Summary
Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.
Abstract
In alle eukaryote organismen is chromatine, de fysiologische sjabloon van alle genetische informatie, essentieel voor de erfelijkheid. Chromatine is onderworpen aan een aantal uiteenlopende posttranslationele modificaties (PTMs), die meestal optreden in de amino termini van Histon eiwitten (d.w.z., histone staart) en regelen van de toegankelijkheid en de functionele status van de onderliggende DNA. Histon staarten uitbreiden vanuit de kern van de nucleosoom en zijn onderworpen aan de toevoeging van acetylgroepen door Histon acetyltransferases (hoeden) en de verwijdering van acetylgroepen door Histon deacetylases (HDACs) tijdens de cellulaire groei en differentiatie. Specifieke acetylation patronen op lysine (K) residuen op Histon staarten bepalen een dynamische homeostase tussen transcriptionally actieve of transcriptionally onderdrukte chromatine door (1) beïnvloeden de kernmodule histone en (2) werven synergetische of antagonistische chromatine-geassocieerde eiwitten aan de transcriptie-site. De fundamentele reguleringsmechanisme van de complexe aard van Histon staart PTMs beïnvloedt de meerderheid van de chromatine-templated processen en resultaten in wijzigingen in cel rijping en differentiatie in zowel normale als pathologische ontwikkeling. Het doel van het onderhavige verslag is bedoeld als beginners met een efficiënte methode voor het zuiveren van core Histon proteïnen van cellen en hersenweefsel en te kwantificeren betrouwbaar acetylation merken op histonen H3 en H4.
Introduction
De term epigenetica verwijst naar erfelijke veranderingen in activiteit van de gene die onafhankelijk optreden van veranderingen in de DNA volgorde1,2. Gene transcriptie en repressie steigerwerk eiwitten zijn bepaald door (1) de toegankelijkheid van de chromosomale DNA gewikkeld rond een octamer van core Histon eiwitten (twee exemplaren van elk van de H2A, H2B, H3 en H4) en (2) de beschikbaarheid van transcriptiefactoren gerekruteerd om specifieke promotor sites3,4. Gene transcriptie wordt geregeld door het enzym-gemedieerde wijzigingen van specifieke DNA promotor sites en de PTMs van Histon staarten5,6,7. De N-termini van Histon H3 en H4 behoren tot de meest geconserveerde sequenties in eukaryote organismen3bekend en hun posttranslationele modificaties zijn uitgebreid gedocumenteerd te spelen een centrale rol bij het bepalen van de structuur van de chromatine en functie8,9. PTMs op de Histon staarten (dat wil zeggen, acetylation, methylering, fosforylatie en ubiquitination) wijzigen het potentieel van de interactie van de staarten, invloed hebben op de structurele staat en vouwen van chromatine vezel, en daarmee het reguleren van DNA toegankelijkheid en4,10,11,12te verwerken. Acetylgroepen worden toegevoegd aan of verwijderd uit K residuen op Histon staarten door een aantal specifieke Histon-interactie epigenetische enzymen, namelijk hoeden en HDACs, respectievelijk13. Bijvoorbeeld, heeft de acetylation van Histon H4 aan lysine 12 (H4K12ac) eerder is aangetoond dat het activeren van de transcriptie van genen aan geheugen verwerving en consolidatie14gerelateerde. Bovendien stellen verscheidene lijnen van bewijsmateriaal voor dat de enzym-gemedieerde epigenetische controle van gene transcriptie een cruciaal aspect van gezonde cellulaire groei en differentiatie6,15 is. Afwisseling in de Epigenetische regulatie van de genexpressie, epigenetische aanpassingen van DNA of door een mutatie van de epigenetische enzymen zelf, heeft aangetoond dat dysregulated in ziekten van de mens waar verandering in de activiteit van een bepaald gen een kenmerk is van de pathologie (bijvoorbeeld, kanker)6,16,17. Dus, de beoordeling van wijzigingen in de kern Histon PTMs is in opkomst als een hoge waarde doelwit voor potentiële therapeutische interventies. Echter, bepalen de overvloed, interagerende partners, en de specifieke rol van histones PTMs bewezen uitdagende18.
