデータを使用しています。
Protocol
1.線虫のプロトコルのための材料の準備
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10 x M9 緩衝液を準備するには、オートクレーブの 1 L ボトルにリン酸一カリウム 30 g、二塩基ナトリウム隣酸塩 60 g と 50 g の塩化ナトリウムを追加します。
- 約121 ° C、15 分で 1 リットルの水とオートクレーブを追加します。
- 精製水に約15 分のための 121 ° C のオートクレーブで 10 倍に希釈します。
- 冷却、1 M 硫酸マグネシウム溶液の 1 mL を追加します。
注: のみ 1 x M9 (M9) ワームは、次の手順で処理されます。
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線虫の成長媒体 (リッチ NGM) を準備、塩化ナトリウム、寒天、カゼイン、精製水 900 mL、121 ° C、15 分でのオートクレーブの 5.75 g の 15.75 グラム 2.7 グラムを混ぜます。
- すぐに使用しない場合リッチ NGM 媒体を地球温暖化のオーブン (約. 70 ° C) に転送リッチ NGM を保管する溶融 12 h までの 70 ° C で使用不能になる前に
- リッチ NGM ミックスは、無水エタノールに 1 M 塩化カルシウム、1 M 硫酸マグネシウムのソリューションの 900 μ L と 900 μ L コレステロール 5 mg/mL の溶液の溶液の 900 μ L を追加します。
注:コレステロールには、使用する前にオートクレーブに入れることは必要ありません。 - 同期人口を維持実験板を準備するには、リッチ NGM の 900 ml 812 μ M で 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUDR) の 92 μ L を追加します。
注:FUDR は有毒で発がん性、白衣、安全メガネに加えてニトリル手袋を着用することが不可欠です。廃棄物一般廃棄物を入力するを許可しないストリームし、アフター バーナーで焼却処分します。 - 成長板 (リッチ NGM 板) を生成する 9 cm の滅菌シャーレにオートクレーブ リッチ NGM の 20 mL を注ぐ。ように運動プレート (名言プレート) 9 cm の滅菌シャーレにオートクレーブ リッチ NGM の 15 mL を注ぐ。FUDR プレートを生成する 9 cm の滅菌シャーレに FUDR とリッチ NGM の 20 mL を注ぐ。
注:名言プレートの低寒天ボリューム カメラを容易に焦点を当てるし、ワームの追跡 (手順 3.2.5 参照)。
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オートクレーブ 1 L で OP50大腸菌株を準備の流体培養基 LB の 121 ° C、15 分でスターター文化を冷却すると接種して。
- 37 ° C で一晩成長し遠心分離に使用するチューブの消毒細菌文化を許可します。
- 4,600 × gで 15 分間遠心して生殖不能の管に細菌を転送します。
- 上清をデカントし、10 x (10 倍濃縮) OP50 素材を作成する元の容積の 10% で滅菌水を使用すると、中断します。
- 150 mL の 1 を生成するために 10 x OP50 株式の 15 mL を希釈 x OP50、リッチ NGM プレートのシードに使用される前に滅菌水を使用しています。種子 FUDR プレートを解決する使用残りの 10 倍。
注:名言プレートはシードされていないままになります、画像集録ステップでのみ使用されます。
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細菌、分離リッチ NGM FUDR プレートとプレートにシード。
- 無菌条件下で OP50 リッチ NGM にプレートし、均等に 1 x の 350 μ L を追加します。
注:ワームはプレートと金型の側面をクロール、プレートの端に広まります。 - 無菌条件下で FUDR に OP50 プレートし、均等に 10 倍の 350 μ L を追加します。
- 乾燥させると, 使用前に 2 d のための 20 の ° C でプレートを許可します。
- 無菌条件下で OP50 リッチ NGM にプレートし、均等に 1 x の 350 μ L を追加します。
2. c. の elegansの WF NTP で使用するための準備
- リッチ NGM プレートにc. の elegansを維持または転送することによって少量の寒天を含むワーム新鮮な細菌層の上に下向き。実験的プロトコルを開始する前にこの方法で線虫の系統を維持します。
