Summary
Bu makalenin amacı, bir kapsamlı, sistematik rehber histon H3 ve H4 etkili arınma ve miktar acetylated histon kalıntılarının sağlamaktır.
Abstract
Tüm ökaryotik organizmalarda kromatin, tüm genetik bilgi, fizyolojik şablon kalıtım için esastır. Kromatin tabi çoğunlukla histon proteinleri (yani, histon kuyruk) amino termini içinde oluşur ve erişilebilirlik ve temel alınan DNA fonksiyonel durumunu düzenleyen ardından çeşitli değişiklikler (PTMs) dizisidir. Histon kuyrukları nucleosome çekirdeğinden genişletmek ve asetil grupları histon acetyltransferases (şapka) tarafından eklenmesi ve asetil grupları histon uyku (HDACs) tarafından kaldırılması sırasında hücresel büyüme ve farklılaşma tabidir. Histon kuyrukları üzerinde lizin (K) artıkları üzerinde belirli asetilasyon desenleri tarafından (1) çekirdek histon derleme etkileyen transcriptionally etkin veya transcriptionally bastırılmış kromatin ve işe alma (2) sinerjik arasında dinamik bir homeostasis belirlemek veya uzlaşmaz kromatin ilişkili proteinler transkripsiyon sitesine. Histon kuyruk PTMs karmaşık doğanın temel düzenleyici mekanizma kromatin şablonu esas alan işlemleri ve değişiklikleri sonuçlarında çoğunluğu hücre olgunlaşma ve farklılaşma normal ve patolojik geliştirme etkiler. Geçerli raporu amacı acemiler çekirdek histon proteinleri hücrelerin ve beyin dokusu arındırmak için ve güvenilir bir şekilde histon H3 ve H4 izleri asetilasyon ölçmek için verimli bir yöntem sağlamaktır.
Introduction
Dönem epigenetik kalıtsal değişiklikler DNA dizisi1,2değişikliklerden bağımsız olarak meydana gen etkinliğini gösterir. Gen transkripsiyonu ve baskı (1) çekirdek histon proteinleri (iki her H2A, H2B, H3 ve H4 kopyalar) bir octamer sarılı kromozom DNA erişilebilirliğini ve (2) transkripsiyon faktörleri durumu tarafından belirlenir ve proteinler İskele yapısı- belirli organizatörü siteleri3,4' e getirdi. Gen transkripsiyonu enzim-aracılı değişiklikler belirli DNA organizatörü sitelerin ve histon kuyrukları5,6,7PTMs tarafından düzenlenmiştir. N-termini histon H3 ve H4 ökaryotlarda3' te bilinen en son derece korunmuş sıraları arasından, ve onların ardından değişiklikleri kapsamlı kromatin yapısı belirleme merkezi bir rol oynamak için dokümante edilmiş ve işlev8,9. Histon kuyrukları (yani, asetilasyon, metilasyon, fosforilasyon ve ubiquitination), PTMs kuyrukları etkileşim potansiyeli değiştirmek, yapısal durumu etkileyen ve kromatin lif ve böylece, katlama düzenleyen DNA erişilebilirlik ve4,10,11,12işleme. Asetil grupları için eklenir ve K artıkları histon kuyrukları üzerinde belirli histon etkileşim epigenetik enzimler, yani şapka ve HDACs, sırasıyla13bir dizi tarafından kaldırıldı. Örneğin, asetilasyon (H4K12ac), histon H4 lizin 12, daha önce bellek edinme ve konsolidasyon14için ilgili genlerin transkripsiyon etkinleştirmek gösterilmiştir. Ayrıca, birden fazla satır kanıt Gen transkripsiyonu enzim-aracılı epigenetik kontrol sağlıklı hücresel büyüme ve farklılaşma6,15çok önemli bir yönü olduğunu göstermektedir. Dysregulated insan hastalıklarda belirli gen aktivitesi değişikliği bir hallmark nerede olmak münavebe gen ekspresyonu, DNA'ın epigenetik değişiklikler veya bir mutasyon epigenetik enzimlerin kendilerini, epigenetik Yönetmelikte gösterilmiştir Patoloji (Örneğin, kanser)6,16,17ve. Bu nedenle, çekirdek histon değişimler değerlendirilmesi PTMs ortaya çıkan potansiyel terapötik müdahaleler için yüksek değerli hedef olarak. Ancak, bereket belirleme, etkileşen ortakları ve histon PTMs belirli rolleri kanıtlanmıştır zorlu18.