In het onderhavige verslag, wordt een geoptimaliseerde, medium-doorvoer strategie om te zuiveren van core histonen van cellen en weefsels van de hersenen in een enkele fractie, en een volledige protocol voor de kwantificering van histones H3 en H4 PTMs beschreven. Van de nota, hoewel op dit moment gepubliceerd zuur gebaseerde zuivering technieken en Histon antilichaam gebaseerde detectie strategieën zijn wijd goedgekeurd voor Histon karakterisering, ze missen beschrijvende informatie over kritische stappen van de procedure, dus een belemmering vormen snel en repliceerbaar Histon extractie en kwantificering. Bijvoorbeeld, de verwerking van cel extraheren en weefsel biopsieën vereist verschillende tools en technologieën voor succesvolle extractie. Bovendien toont het geoptimaliseerde protocol gepresenteerd in het huidige manuscript aan een praktische, medium-doorvoer aanpak. Kern histonen uitgepakt als een enkelvoudige, pure breuk, waarmee betrouwbare downstream antilichaam-gemedieerde PTM detectie zonder enige inmenging van onzuiverheden. Bovendien, in het huidige manuscript, de uitdagingen met betrekking tot Histon detectie door hun geringe moleculaire gewicht hebben omzeild. Typisch, het gebrek aan compatibiliteit tussen zuivering, kwantificering en protocollen van de Elektroforese van het gel verhinderen wetenschappers repliceerbaar en afdoende resultaten te verkrijgen. Hier, wordt een geoptimaliseerde workflow te zuiveren van core histonen van cellen en weefsel en bereiden hen voor downstream PTM analyses via westelijke vlek gepresenteerd.
De zuivering van core Histon eiwitten met behoud van hun oorspronkelijke posttranslationele modificaties (dat wil zeggen, acetylation, methylering en fosforylering) kunnen via het huidige protocol. Figuur 1 toont de tijdlijn van het protocol van de reiniging van Histon.
Protocol
Alle muizen werden gehuisvest in een vocht - en temperatuurregeling, AAALAC-geaccrediteerde dier faciliteit aan de Universiteit van Miami Miller School of Medicine. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Miami Miller School van geneeskunde institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en uitgevoerd volgens de specificaties van de NIH.
1. bereiding van het monsterextract
-
Adherente cellen
- De cellen van de plaat in 10 cm gerechten in de geschikte kweekmedia (1 x 10,6 tot en met 1 x 109 cellen per schotel voor cellijnen, zoals BV2, HEK-293, en SH-SY5Y, maar ~ 1 x 1015 cellen per schotel voor primaire cellen, bijvoorbeeld primaire corticale neuronen). Verzekeren dat de cellen gelijk verdeeld over het gehele oppervlak van de plaat en de cellen groeien gedurende 48 uur te bereiken van ~ 100% samenvloeiing (37 ° C, 5% CO2) toestaan.
- Zodra de cellen hebben bereikt de gewenste confluentie, zachtjes de voedingsbodems gecombineerd en wassen van de cellen 2 x met voorverwarmde serumvrij media onder de motorkap van een weefselkweek.
- De serum-vrije media van de schotel gecombineerd en voeg 1 mL ijskoud extractie buffer (0.4 M zwavelzuur, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] en 1 x proteaseinhibitor cocktail) aan elk gerecht.
- Gebruik een plastic cel schraper voor het verzamelen van alle cellen in de winning-buffer (door schrapen) en overbrengen naar een 1,5 mL label buis met een 1.000 µL pipet. Pipetteer de cellen op en neer van 3 x tot het vergemakkelijken van homogenisering.
- Sluit alle buizen en leg ze direct op ijs.