- 転送の技術を使用して (手順 2.1 を参照)、それぞれの種子 20 プレート、混合供給段階ワームを使用してをひずみし、20 ° C で 2 d の育て方
- M9 15 mL、15 mL チューブを 1 つのプールを使用してワームを含む 5 プレートを洗浄します。それぞれの株のすべての 20 プレートを繰り返します。
- 2 分間 2,000 x gでワームを遠心、上清を除去、M9 溶液 2 mL で中断します。
- 13% ナトリウム次亜塩素酸と比 3:2 巻/巻の 4 M 水酸化ナトリウムを混合することによって漂白溶液 10 mL を準備します。
注:このソリューションでは、オートクレーブ滅菌は必要ありません。コンポーネントおよび得られた溶液は腐食性し、ニトリル手袋を使用して注意して処理する必要があります。水酸化ナトリウム、ガラスに軽度腐食性プラスチック容器に格納する必要があります。 - 各遠心分離管に漂白溶液 1 mL を追加し、約 3.5 分の積極的にまたはキューティクルが完全に溶けるまでシェイクします。
- 無菌条件下で 2 分、上清を除去し、M9 溶液 15 mL で中断 15 mL M9 2,000 × gで遠心分離し、試料を希釈します。
- 2.7 6 回、ワームの卵だけが残っているし、ソリューションは塩素の匂いまで手順を繰り返します。
- 遠心分離機の 2 分間 2,000 x gでサンプル、上澄みを除去し、M9 溶液 2 mL で中断します。
- 無菌条件下で 12 も組織培養プレートの各ウェルに M9 含む卵 2 mL を転送し, 16 h の最小の 20 ° C で滅菌ガラス ピペットを使用します。
注:交差汚染を防ぐために各緊張に個別の刷版を使用します。遠沈管からワームの窒息を避けるため複数井戸の助けへの転送のステップ - 15 mL 遠沈管に 12 ウェルのプレートから夜通し孵化ワームを転送します。Worm ソリューションの 5 μ L の 3 滴を取るし、ワームは幼生期 (L1) で現在の数をカウントします。
- ソリューションの μ L 当たりワームの数を計算します。
- シード L1 は、プレートごと 3,000 ワームでリッチ NGM プレートの上にワームし、最後の幼虫 (L4) 段階に達するまでに 20 ° C、2 日間で成長できるように。
3. 一般的な WF NTP プロトコル
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適切な濃度で各薬品の化合物の 2.2 mL を追加 (このような薬として 25 または 10 mM のようなスクアラミン18と感染15、それぞれ) 6 FUDR にプレートし、ワームのひずみが必要なそれぞれの生殖不能の条件の下で乾燥させて。
注:各濃度と使用される各溶剤のため、検討中の各化合物にこの手順を繰り返します。- 5 豊富な NGM プレート 2.13 15 mL の M9 のバッファーを使用しての手順を用意してからワームを洗浄し、ワームを遠心管に転送します。
- 2 分間 2,000 × gで遠心上清を削除し、M9 の 3 mL で中断します。ワームを含む M9 溶液 5 μ L の 3 滴を取るし、ワームは L4 最後の幼虫段階で現在の数をカウントします。
- M9 バッファーの μ L 当たりワームの数を計算します。
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特定の化合物は、それぞれの各濃度の繰り返しを含んでいる乾燥の FUDR 版の 6 種 700 L4 幼虫化合物し、無菌条件下で乾燥することができます。
- L4 から広告ひずみ38など体温を上げるだけでワーム麻痺を誘発する、これらの系統の 24 ° C でワームを孵化させなさい。成人の D0 として翌日 L4 仔稚魚期を数えます。
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トラッカーのステージ ライトをオンにします。
- 70% エタノールをガラス ステージをきれいにし削除してください、表示される残渣が、ないレンズ キャップ。エアー ダスターなどを用いた結像レンズをきれい。カメラが正しく接続されているあり、インストールされていることを確認し、画像キャプチャ ソフトで録音を開始します。
- 20 フレーム/秒、モノラル 16 パラメーターのセットアップを記録を記録するカメラの設定を調整します。1,200 フレーム、95% の圧縮率で MJPEG 形式で保存を記録します。ステージが正しい高さに設定されていることを確認する空 9 cm シャーレを使用し、必要に応じて調整します。