Geçerli rapordaki çekirdek histon hücreleri ve tek bir kesir ve histon H3 ve H4 PTMs miktar için bir iletişim içinde beyin doku arındırmak için en iyi duruma getirilmiş ve orta-den geçerek bir strateji açıklanmıştır. Dikkat, her ne kadar Şu anda asit tabanlı yayınlandı arıtma teknikleri ve histon antikor tabanlı algılama stratejileri yaygın histon karakterizasyonu için kabul edilmiş, onlar böylece yordam, kritik adımlar ile ilgili açıklayıcı bilgi eksikliği hızlı ve yinelenebilir histon çıkarma ve miktar engelleyen. Örneğin, hücre işleme ayıklamak ve doku biyopsisi başarılı çıkarma için farklı araçlar ve teknolojiler gerektirir. Ayrıca, geçerli el yazması sunulan en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı pratik, orta-den geçerek bir yaklaşım gösterilmektedir. Çekirdek histon güvenilir aşağı akım antikor aracılıklı PTM algılama kirleri üzerinden herhangi bir müdahale olmadan sağlar bir tek, saf kesir olarak ayıklanır. Ayrıca, geçerli yazının kendi küçük moleküler ağırlığı nedeniyle histon algılama ile ilgili sorunları hile. Genellikle, arıtma, miktar ve jel elektroforez protokolleri arasında uyumluluk eksikliği yinelenebilir ve kesin sonuçlar elde etmesini bilim adamları engel. Burada, çekirdek histon hücre ve doku arındırmak ve onları aşağı akım PTM analizleri yolu ile Batı leke için hazırlamak için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı gösterilmektedir.
Geçerli protokol çekirdek histon proteinleri arıtma süre onların yerli ardından değişiklikler (yani, asetilasyon, metilasyonu ve fosforilasyon) koruma sağlar. Şekil 1 histon arıtma Protokolü kronolojisi gösteriyor.
Protocol
Bütün fareler bir nem ve sıcaklık-kontrollü, AAALAC akredite hayvan tesisi tıp University of Miami Miller okulda yer alan. Tüm deneyler University of Miami Miller okul tıp kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve NIH. özelliklerine göre yapılan
1. örnek özü hazırlanması
-
Yapışık hücreleri
- Plaka hücrelerde 10 cm yemekleri uygun Kültür Medya (1 x 10-6 yemek gibi BV2, HEK-293 ve SH-SY5Y ama ~ 1 x yemek için birincil kortikal nöronlar gibi primer hücre başına 1015 hücre hücre hatları için başına 1 x 109 hücre). Hücreleri plaka tüm yüzeyine eşit olarak dağıtılır ve hücreleri ~ %100 izdiham (37 ° C, % 5 CO2) ulaşmak 48 h büyümeye izin emin olun.
- Hücreleri istediğiniz confluency alabilirseniz, yavaşça Kültür medya Aspire edin ve hücreleri 2 yıkama x prewarmed serum-ücretsiz medya'nın altında bir doku kültürü hood ile.
- Çanak serum-Alerjik medyadan Aspire edin ve buz gibi ayıklama arabellek 1 mL ekleyin (0.4 M sülfürik asit, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0] ve 1 proteaz inhibitörü kokteyl x) her yemeğin için.
- Tüm hücreleri ayıklama arabellek (kazıma) toplamak ve 1,5 ml tüp 1000 µL pipet ile etiketli aktarmak için bir plastik hücre kazıyıcı kullanın. Damlalıklı hücreleri yukarı ve homojenizasyon kolaylaştırmak için 3 kat aşağı.
- Tüm tüpler kapatın ve hemen onları buza koy.
-
Beyin dokusu
- Donmuş doku kullanılmakta ise, yer prechilled 1,5 mL tüp ve kısaca doku buza çözülme. Taze doku kullanılıyor, hemen 1.2.2 adım devam edin.