-
Hersenweefsel
- Als bevroren weefsel wordt gebruikt, plaats het weefsel in een tube prechilled 1,5 mL en kort het ontdooien op ijs. Als verse weefsel wordt gebruikt, gaat u onmiddellijk naar stap 1.2.2.
Opmerking: Het huidige protocol beschrijft procedures met behulp van bevroren muis hersenen en muis prefrontale cortex monsters. - Meng het weefsel met behulp van een handbediende Dounce homogenizer met behulp van de juiste hoeveelheid extractie buffer en het aanbevolen aantal slagen (tabel 1). Om te voorkomen dat buitensporige chromatine Shredder, overschrijd niet het aantal aanbevolen slagen.
- Met behulp van een enkel kanaal 1.000 µL precisiepipet, overbrengen in het homogenaat een prechilled 1,5 mL-buis. Sluit alle buizen en leg ze direct op ijs.
- Als bevroren weefsel wordt gebruikt, plaats het weefsel in een tube prechilled 1,5 mL en kort het ontdooien op ijs. Als verse weefsel wordt gebruikt, gaat u onmiddellijk naar stap 1.2.2.
2. bereiding van het Extract van de ruwe Histon
- Plaats van de 1,5 mL tubes met de cellen of weefsel geschorst in extractie buffer op een roterend platform en 15 rpm bij 4 ° C tot de winning van ruwe histonen laat draaien.
Opmerking: De extractie tijd kan variëren voor verschillende cel en weefseltypes (HLA) en voor iedere procedure moet worden geoptimaliseerd. Het huidige protocol presenteert resultaten na 15 min, 2 h en 24u van extractie (Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5). - Prechill van de microcentrifuge tot 4 ° C. Nadat de gewenste extractie tijd is verstreken, centrifugeer de buizen op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof met inbegrip van de ruwe histonen tot een nieuwe, prechilled 1,5 mL koker overbrengen. Gooi de pellet.
- Bewaar het supernatant bij-80 ° C (de extractie kan worden gestopt bij deze stap, zie "Stop step" in Figuur 1) of direct doorgaan naar de volgende stap.
- Neutraliseren van de ruwe histonen met een volume van 1/4 van de 5 x neutralisatie buffer (b.v., voeg 250 µL van 5 x neutralisatie buffer tot 1 mL van ruwe histones). Meng goed door pipetteren op en neer 6 x.
- Controleer de pH van het mengsel met pH strips. Dienovereenkomstig aan te passen door het toevoegen van meer neutralisatie buffer te bereiken een pH van 7.
- Evalueren van de aanwezigheid van Histon en nonhistone eiwit in de ruwe Histon extract als volgt (Figuur 2).
- Toevoegen van 37,5 µL van het monster aan 12,5 µL van 4 x (Laemmli) monster buffer en denatureren gedurende 10 minuten bij 99 ° C.
- Het monster op een SDS-pagina gel laden en uitvoeren van de gel gedurende 1 uur bij 100 V.
- Vlekken van de gel's nachts met de kleurstofoplossing Coomassie briljant blauw R-250 en destain gedurende drie opeenvolgende wast (1 h/afwas) met Coomassie briljant blauw R-250 destaining oplossing.
Opmerking: Ruwe histonen (Figuur 2) kunnen worden vergeleken met geëlueerd en gezuiverde histonen (d.w.z., kolominvoer [figuur 5A]).
3. de zuivering van Core Histones
-
Kolom evenwichtsinstelling spin
- Voeg 500 µL van evenwichtsinstelling buffer aan elke spin kolom wordt gebruikt. Raak niet de kolom-membraan.
- Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 min op 800 x g. Gooi de doorstroming. Herhaal 1 x.
-
Histon zuivering
- 500 µL van het monster van belang uit stap 2.6 toevoegen aan de kolom. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 min op 800 x g. Verzamel de doorstroming.
- Herhaal de vorige stap zo vaak als nodig voor het laden van het gehele monster op de kolom. Niet overvol de spin-kolom.