注:これが正しく動作するように保つ-dead' アルゴリズムを許容するプレートのエッジが記録に表示されていることを確認 (図 1 a)。 - 無菌条件下で以前に同じ条件でステップ 3.2 と 1.2.4 準備したプレートをスクリーニング 1 Mot で準備 2 プレートを取る。名言プレートに M9 溶液 3 mL を追加します。ステップ 3.2 名言プレートを用意して 2 プレートの表面の面積の 1/3 を洗浄する M9 の他の 2 mL を使用します。
- M9 ソリューションやトラッカーのステージに約 600 のワームの約 5 mL を含む名言プレートを配置します。個々 のワームを使用してカメラの焦点し、録音を開始します。
- 録音が完了したら、破棄; ワームと名言プレート一度使用すると FUDR プレートをマークし、インキュベーターに戻る。
- 各実験条件の 3.3.3 に 3.3.5 の手順を繰り返します。
- 各時点の大人の寿命、3.3.3 に 3.3.6 手順を繰り返します。
注: スクリーニング プロシージャは、ワームの大人の寿命 (約3 週間) の任意の時点実施することができます。これらのプロトコルを容易にするまで 9 時間ポイントをスクリーニング著者は、成人の 1 日目から 2 日おきの検診をお勧めします。
4. 離散投与試験の最適化
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3.1.1 に 3.1.3 の手順を繰り返すことによってワームを準備します。
- 種子 ca. 1000 L4 5 FUDR プレートの上にワームします。D3 AD38を含む実験のための大人のワームまで 24 の ° C で版を孵化させなさい。
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滅菌ガラス ピペット、転送を使用してワームは 2,000 x gで 2 分間遠心 15 mL 遠心管にプレートから無菌状態の下で準備し、上清を削除します。
- 1 mL の M9 バッファーでワームのソリューションを中断します。300 x gで 2 分間遠心遠心チューブにワームを転送し、上清を除去します。
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タンパク質細胞内シグナル、目的濃度 (通常 40 μ M)、トランスフェクション試薬の配信の 40 μ L とネイティブ蛋白質の 20 μ L を追加し、30 分間室温でインキュベートします。
- 無菌条件下でステップ 4.2.1 から場所管水平 1060 μ L の総ボリュームを与えると 8 h のためのインキュベーターを揺れ 24 ° C で 60 回転で振るカプセル化された蛋白質を含んでいる微量遠心チューブにワームを転送するのに滅菌ガラス ピペットを使用します。
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無菌条件下で名言プレートに M9 溶液 4 mL を追加し、ワーム プラス薬名言プレートの 1 つの遠心チューブを転送します。
- 3.3.2 に 3.3 の手順を繰り返すことによってトラッカーを設定します。
- 無菌条件下で名言プレートに M9 溶液 4 mL を追加し、ワーム プラス薬名言プレートの 1 つの遠心チューブを転送します。
- トラッカーのステージに Mot プレートを置き、個々 のワームにピント、録音を開始します。完了したら、名言プレートのラベル、1 つの側面に設定。
- すべてのサンプルの 4.4.1 および 4.4.3 の手順を繰り返します。
- ガラス ピペットを使用して、名言プレートから 15 mL 遠心管に無菌条件下でワームを転送し遠心分離機 2,000 x gで 2 分間で削除の上清、転送を FUDR プレート ペレットと無菌条件の下で乾燥することができます。
- すべてのサンプル手順 4.4.5 を繰り返します。
- 成人の D6 まで 24 の ° C でワームを孵化させなさい。
注:複数の抗体の孵化も可能です。 -
名言プレートに 3 mL の M9 バッファーを追加し、名言プレート FUDR プレートからすべてのワームを洗浄する M9 溶液 2 mL を使用します。
- 3.3.2 に 3.3 の手順を繰り返すことによってトラッカーを設定します。
- トラッカーのステージに Mot プレートを置き、必要に応じてカメラの焦点、レコーディングを開始します。録音が完了したら、名言プレートを破棄または必要な場合をさらにスクリーニングするため回復します。
- すべてのサンプルの 4.6 に 4.6.2 の手順を繰り返します。
5. ビデオ データの分析
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動画を取得した後に、データ分析用ソフトウェアの GUI (図 2) で適切なパラメーターを選択します。