Not: Geçerli protokol donmuş fare beyin ve fare prefrontal korteks örnekleri kullanarak yordamlar açıklanır. - Ayıklama arabellek uygun miktarda ve vuruş (Tablo 1) önerilen sayısı kullanarak bir el Dounce homogenizer kullanarak doku lunaparkçı. Aşırı kromatin parçalama önlemek için önerilen vuruş sayısı fazla.
- Bir tek kanal 1.000 µL pipet kullanarak, homogenate bir prechilled 1,5 mL tüp aktarın. Tüm tüpler kapatın ve hemen onları buza koy.
- Donmuş doku kullanılmakta ise, yer prechilled 1,5 mL tüp ve kısaca doku buza çözülme. Taze doku kullanılıyor, hemen 1.2.2 adım devam edin.
2. ham histon özü hazırlanması
- Hücreleri veya ayıklama arabelleği dönen bir platform üzerinde askıya doku içeren 1,5 mL tüpler yerleştirin ve 4 ° C'de ham histon çıkarma izin vermek için 15 dönüş/dak, döndürün.
Not: Ayıklama zaman farklı hücre ve doku türleri için farklı olabilir ve her yordam için optimize edilmiş olması gerekir. Geçerli protokol 15 dk, 2 h ve ekstraksiyon (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5) 24 saat elde edilen sonuçlar sunar. - Microcentrifuge 4 ° c prechill İstenen ekstraksiyon zaman geçtikten sonra 4 ° C'de 10 dakika için maksimum hızda tüpler santrifüj kapasitesi
- Bir yeni, prechilled 1,5 mL tüp için ham histon dahil olmak üzere süpernatant aktarın. Pelet atmak.
- -80 ° C'de süpernatant depolamak (çıkarma bu adımda durdurulabilir bkz: Şekil 1' deki "Stop adım") veya hemen sonraki adıma geçin.
- Nötralizasyon arabellek x 5 1/4 hacmi ile ham histon nötralize (Örneğin, 5 nötralizasyon arabellek x 250 µL ham histon için 1 mL ekleyin). Yukarı ve aşağı 6 x de pipetting tarafından karıştırın.
- Karışımı pH şeritler ile pH kontrol edin. Buna göre ayarlamak 7 pH ulaşmak için daha fazla nötralizasyon arabelleği ekleyerek.
- Histon varlığı değerlendirmek ve nonhistone protein ham histon ayıklamak aşağıdaki gibi (Şekil 2).
- 4 (Laemmli) örnek arabellek x 12.5 µL 37,5 µL örnek eklemek ve 99 ° C'de 10 dakika denatüre
- Örnek bir SDS-sayfa jel üzerine yük ve 1 h için jel 100 V çalıştırın.
- Gecede çözümle Coomassie parlak mavi R-250 boyama jel leke ve üç ardışık yıkama (1 h/yıkama) sırasında Coomassie parlak mavi R-250 destaining çözüm destain.
Not: Ham histonlarla (Şekil 2) ile eluted ve arıtılmış histonlarla (yani, sütun giriş [Şekil 5A]) karşılaştırılabilir.
3. çekirdek histon saflaştırılması
-
Spin sütun denge
- Denge arabelleği 500 µL kullanılan her spin sütununu ekleyin. Sütun membran dokunmayın.
- 4 ° C'de santrifüj vasıl 800 x g3 dk için. Akışı aracılığıyla atın. 1 x tekrarlayın.
-
Histon arıtma
- Örnek ilgi 500 µL 2.6 adımından sütununu ekleyin. 4 ° C'de santrifüj vasıl 800 x g3 dk için. Akışı aracılığıyla toplamak.
- Gerektiği birçok sütuna tüm örnek yüklemek önceki adımı yineleyin. Spin sütun bantlayın değil.
- Akış yoluyla sütun bağlama verimliliği (Şekil 3) çözümlemek için her Santrifüjü adım birleştirin.
- Adım 2.7 sütun akış yoluyla çözümlemek için izleyin.