- Combineer de doorstroom van elke stap van het centrifugeren voor het analyseren van de kolom-bindende efficiëntie (Figuur 3).
- Volg stap 2.7 voor het analyseren van de kolom doorstroming.
-
Kolom wassen
- 500 µL van de buffer wassen aan elke kolom toevoegen. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 min op 800 x g. Verzamel de doorstroming wassen (wash #1).
- Herhaal stap 3.3.1 voor een totaal van drie wast. Verzamel wast de doorstroming #2 en #3. De opeenvolgende kolom doorstroomtest wast niet het zwembad.
- Als u wilt verder evalueren van de kolom Histon-bindende efficiëntie, analyseren de drie kolom wasbeurten door stap 2.7 (Figuur 4).
-
Histon elutie
- Breng de kolom in een nieuwe gelabelde 1,5 mL-buis.
- Voeg 50 µL van de Histon elutie buffer. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 min op 800 x g. Sla de doorstroming met Histon eiwitten.
- Voor een extra elutie, herhaalt u stap 3.4.2. Combineer het niet de eerste en tweede doorstroomtest eluaten zoals ze in Histon hoeveelheid en zuiverheid verschillen.
4. neerslag van Core Histones
- Perchloorzuur (PCA) toevoegen aan de gezuiverde histonen om een eindconcentratie van 4% PCA (b.v., voeg 3 µL van 70% PCA naar 50 µL van gezuiverde histonen uit stap 3.4.2.
- Centrifugeer gedurende 3 s voor het verzamelen van alle resterende vloeistof van de buiswand. Meng door pipetteren op en neer 6 x.
- Plaatsen van de buizen in een rek en incubeer gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- De volgende dag, prechill een microcentrifuge tot 4 ° C en centrifugeer de monsters gedurende 75 minuten op maximale snelheid bij 4 ° C.
- Na het centrifugeren voltooid is, zal een kleine witte pellet met neergeslagen histonen zichbaar op de onderkant van de buis. Doen niet vortex het monster.
- Zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd en, zonder verstoring van de pellet, voeg 500 µL van ijskoude 4% partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst aan het monster.
- Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten op maximale snelheid. Zorgvuldig gecombineerd het supernatant.
- Herhaal stap 4.7 2 x.
- Zonder de pellet te verstoren, voeg 500 µL van ijskoude aceton. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten op maximale snelheid. Zorgvuldig gecombineerd het supernatant.
- Herhaal stap 4.9 2 x.
- Zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd, laat de afgetopte buizen en het monster aan het drogen op het ijs voor 30 min. Check als alle resterende aceton is verdampt.
- Laat de buizen afgetopte en toestaan dat de steekproef te drogen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 30 µL van steriel water. Doen niet Pipetteer omhoog en omlaag. Flick de tube zachtjes met een vinger.
- Alle buizen van het GLB en laat de histonen te reconstrueren op ijs gedurende 30-50 minuten, afhankelijk van de grootte van de pellet. Controleer als de pellet is geresuspendeerde.
- Alle buizen van het GLB en laat de pellet te verder resuspendeer op RT gedurende 5 minuten.
Opmerking: Deze oplossing (eerste en tweede elutie uit stap 3.4.3) bestaat uit gezuiverde en ontzout histonen en kan worden gebruikt voor verdere kwantificering en Histon acetylation analyse.
5. kwantificering van geëlueerd Histone eiwitten
- Het gebruik van een spectrofotometer volgens protocol van de fabrikant te kwantificeren van de totale Histon eiwitten verkregen na de definitieve elutie in stap 4.15. Meet de extinctie op 230 nm. Het opnemen van de A260/A280 verhouding indicatieve van de verontreiniging van de steekproef met de nucleïnezuur.
- Gebruik de volgende formule voor het berekenen van de concentratie van Histon (x):
OD is hier de extinctie gemeten bij A230 nm. - Een Histon concentratie van ~1.5 mg/mL wordt beschouwd als een gemiddelde opbrengst van cellijnen, terwijl een Histon concentratie van ~5.0 mg/mL wordt beschouwd als een gemiddelde opbrengst voor 30 mg van weefsel.