- シングルまたはブラウズ関数経由で複数の動画を読み込みます。出力先フォルダーを選択します。30 s 解析用 1,200 に 600 のフレームを使用することを確認します。
注: 任意のフレーム範囲を分析できます。 - フル解像度で 9 cm シャーレをイメージングの 0.029 となる mm 換算係数にピクセルを挿入します。'デッドを維持' 追跡アルゴリズムを選択します。
注:換算係数は、使用されるフィールドのビューに依存します。Z 変換アルゴリズムは、代替手段としても使用できます。 - 検索] セクション (図 2) でパラメーターを入力: Z は、イメージを使用= 100、 Z のパディング= 3、 Std ピクセル= 54、しきい値= 9、オープニング1、終了を = = 2。最小サイズのフィルターパラメーターを調整 = 20、最大サイズ= 180、ワームのような= 0.94。
- 成形軌道パラメーターを調整:最大距離移動= 10;最小値= 150、メモリ10 を =。
- ベンドと速度パラメーターを設定します。速度を推定するフレームのベンドしきい値の 1.8、最小ベンド0 と 150 を使用します。
- 死んでワーム統計をチューニングします。最大速度の最大値は 1 分あたりビートの 5.0 と 1.0 を使用します。
- 出力フォルダーを選択します。出力フレームの数を 50 に設定します。フォント サイズを 10 に設定します。
注:必要に応じて、1 つまたは複数関心領域(Roi) を選択します。
- シングルまたはブラウズ関数経由で複数の動画を読み込みます。出力先フォルダーを選択します。30 s 解析用 1,200 に 600 のフレームを使用することを確認します。
- パラメーターをテストするには、関数の例を使用します。例の画像を出力し、ワームが 8 しきい値処理ステップ (図 1) 全体にわたって表示されることを確認します。
- ジョブを開始関数を使用します。
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データセット全体の個々 の結果を組み合わせることによって結果のテキスト ファイルを分析します。GUI で tsv 関数へのエクスポートを使用します。
注:必要に応じて、ワームの個々 の測定基準は人口研究も考えられます。- 統計ソフトウェア パッケージを使用してデータを分析します。
Representative Results
営業、役立つ multiparametric 分析および図解 WF NTP プロトコル (図 1および2) の高スループットの容易さでは、非常に正確な方法でワームの動作の非常に小さな変化を判断可能です。イメージング プラットフォームはカスタムメイドの光力学に基づいており、それは、' 1' センサー、8 インチの 8「白いバックライトに照らされた 16 mm 焦点距離の高解像度レンズと組み合わせて 6 MP モノクロ カメラを使用する組み立てることができる (材料の表を参照してください。そしてまた36の詳細を参照)。関連付けられた WF NTP ソフトウェアは、Python で書かれた、Windows プラットフォーム上で実行する開発されました。3.00 GHz オクタ コア プロセッサと 64 GB のランダム アクセス メモリ (RAM) のカスタム組み立てられたコンピューターで実行されます。ソフトウェアも仕事と RAM とコンピューターの CPU に基づくビデオ解析を並列化するために設計されました。すなわち, , 低い計算パワーを持つマシンになります以下のビデオは、並列で実行します。我々 が現在使用しているセットアップは ca. 16 並列動画実行する最適化され、一晩 ca. 100 ビデオの解析を完了することができます。さらに、高いレベルの WF NTP の GUI で提供されているカスタマイズの詳細は、画像解析の質の偉大な制御をできます。GUI を使用して、並列または個々 のビデオの大規模なデータセットを直接アップロードすることができます。特定のフレームは、詳細なサブ分析、行動指標を推定する使用ことができますピクセルの換算係数要素も選択できます。ユーザー分析麻痺の動物を考慮するかどうかに応じて 2 つの別の追跡アルゴリズム (死んだ維持と Z 変換) のいずれかを選択できます。閾値パラメーターは、ビデオとそれに応じて調整された、実験的品質をすることができます。開始タグと終了パラメーターは、ノイズを除去し、さらに閾値処理機能を実装できます。芯線化アルゴリズムでは、分析の方法を提供しています。(フィルタ リング) オブジェクト サイズ カットのトレードオフはバック グラウンド ノイズの追加フィルターを提供し、ワームのようなパラメーターにより、ワームの同じピクセル サイズを持つその他のオブジェクトを区別するそれ故に、楕円形状の物体だけを検討するユーザーワーム。