-
Sütun yıkama
- 500 µL yıkama arabelleği her bir sütun ekleyin. 4 ° C'de santrifüj vasıl 800 x g3 dk için. Akış yoluyla yıkama (yıkama #1) toplamak.
- 3.3.1 üç yıkama toplam için yineleyin. #2 ve #3 akışı aracılığıyla yıkar toplamak. Akış yoluyla ardışık sütun yıkar havuz değil.
- Daha fazla sütun histon bağlama verimliliği değerlendirmek için üç sütun yıkama (Şekil 4) adımı uygulayarak 2.7 analiz.
-
Histon elüsyon
- Sütun yeni etiketli 1,5 mL tüp içine aktarın.
- Histon elüsyon arabelleği 50 µL ekleyin. 4 ° C'de santrifüj vasıl 800 x g3 dk için. Akışı aracılığıyla içeren histon proteinleri kaydedin.
- Ek bir elüsyon için 3.4.2 adımları yineleyin. Histon miktar ve saflık farklı olarak birinci ve ikinci bir yer olan akış yoluyla eluates birleştirmeyin.
4. çekirdek histon yağış
- Son konsantrasyonu % 4'lük arıtılmış histon perklorik asit (PCA) eklemek PCA (Örneğin, %70 3 µL eklemek arıtılmış histon 50 µL PCA adım 3.4.2.
- Santrifüj için 3 s tüm kalan sıvı tüp duvardan toplamak için. Yukarı ve aşağı 6 x pipetting karıştırın.
- Tüpler bir rafa yerleştirin ve 4 ° C'de 24 h için kuluçkaya
- Ertesi gün, bir microcentrifuge 4 ° c prechill ve örnekleri için 4 ° C'de maksimum hızda 75 dk santrifüj kapasitesi
- Santrifüjü tamamlandıktan sonra zarlarını histon içeren küçük bir beyaz Pelet tüpün dibinde görünür hale gelir. Değil girdap örnek yapmak.
- Dikkatle süpernatant Aspire edin ve Pelet bozmadan, buz gibi %4 500 µL eklemek PCA örnek.
- 4 ° c için maksimum hızda 10 dk santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant Aspire edin.
- Adımı yineleyin 4.7 2 x.
- Pelet bozmadan, buz gibi soğuk aseton 500 µL ekleyin. 4 ° c için maksimum hızda 10 dk santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant Aspire edin.
- Adımı yineleyin 4.9 2 x.
- Dikkatle süpernatant Aspire edin, kapağını tüpler bırakın ve tüm kalan aseton buharlaşıp vardır Eğer 30 dk. onay için buz üzerinde kurumaya örnek izin.
- Tüpler kapağını ve oda sıcaklığında (RT) Kuru örnek 5 min için izin bırakın.
- Pelet steril su 30 µL içinde resuspend. Değil damlalıklı yukarı ve aşağı yap. Tüp bir parmağınızla hafifçe vur.
- Tüm tüpler kap ve histon Pelet boyutuna bağlı olarak 30-50 dk için buz üzerinde yeniden oluşturmak izin. Pelet resuspended kontrol edin.
- Tüm tüpler kap ve daha fazla RT 5 min için resuspend Pelet izin.
Not: Bu çözüm (birinci ve ikinci elüsyon adım 3.4.3) saflaştırılmış ve desalted histon oluşturdu ve daha fazla miktar ve histon asetilasyon çözümlemesi için kullanılan.
5. miktar Eluted histon proteinleri
- Spektrofotometre üreticinin protokolüne göre adım 4,15 son elüsyon sonra elde edilen toplam histon proteinleri ölçmek için kullanın. 230 absorbans ölçmek nm. A260/A280 oranı nükleik asit ile örnek kirlilik göstergesi kaydedin.
- Histon konsantrasyonu (x) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
Burada, OD A230 nm'de ölçülen optik yoğunluğudur. - ~5.0 mg/mL histon konsantrasyon doku 30 mg için bir ortalama verim olarak kabul edilir iken ~1.5 mg/mL histon konsantrasyon hücre satırları için bir ortalama verim olarak kabul edilir.
6. Western Blot Analizi
- Saflaştırılmış ve eluted histon kimden adım 4,15 ~ 10 µg histon protein/örneği ayarlayın.