6. westelijke vlekkenanalyse
- De gezuiverde en geëlueerd Histon uit stap 4.15 tot ~ 10 µg Histon/eiwitSteekproef aanpassen.
- Voeg de juiste hoeveelheid water en 4 x Laemmli monster buffer aan te passen van de volumes laden.
- Denatureren van de monsters gedurende 10 minuten bij 99 ° C. Koel ze op ijs. Centrifugeer gedurende 3 s voor het verzamelen van alle resterende vloeistof en condensatie van de buiswand.
- De steekproeven op een gel voor SDS-pagina laden en uitvoeren van de gel gedurende 1 uur bij 100 V.
- Om te visualiseren totale Histon eiwit, vlek de gel's nachts met de kleurstofoplossing Coomassie briljant blauw R-250 en destain gedurende drie opeenvolgende wast (1 h/afwas) met Coomassie briljant blauw R-250 destaining oplossing.
Opmerking: De eerste elutie van Histon eiwitten bevat hoogwaardige histonen (figuur 5A), terwijl de tweede elutie weinig tot geen niveaus van histones (figuur 5B bevat). - Om te kwantificeren Histon PTMs, een overdracht systeem te gebruiken (Zie Tabel van materialen) de Histon proteïne van de SDS-pagina gel (stap 6.4) op een membraan PVDF overzetten.
- Om te assembleren de overdracht sandwich, open de overdracht systeem cassette en plaats van de PVDF membraan stack (geëtiketteerd als bodem +) aan de onderkant van de cassette met de membraan naar boven. Rol het membraan zachtjes met een roller van de vlek te verwijderen lucht tussen de stack en het membraan.
- Leggen van de gel op de top van het membraan, roll de gel zachtjes met een roller van de vlek te verwijderen lucht tussen het membraan en de gel en de bovenste stapel op de gel te plaatsen. Roll weer zachtjes en plaats de cassette cover op de top van de sandwich, druk stevig en draai het nob rechtsom te vergrendelen.
- Plaats de cassette aan de overdracht systeem slot. Selecteer op het scherm van het apparaat, Turbo Protocol. Gebruik een protocol 3 min voor een enkele mini gel of een protocol 7 min voor meer dan twee mini gels.
- Vlekken van het membraan met Ponceau S vlek voor 5 min en visualiseren van de totale Histon eiwitten.
- Was ze in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 voor 2 h en blokkeren ze in 5% melk voor 1 h. Incubate met primaire en secundaire antilichaam (overnachting bij 4 ° C of 1 h op RT, respectievelijk) of volgens een eerder geoptimaliseerd protocol.
Opmerking: In het huidige protocol, antilichamen tegen geacetyleerd histonen H4K12 (Figuur 6 en 7 van de figuur) en H3K27 (Figuur 8) werden gebruikt.
Representative Results
Ter illustratie van de progressie van het protocol van de reiniging histone en samenstelling van alle geanalyseerde breuken, we geëvalueerd verschillende Histon fragmenten van menselijke microglial BV2 cellen. We hebben gebruikt om aan te tonen de kwantificering van histones H3 en H4 PTMs (d.w.z., acetylation), hersenen weefsel lysates.