これらのしきい値の操作後個々 のワームとして識別できるすべての結果として得られるラベル領域とそれらの地域の位置をその後の分析と追跡のためのフレームごとに保存されます。各履歴ワームの偏心は、ワーム (BPM) を時間の関数として曲げの程度などワーム指標を推定する使用されます。ユーザーはまた衝突の後ソフトウェアのメモリに、ワームを保持するために使用するフレームの数を選択することが、ワームのフレームに移動することができますピクセル数は、ノイズからの動物を区別するためにも調整できます。最小のトラックの長さオプションでは、のみいくつかのフレームのために追跡されているワームを破棄することができます。曲がりや速度など、その他の重要なパラメーターでは、曲げ体曲げると動物の速度を推定するには必要と考えフレーム数としてカウントする必要度を選択できます。麻痺した動物の包含のためカットオフ パラメーターをさらに調整できます。出力は、結果ファイルに自動的に表示されます。これらの値は、麻痺している動物の一部の評価のための上限として考慮されます。ユーザーも関心の 1 つまたは複数の領域を選択できます。この機能は特に便利ワームの集団を分析して結果ファイルに出力が自動的に整理されます。出力オプションでは、出力フォルダーへの追跡それに対して生成されるフレームの数を選択することができます。個々 ワーム トラックを示すプロット パス ツールおよび指紋を作成するユーザーをできるフィンガー プリント マップなど、データ分析、さまざまなツール セットを使用もできます。
この手法を採用し、線虫の生態学的研究のみならず遺伝の修正と薬物治療の高スループット スクリーニングなどの薬理学的および医学研究目的への新しいアプローチを可能。 にします。各種神経変性疾患 (前頭側頭型認知症 (FTD)39, パーキンソン病 (PD)7 のワームの大規模な人口研究 (N > 1000) 表現型の特性を記述することによって、この可能性を説明しています。、アルツハイマー病 (AD)16,40, 筋萎縮性側索硬化症 (ALS)19 (図 3 a)、およびワーム PD18との広告のモデルを使用して潜在的な治療上の分子の効果を特徴付ける15,12 (図 3 b)。2 つの小さい分子、スクアラミン18と感染15PD (図 3 b) と 10 に 25 μ M までの濃度で投与された広告38 (図 3 b) μ M ワーム、それぞれ。両方の化合物を示した明確な濃度の範囲で用量依存性効果をテストします。この測定値の精度が従来の方法 (図 3 c) と比較して分析することができますワームの数を増やすことによって達成されると説明しました。我々 は分子スクリーニング同様突然変異系統の特性のようにサンプル サイズ (図 3 c) の重要性を示されています。20 ° C の温度の増加は、約半数が成人の 3 日後に麻痺になる広告ワームに します。ワーム集団など、異なる条件で上映,アミロイド β ペプチド (a β1-42) 42 残基フォームを過剰発現するワーム (AD ワーム) は微妙な温度の変化 (図 3 c、左にさらされたときパネル)、(図 3 の c、中央のパネル)、すべてのニューロンまたは広告ワームが感染 (図 3 c、右パネル) にさらされたときに a β1-42が表現されたとき。ワームが小さい・ ロワ WF-NTP (N < 50、黄色バー) 全体のワームの人口 (N の平均の運動とこれらのワームの運動の比較を強調表示で取得した動画の全視野からランダムに選択から分析したも< 1,000)。すべてのパネルの測定の違い、総じてワーム人口が表示されます p ≤ 0.0001 (*) に統計的に有意な。
ここで記述されている WF NTP プロトコルも、最適な方法でサポートする複数のパラメーター (図 1 b) の同時録音が可能内部検証と条件の広い範囲の包括的な指紋の開発基準としたコントロールのサンプルでは、複数の研究の間で意味のある比較が可能します。このマルチ パラメトリック アプローチには周波数、速度、麻痺率、サイズ、ベンド振幅曲げ変位36を曲げを含む複数の行動特性の同時分析が含まれます。これは、すばらしい細部と非常に高い感度で統計的有意性を監視する動物の数千人と大規模な集団研究のための機会を提供できます。この追跡手順は、他の行動の測定と並行して、分子のスクリーニングの調査の主要な機能で実行する麻痺の研究を許可する利点もあります。
広告15,34,35と PD18創でこれまで達成している結果を示すことができる動物の数を大きく広い視野データ収集の重要性単一の実験、実験誤差を大幅減少し、研究の統計的な妥当性が大幅に向上で監視。これらの結果に基づいて、我々 はコミュニティ36で入手しました、WF NTP プロトコルはc. の elegansの使用を拡張大幅を見込んでいます。