- Su ve 4 x Laemmli örnek arabellek yükleme birimleri ayarlamak için uygun birim ekleme.
- Örnekleri 99 ° C'de 10 dakika için denatüre Onları buz üzerinde serin. Santrifüj için 3 s tüm kalan sıvı ve yoğunlaşma tüp duvardan toplamak için.
- SDS-sayfa jel üzerine örnekleri yükleyin ve 1 h için jel 100 V çalıştırın.
- Toplam histon protein görselleştirmek için jel gecede Coomassie parlak mavi R-250 boyama çözüm ile leke ve Coomassie parlak mavi R-250 destaining çözüm ile üç ardışık yıkama (1 h/yıkama) sırasında destain.
Not: ikinci elüsyon histonlarla (Şekil 5B) hiçbir düzeyde düşük içerirken, yüksek kaliteli histonlarla (Şekil 5A) ilk elüsyon histon proteinleri içerir. - Histon PTMs ölçmek için bir transfer sistemi kullanın (histon protein PVDF membran üzerine SDS-sayfa jel (adım 6.4) aktarmak için Malzemeler tablobkz:).
- Transfer sandviç bir araya getirmek için transfer sistemi kaset açın ve yukarı bakacak şekilde membran ile kaset dibinde ( alt +etiketli) PVDF membran yığın yerleştirin. Membran ile herhangi bir havayı yığını arasından çıkarmak için yavaşça bir leke rulo ve zar rulo.
- Membran üstüne jel lay jel membran arasından herhangi bir havayı çıkarmak için yavaşça bir leke rulo ve jel rulo ve üst yığını üzerinde jel yerleştirin. Yavaşça tekrar rulo ve kaset kapağı sandviç üstüne yerleştirin, sıkıca aşağı bastırın ve nob kilit saat yönünde çevirin.
- Kaset transfer sistemi yuvasına takın. Cihaz ekranında, Turbo Protokolüseçin. Tek mini jel veya ikiden fazla mini jeller için 7 dk. protokolü için 3 dk protokolünü kullanır.
- Membran ile 5 min için Ponceau S leke leke ve toplam histon proteinleri görselleştirin.
- Onları Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) % 0.1 x 1 yıkayın ara %20 5 tanesi süt 1 h. Incubate ile birincil ve ikincil antikor için 2 h ve blok için (4 ° C veya 1 h, RT, sırasıyla bir gecede) veya daha önce en iyi duruma getirilmiş bir protokolüne göre.
Not: içinde geçerli protokol, acetylated histon H4K12 karşı antikor (Şekil 6 ve Şekil 7) ve H3K27 (Şekil 8) kullanılmıştır.
Representative Results
Histon arıtma Protokolü ilerlemesini ve tüm analiz kesirler bileşimi göstermek için biz farklı histon özler insan mikroglial BV2 hücrelerden değerlendirildi. Histon H3 ve H4 PTMs (yani, asetilasyon) miktar göstermek için beyin dokusu lysates kullanılmıştır.
BV2 hücreleri, 10 cm doku kültürü tedavi yemekler yemek başına 5 x 106 hücre kaplama ve confluency 48 h. için büyümeye hücreleri sonra toplanan ve histon kromatin bir kuluçka 0.4 M içeren ayıklama arabellekte tarafından yayımlanan izin Sülfürik asit, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 x proteaz inhibitörü. 15 dk ve 24 h arasında çıkarma zamanı Coomassie parlak (Şekil 2) boyama Mavi tarafından belirlenen ham histon özleri genel kompozisyon etkilemedi. Sonraki, ham histon dengelenmiş histon sütunlar boyunca geçirildi ve akışı ile analiz edildi. Yüksek sütun bağlama verimlilik histon protein akışı-Coomassie parlak mavi boyama tarafından analiz zaman aracılığıyla yokluğu belirler. Biz olduğu gibi hiçbir tespit histon proteinleri analiz akışı aracılığıyla içinde (Şekil 3) mevcut % 100 olmak sütun bağlama verimliliği tespit. Tüm Membranlar ile ilişkili histon üç kez silika jel bağlı tek histon proteinleri bırakarak herhangi bir diğer kirleri çıkarmak için yıkama arabelleği ile yıkanmış. Biz (yani, 15 dk, 2 h ve 24 h) kez tüm histon çıkarma için ilk membran yıkama nonhistone contaminations ikinci ve üçüncü yıkar örnek saflık etkilemek değil sütunlarından kaldırmak için en önemli olduğunu, tespit ettik. Böylece, örnek türüne bağlı olarak, son iki yıkar ihmal. Histon protein (1 mM NaCl ve EDTA içeren elüsyon tampon kullanarak) sütundaki ilk elüsyon, histon gecede %4 perklorik asit ile çöktürülmüş sonra pelleted, yıkanmış ve arıtılmış histon H3 zenginleştirme için analiz ve H4. Biz o 24 h ayıklama zaman artar H3 H4 histonlarla arıtılmış kesir, 15 dk ve ayıklama zaman (5A rakam) 2 h ile karşılaştırıldığında gözlenen. Sütundaki ikinci elüsyon yüksek kaliteli veya yüksek miktar histonlarla (Şekil 5B) sonuçlanmamıştır.