BV2 cellen waren uitplaten aan 5 x 106 cellen per schotel in 10 cm Weefselkweek behandeld gerechten en toegestaan om te groeien naar confluentie voor 48 h. cellen werden dan verzameld en histonen werden uitgebracht van chromatine door een incubatie in extractie buffer met 0,4 M zwavelzuur, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) en 1 x proteaseinhibitor. De extractie tijd, tussen 15 minuten en 24 uur per dag, heeft geen invloed op de algehele samenstelling van ruwe Histon extracten zoals bepaald door Coomassie briljant blauw kleuring (Figuur 2). Volgende, ruwe histonen waren doorgegeven door de geëquilibreerd Histon kolommen en de doorstroming was geanalyseerd. Kolom-bindende hoogrenderende wordt bepaald door het ontbreken van Histon eiwit in de doorstroom wanneer geanalyseerd door Coomassie briljant blauw kleuring. Wij zijn vastbesloten de kolom-bindende efficiëntie op 100% want er geen detecteerbare Histon eiwitten aanwezig in de geanalyseerde doorstroming (Figuur 3 waren). Alle membranen met afhankelijke histonen waren dan drie keer gewassen met was buffer te verwijderen van alle resterende onzuiverheden, waardoor enige Histon eiwitten gebonden aan de silicagel. Wij vastbesloten dat voor alle Histon extractie tijden (dat wil zeggen, 15 min, 2 h en 24u), de eerste membraan wassen de belangrijkste was te verwijderen nonhistone verontreinigingen uit de kolommen, terwijl de tweede en derde wast heeft geen invloed op de zuiverheid van de steekproef. Dus, afhankelijk van het type van de steekproef, de laatste twee wasbeurten kunnen worden weggelaten. Na de eerste elutie van Histon proteïne van de kolom (met behulp van elutie buffer met 1mM NaCl en EDTA), histonen werden neergeslagen 's nachts met 4% perchloorzuur Ingehuld, gewassen en geanalyseerd voor de verrijking van gezuiverde histonen H3 en H4. We hebben vastgesteld dat 24u van extractie tijd verhoogt de hoeveelheid H3 en H4 histonen in de gezuiverde fractie in vergelijking met de 15 min en 2 h van extractie tijd (figuur 5A). De tweede elutie uit de kolom niet resulteren in hoge kwaliteit of high-hoeveelheid histonen (figuur 5B).
Vervolgens hebben we gebruikt homogenates weefsel de hersenen te kwantificeren Histon H3 en H4 PTMs, namelijk acetylation. Wild-type (C57BL6/J) mannelijke muizen werden toegediend een globaal handelen HDAC-inhibitor (tributyrin) bij een dosis van 5 g/kg oraal voor 3 d. geheel-hersenen weefsel werd verzameld op dag 4 en ruwe histonen volgens het protocol beschreven werden gehaald. Met behulp van een ongepaard t-test, wij vastbesloten dat tributyrin verhoogt de acetylation van histones in het ruwe extract (t(6) = 6.184, P = 0.0004); onzuiverheden worden echter gedetecteerd in het extract (de Histon bands niet duidelijk zijn gedefinieerd). H4K12ac antilichaam hoeft dus niet een hoge specificiteit (Figuur 6). Voor verdere evaluatie van de toepasselijkheid van het gepresenteerde protocol bij kleinere weefselsecties, we verzameld de prefrontale cortex triple transgene de ziekte van Alzheimer (3 x GS-AD) muizen behandeld dagelijks met 10 mg/kg M344, een klasse I en IIb HDAC-inhibitor, voor vier maanden. Histon zuivering en neerslag werd uitgevoerd volgens het protocol van de hierin beschreven. Met behulp van de gezuiverde Histon H3 en H4 breuk, wij vastbesloten dat M344 H4K12 acetylation 2.4-fold verhoogt (t(6) 13.03, P = < 0.0001), met een hoge specificiteit van H4K12ac antilichaam (Figuur 7). Ook zien we een toename van Histon H3 acetylation in BV2 cellen in reactie op een ander HDAC-inhibitor, namelijk de selectieve HDAC3 remmer, RGFP-966. 10 µM van RGFP-966 oorzaken een ongeveer tweeledig verhoging van acetylation bij Histon H3K27 na 24 h behandeling. Student de ongepaarde t-test werd gebruikt om te vergelijken control versus behandeld cellen.