図 1: WF NTP 解析手順と指紋の例。(、) 1。元のビデオ。2. 背景イメージです。3. 背景画像を差し引かれます。4 6。 しきい値の手順を実行します。7-9. ワームの単一ラベルします。(b) 複数の表現型野生型ワームの指紋と報告され、ワームの PD と広告のモデル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: WF NTP のグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) です。特定の動画と選択したフレーム解析、GUI で選択できるし、その後分析は 2 つの指定した追跡アルゴリズムのいずれかで実施ピクセル変換係数を挿入できます。体曲げると動物の速度を推定するために必要なフレーム数としてカウントする必要の屈曲角度を選択することが可能です。体の曲がりと速度しきい値が麻痺したワームの統計情報を確認できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: WF NTP メソッドによって有効になっているアプリケーションの例として。(、) WF アプリケーション NTP 人口学 (N > 1,000) FTD、PD、AD などの神経変性疾患の範囲の線虫モデルの BPM 測定と ALS。(b) WF アプリケーション NTP 創。(c) 人口研究温度感度、薬の有効性と変異株の評価の重要性。集団 N < 50 (黄色のバー) の表現型がワーム全体人口の比較 (N < 1,000)。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
光科学の分野の中で技術の急速に拡大のため、実質的に新しい方法で線虫研究における自動化された方法の要件に対応することが可能です今。その結果、追跡プラットフォーム20,41,42,43,44,45,46デジタルの数が設計されているし、上の利用可能手動カウントの曲げオメガ ターンなど寿命測定動作のより複雑な形態と同様、頻度、麻痺率、移動速度などのパラメーターを置き換えるために最後の数年間。最新自動化されたプラットフォームが大幅に再現性を向上して小さなコホート又はも個々 の動物で高品質なデータを提供線虫 c. エレガンスの感度41を研究します。我々 はワームの動作もできるように並列で動物の何千ものコホートの表現型を評価するための解析の自動化を拡張することを決めた。ワームのコホートの勉強のアプローチの主な利点、ワームの動作24の高い本質的な可変性および薬物治療の研究が多いが微妙なの表現型変化につながるという事実のための会計のこと動物の小さなグループを使用するとき十分な統計的に有意に検出することは困難。検出 (POD) のハイパワーは確かに必要な動作で自信を持って任意の有意な変化を検出し、偽陽性の結果25を制限します。
ここでは、一連のプロトコルはc. の elegans、追跡プラットフォーム (WF NTP)36広い視野線虫における最近報告された自動スクリーニング法に基づくを説明しました。ここで説明されているプロトコルは、5 つの部分に分かれています。パーツ 1 および 2 では、大規模なワーム個体群の準備について説明します。重要なステップは、労働条件の不稔と試薬や実験を実行に必要なプレートの準備です。私たちメモ、スクリーニング方法論36他と比較してこのプロトコルによって提供されるスループットの増加によりそれも必要があります増加された量の試薬;この要因は、実験的なデザインで慎重に検討する必要があります。健康的な幼虫がこれらの実験の実行に必要な漂白の手順が重要であり卵の数が多いと事前にテストが必要なをも注意してください。このプロトコルの第 3 部では、人口固体メディアと画面のワームに薬を届ける方法を説明します。我々 は、プロトコルのこの部分は数薬と並行してユーザーでテストする薬剤濃度に強く依存する注意してください。審査手続きと迅速なデータ取得の完全な自動化は、試薬調製と成長と大規模なワーム人口の同期に行動観察から制限ステップをシフトします。行動のスクリーニングの間に重要なステップは、録音や任意のワーム ステップ (例えば、追跡プラットフォームに NGM プレートからワームの転送) の処理のタイミングです。ここで説明されているプロトコルは 9 日まで大人の寿命中のワームを選別する設計例です。ただし、このプロトコルは、ユーザーの欲望、例えば、18 日間連続36多くの時間ポイントを画面に容易に適応することができます。その 4 上の線虫や部品 1-3 に示すプロトコル カスタマイズする方法簡単に、目的に応じてショーにタンパク質分子 (例えば、抗体と分子シャペロン) を提供するプロトコルのアプリケーションを示しています。アプリケーション。薬のような分子の分子シャペロンや抗体の37の管理の配信だけでなく、この手順を拡張する方法を紹介します。