Ardından, beyin dokusu homogenates histon H3 ve H4 PTMs, yani asetilasyon ölçmek için kullanılır. Vahşi-türü (C57BL6/J) erkek fareler vardı yönetilen bir geniş hareket HDAC inhibitörü (tributyrin) 5 g/kg 3 ö bütün beyin doku için sözlü olarak bir doz, günde 4 toplanan ve ham histon açıklanan protokole göre elde. Kullanarak bir unpaired t-testi, biz kararlı o tributyrin histon ham özü asetilasyon artırır (t(6) 6.184, P = 0.0004 =); Ancak, yabancı maddelerin (histon bantları değil açıkça tanımlanmış olan) hulâsa içinde tespit edilir. Böylece, H4K12ac antikor yüksek özgüllük (Şekil 6) sahip değil. Daha fazla küçük doku bölümlerde sunulan protokole uygulanabilirliğini değerlendirmek için biz toplanan prefrontal korteks Üçlü transgenik Alzheimer hastalığı (3 x Tg-reklam) farelerde tedavi günlük 10 mg/kg ile M344, bir sınıf ben ve dört IIB HDAC inhibitörü ay. Histon arıtma ve yağış burada açıklanan protokole göre gerçekleştirilen almıştır. Arıtılmış histon H3 ve H4 kesir kullanarak, biz M344 2.4-fold H4K12 asetilasyon arttığını tespit (t(6) 13.03, P = < 0.0001), H4K12ac antikor (Şekil 7) yüksek özgüllük ile. Benzer şekilde, histon H3 asetilasyon yanıt-e doğru başka bir HDAC inhibitörü, yani selektif HDAC3 inhibitörü, RGFP-966 BV2 hücrelerde bir artış gözlendi. RGFP-966 nedenleri 10 µM bir histon H3K27, tedavinin asetilasyon 24 saat sonra yaklaşık iki kat artması. Öğrenci unpaired t-test kontrol tedavi karşı hücreleri karşılaştırmak için kullanıldı.