Figuur 1: tijdlijn van het protocol van de reiniging van Histon. Alle stappen voor Histon analyses worden hieronder weergegeven samen met de geschatte tijd die nodig is voor elke stap. Cijfers die het resultaat van bepaalde stappen en ingediend binnen het manuscript worden haakjes aangeduid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger Coomassie briljante blauw-gekleurde gel demonstreren ruwe histonen BV2 cellen is onttrokken. BV2 cellen werden gekweekt voor 48 uur voordat het protocol van de extractie van Histon begon. Ruwe histonen werden gehaald voor 15 minuten, 2 h en 24 h, met drie replicatieonderzoeken voor elk punt van de tijd (dit is ook het geval in Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5). Zowel nonhistone als Histon eiwitten zijn aanwezig in het ruwe Histon extract. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger Coomassie briljante blauw-gekleurde gel demonstreren kolom doorstroomtest volgende Histon zuivering stappen uit BV2 cellen. Na ruwe Histon passeren de Histon bindende kolom, zijn alleen nonhistone eiwitten aanwezig in de doorstroming. Histon eiwitten afwezig zijn in deze fractie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger Coomassie briljante blauw-gekleurde gel aan te tonen een kolom wassen na een zuivering Histon uit BV2 cellen. Ongeacht de Histon extractie times waren die waren (A) 15 min, (B) 2 h, of (C) 24u, lage hoeveelheden nonhistone eiwitten alleen huidig in de kolom van de eerste-wassen histonebinding. Histon eiwitten afwezig waren in alle wast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vertegenwoordiger Coomassie briljante blauw-gekleurde gel aan te tonen elutions na een zuivering Histon uit BV2 cellen. (A) kwalitatief hoogwaardige gezuiverd en ontzout Histon H3 en H4 geconstateerd na de eerste elutie uit de kolom Histon zuivering. (B) de tweede elutie van de zuivering Histon kolom opbrengst niet een hoge kwaliteit of kwantiteit van histones H3 of H4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: de in grote lijnen handelend HDAC verhoogt remmer, tributyrin, H4K12 acetylation in de hele hersenen van wild-type muizen. (A) dit paneel toont een vertegenwoordiger westelijke vlek beeltenis van een stijging van H4K12 acetylation in de ruwe Histon extract verzameld uit het hele brein van wild-type muizen in reactie op de in grote lijnen waarnemend HDAC-inhibitor, tributyrin. (B) dit paneel toont de kwantificering van de toename in H4K12 acetylation in vivo. Ongepaarde t-test werd gebruikt voor het vergelijken van groepen (t(6) = 6.076, P = 0.0005). De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). N = 8. P < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: de klasse I en IIb HDAC-inhibitor, M344, verhoogt H4K12 acetylation in de prefrontale cortex triple transgene de ziekte van Alzheimer (3 x GS-AD) muizen. (A) dit paneel toont een vertegenwoordiger westelijke vlek beeltenis van een stijging van H4K12 acetylation in de gezuiverde en ontzout Histon extract verzameld van de prefrontale cortex van 3 x GS-AD muizen in reactie op de remming van HDACs door M344. (B) dit paneel toont de kwantificering van de toename van H4K12 acetylation in antwoord op M344 op een dagelijkse dosis van 10 mg/kg toegediend voor vier maanden. Ongepaarde t-test werd gebruikt voor het vergelijken van groepen (t(6) 13.30, P = < 0.0001). De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de SEM. N = 8. P < 0,00001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: de selectieve remmer van de HDAC3, RGFP-966, verhoogt H3K27 acetylation in BV2 microglial cellen. (A) dit paneel toont een representatieve westelijke vlek beeltenis van een stijging van H3K27 acetylation in het extract gezuiverd en ontzout Histon verzameld uit BV2 cellen in reactie op de remming van HDAC3 door RGFP-966. (B) RGFP-966 veroorzaakt een ongeveer tweeledig verhoging van acetylation bij Histon H3 en lysine (K) 27 na 24 h behandeling. Ongepaarde t-test werd gebruikt om te vergelijken control versus behandeld cellen (t(4) = 5.981, P = 0.002). De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de SEM. N = 6. P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Representatieve weefsel (een halfrond) * | Gemiddelde weefsel gewicht (mg) | Extractie Buffer (mL) | Aantal slagen |
| Muis cerebellum | 40 | 1 | 40 |
| Muis frontale cortex | 30 | 0.3 | 20 |
| Muis hippocampus | 27 | 0.3 | 18 |
| Muis Entorinale cortex | 19 | 0.3 | 17 |
| * Alle experimenten werden uitgevoerd bij volwassen mannelijke muizen. | |||
| Gemiddelde leeftijd: 16 maanden. Gemiddelde gewicht: 30 gram. | |||
Tabel 1: Geoptimaliseerde voorwaarde voor hersenen weefsel homogenisering.