明記しない限り (パーツ) の最初の 4 つの手順は無菌状態下で行われます。液体のすべてのコンポーネントを使用する前にオートクレーブにする必要があり、70% の相対湿度でインキュベーション手順を実行する必要があります。第 5 部でトラッキングのステージとの組み合わせで提供されているソフトウェア パッケージを使用する方法をについて説明します。このソフトウェアのカスタムは大きなワーム個体群の挙動に関連する WF NTP データの分析のために設計されています。ユーザーがデータ分析のパート 5 で提供されるガイドラインに準拠するをお勧めしかし、これらのパラメーターが記録されたビデオ (すなわち、fps、視野、ビデオ解像度、取得したフレーム数) の特定の機能に依存しています。GUI で提供される関数の例は、分析の前に正しいパラメーターの評価を容易にするために設計されています。
これらの一連のプロトコルは、(現在まで並行 5,000 個々 ワーム) c. の elegansの大規模な集団の表現型を効果的に分析することが可能、動物の行動の本質的な可変性のための工芸品の削減, 線虫 c. エレガンス25の研究の統計的有意性を達成するために必要な検出力に関する予備的研究と一致しています。プラットフォームは、同時に複数の大規模なコホートを録画しながら高速で動物の大量の画像の記録が可能な高解像度カメラのシステムを使用します。高性能と WF NTP プロトコルのスループットは、非常に正確な方法でワームの動作の非常に小さな変化を確認することが可能になります。したがって、この方法論は、線虫の生物学の調査のためだけでなく、遺伝の修正と薬物の高スループット スクリーニングなどの薬理学的および医学研究のまた考慮する新しいアプローチトリートメント。この手順は、他の行動の測定と並行して、分子のスクリーニングの調査の主要な機能で実行する麻痺の研究を許可するという利点もあります。
広告15,34,35の PD18創薬プログラムでこれまでに達成されている結果が大幅に増加で広い視野のデータ集録の重要性を示す、単一の実験、実験誤差を減少させることにより、研究の統計的な妥当性が大幅に向上で監視できる動物の数。このプロトコルで記述されている現在のアプローチは、創薬の分野での課題を解決することに焦点を当て、我々 は方法論が社会で広く採用されるが、複雑な遺伝の応用、拡張することを願って、行動の研究が現在検出可能な表現型の数を増やすと。
Disclosures
著者は、利害の対立がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、フォールディング病 (CMD) の中心によって支えられました。FAA は、アルツハイマー病の社会、イギリス (許可番号 317 AS-SF-16-003) から上級研究員賞を受賞しています。線虫の系統は、線虫遺伝子センター (CGC) から得られました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable reagents | |||
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
| C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
| C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
| C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
| pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| air duster | Office Depot | 1511631 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
| 8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
| 16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
| 6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
| FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
| WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
| Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |
References
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