Şekil 1: zaman çizelgesi histon arıtma Protokolü'nün. Histon analizleri için tüm adımları her adım için gerekli tahmini süresi ile birlikte aşağıda gösterilmiştir. Belirli adımları sonucunu gösteren ve el yazması içinde sunulan rakamlar parantez içinde verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: BV2 hücrelerinden çıkarılan ham histon gösteren temsilcisi Coomassie parlak mavi lekeli jel. Histon ayıklama Protokolü başlamadan önce BV2 hücreleri için 48 h kültürlü. Ham histon 15 dk, 2 h ve 24 saat için ( Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5durumda da bu) her zaman için üç çoğaltır ile elde. Nonhistone ve histon proteinleri ham histon hulâsa içinde bulunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: sütun akış yoluyla aşağıdaki histon arıtma gösteren temsilcisi Coomassie parlak mavi lekeli jel adım BV2 hücrelerden. Histon bağlama sütunu boyunca geçen ham histon sadece nonhistone proteinler akışı-aracılığıyla mevcuttur. Histon proteinleri yok bu kesir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi Coomassie parlak mavi lekeli jel BV2 hücrelerden histon arıtma adım takip bir sütun yıkama gösteren. Histon ayıklama kere ne olursa olsun, hangi 15 dk, (B) 2 h,(a)olduğunu veya (C) 24 h, nonhistone proteinler düşük miktarda vardı sadece ilk yıkama histonebinding sütununda. Histon proteinleri devamsızlık saatlerinizi içinde tüm yıkar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: BV2 hücrelerden histon arıtma adım takip elutions gösteren temsilcisi Coomassie parlak mavi lekeli jel. (A)yüksek kaliteli saflaştırılmış ve desalted histon H3 ve H4 ilk elüsyon histon arıtma sütundan sonra algılandı. (B) ikinci elüsyon histon arıtma üzerinden sütun bir yüksek kaliteli veya histon H3 veya H4 miktarı vermemiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: geniş HDAC rol inhibitörü, tributyrin, farelerde vahşi-tip tüm beyin H4K12 asetilasyon artırır. (A)Bu panel gösterir bir temsilcisi Batı ham histon H4K12 asetilasyon artış ayıklamak leke gösteren toplanan--dan geniş oyunculuk HDAC yanıt olarak farelerde vahşi-tip tüm beyin inhibitörü, tributyrin. (B) Bu panel H4K12 asetilasyon içinde vivoiçinde miktar artış gösterir. Unpaired t-test grupları karşılaştırmak için kullanılan (t(6) 6.076, P = 0.0005 =). Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya (SEM) gösterir. N = 8. P < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Ben ve IIB HDAC inhibitörü, M344, artırır Üçlü transgenik Alzheimer hastalığı prefrontal korteks H4K12 asetilasyon Sınıf (3 x Tg-reklam) fareler. (A)Bu panel gösterir bir temsilcisi Batı H4K12 asetilasyon arıtılmış olarak artış gösteren leke ve desalted histon özü toplanan 3 yanıt-e doğru HDACs inhibisyonu farelerde Tg-reklam x prefrontal korteks üzerinden tarafından M344. (B) Bu panel yanıt M344 10 mg/kg günlük doz dört ay boyunca idare olarak miktar H4K12 asetilasyon artış gösterir. Unpaired t-test grupları karşılaştırmak için kullanılan (t(6) 13.30, P = < 0.0001). Çubuklar gösterir ortalama ± SEM N = 8. P < 0,00001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: selektif HDAC3 inhibitörü RGFP-966, H3K27 asetilasyon BV2 mikroglial hücrelerde artar. (A) Bu panel gösterir H3K27 asetilasyon saflaştırılmış ve desalted histon özü bir artış gösteren temsili bir Batı leke yanıt HDAC3 inhibisyon olarak BV2 hücrelerden RGFP-966 tarafından toplanan. (B) RGFP-966 neden olur bir asetilasyon histon H3 ve lizin (K) 27 24 saat sonra tedavi yaklaşık iki kat artması. Unpaired t-test kontrol tedavi karşı hücreleri karşılaştırmak için kullanılan (t(4) = 5.981, P = 0,002). Çubuklar gösterir ortalama ± SEM N = 6. P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Temsilcisi doku (bir yarımküre) * | Ortalama doku ağırlığı (mg) | Ayıklama arabellek (mL) | Vuruş sayısı |
| Fare beyincik | 40 | 1 | 40 |
| Fare frontal korteks | 30 | 0,3 | 20 |
| Farenin hipokampus | 27 | 0,3 | 18 |
| Fare entorhinal korteks | 19 | 0,3 | 17 |
| * Tüm deneylerin yetişkin erkek fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. | |||
| Ortalama Yaş: 16 ay. Ortalama ağırlık: 30 gram. | |||
Tablo 1: Beyin doku homojenizasyon için en iyi duruma getirilmiş durumda.
Discussion
Geçerli çalışma, çekirdek histon proteinleri arındırmak ve histon H3 ve H4 PTMs (Örneğin, asetilasyon) ölçmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem gösterdi. Sunulan protokoldür hücreleri ve beyin dokusu hazırlık, ham histon arıtma ve detaylı histon yağış, elüsyon ve tarafından takip edilmektedir miktar ile ilgili yordamları içerir kapsamlı bir iş akışı optimize histon Elektroforez ve sağlam histon PTM miktar. Burada sağlanan ayrıntılar büyük miktarda histon örnekleri uzun işlemler için ihtiyaç rağmen yüksek kaliteli veri yinelenebilir bir nesil sağlar.
Birçok Şu anda yayımlanmış protokolleri HPLC histon H3 ve H419saf kesirler yalıtmak için kullanılmasını gerektirir. HPLC güçlü bir teknik olmasına rağmen onun karmaşıklığı ve düşük işlem hacmi çoğu moleküler biyolog ve nonexperts üzerinden sık kullanımı caydırmak. Nitekim, HPLC birçok labs ile mevcut değildir ve yüksek vasıflı personel araç çalıştırmak için gereklidir. HPLC, pahalı, zaman alıcı ve potansiyel olarak tehlikeli Oftentimes. Burada sunulan HPLC atlar benzer kalitede sonuçlar elde etmek için ucuz, orta-den geçerek bir stratejidir. Özel araç operasyon beceri gerektirmez bir basit spin sütun yaklaşım kullanır olarak bildirilen de daha pratik ve hemen hemen her laboratuvar kullanım için uygun stratejidir. Ayrıca, histon H3/H4 tetramer tek, saf ve her proteinlerin korunmuş PTMs güvenilir bir miktar etkinleştirme bol kesir olarak elde edilir.
PTMs oksidatif stres ve pH20,21değişimler değişikliklere son derece duyarlıdır. Böylece, daha önce yayımlanmış yöntemleri18aksine, biz serum-ücretsiz medya hücrelerin en az bir metabolik bozukluğu, serum bileşenleri ile yerel PTMs girişim önlemek üzere hücrelerde durulama etkin bir strateji raporu. Geçerli protokol sadece geleneksel çekirdek yalıtım atlar ama aynı zamanda hücre lizis ve nükleer toplama kaçınırken nükleer zarf korunması için sağlar tam doku homojenizasyon işlemi için en iyi kat sağlar. Ayıklama zaman hücreleri, kullanılan hücre tipi, doku boyutu, vbsayısına göre manipüle edilebilir olsa da, çekirdek ve DNA yayın, örnek ele zorlaştırır lizis yol açabilir gibi genişletilmiş lizis arzu değil. Önemlisi, protokol içinde birden çok denetim noktaları başarılı histon arıtma (Örneğin, adım 2.7 ve 3.2.3) doğrulamak için mevcut. Bu strateji aynı zamanda uzun yordamı sorun giderme kolaylaştırır.
Başka bir önemli ve benzersiz sunulan protokolü aşağı akım Batı leke analiz araçları ve diğerleri ile tam uyumluluk çok istenirse özelliğidir. Histon proteinleri ~ 15 kDa13,22,23 , algılanır ve benzer şekilde diğer küçük molekül ağırlıklı proteinler için standart immunoblotting teknikleri tarafından tespit etmek zor kanıtlanmıştır. Protein yerel onay (SDS yokluğunda) ve faaliyet yokluğunda SDS ve yüksek transfer verimi, bakım için en iyi çözünürlük protein jelleri ile birlikte yüksek performanslı ve yüksek işlem hacmi transfer sistemi kullanımı sağlar düşük moleküler ağırlıklı histon proteinleri böylece güvenilir histon PTM miktar güvence verdi.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Florida Bölümü Sağlık Ed ve Ethel Moore Alzheimer araştırma programı (hibe 6AZ08 ve 7AZ26), NIH NIAAA (grant 5R01AA023781-03) ve Amerikan Kalp Derneği (grant 17PRE33660831) onların şükranlarını.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
| Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
| 70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
| 100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
| pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
| 4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
| Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
| 1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
| Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
| Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
| Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
| Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
| Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
| Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
| Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
| SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
| Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
| Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
| 100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
| H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |
References
- Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
- DeWoskin, V. A., Million, R. P.
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
- Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
- Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
- Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
- Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
- Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
- Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
- Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
- Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
- Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
- Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
- Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F.
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
- Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
- Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
- Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).