Discussion
In het huidige werk toonden we een geoptimaliseerde methode om te zuiveren van core Histon eiwitten en kwantificeren van Histon H3 en H4 PTMs (bijvoorbeeld, acetylation). Het gepresenteerde protocol is een uitgebreide workflow waarin geoptimaliseerd procedures met betrekking tot cellen en hersenen weefsel voorbereiding, ruwe Histon zuivering en gedetailleerde Histon neerslag, elutie en kwantificering, die worden gevolgd door Histon elektroforese en robuuste Histon PTM kwantificering. De grote hoeveelheid gegevens verstrekt hier voorziet in een repliceerbare generatie hoogwaardige gegevens, ondanks de behoefte aan langdurige manipulaties van de Histon monsters.
Veel van de momenteel gepubliceerde protocollen vereisen het gebruik van HPLC te isoleren van pure breuken van histones H3 en H419. Hoewel HPLC een krachtige techniek is, afschrikken de complexiteit en de lage-doorvoer meeste moleculaire biologen en nonexperts van het frequente gebruik. Inderdaad, HPLC is niet beschikbaar voor vele labs, en hoogopgeleide personeel is verplicht tot het bedienen van het instrument. HPLC is vaak tijdrovend, duur en mogelijk gevaarlijk. Hier gepresenteerd is een goedkope, medium-doorvoer strategie te bereiken resultaten van vergelijkbare kwaliteit die HPLC mijdt. De gerapporteerde strategie is ook praktischer en geschikt voor gebruik in vrijwel elk lab aangezien het gebruikt een eenvoudige draai kolom aanpak die geen gespecialiseerde instrument operatie vaardigheden vereist. Bovendien, wordt histone H3/H4 tetrameer gewonnen als een single, zuiver, en overvloedige breuk, waardoor een betrouwbare kwantificering van bewaarde PTMs op elk van de eiwitten.
PTMs zijn zeer gevoelig voor veranderingen in de oxidatieve stress en veranderingen in de pH20,21. Dus, in tegenstelling tot de eerder gepubliceerde methoden18rapporteren we een efficiënte strategie voor het spoelen van de cellen in serumvrij media om een minimale metabole verstoring van de cellen en om te voorkomen dat de inmenging van de inheemse PTMs met serum componenten. Het huidige protocol niet alleen mijdt de traditionele kernen isolatie maar ook optimale inschakelvertraging voor lysis van de cel en de exacte weefsel homogenisering procedure die het mogelijk voor het instandhouden van de nucleaire envelop maakt terwijl het vermijden van nucleaire aggregatie. Hoewel de extractie tijd kan worden gemanipuleerd op basis van het aantal cellen, het celtype wordt gebruikt, het weefsel grootte, etc., is uitgebreide lysis niet wenselijk als het zou kunnen tot de lysis van de kernen en DNA release leiden, waardoor het monster moeilijk te behandelen. Nog belangrijker is, bestaan meerdere controlepunten binnen het protocol voor de validatie van succesvolle Histon zuivering (b.v., stap 2.7 en 3.2.3). Deze strategie vergemakkelijkt ook gedurende de lange procedure oplossen.
Een ander belangrijk en uniek kenmerk van het gepresenteerde protocol is haar volledige compatibiliteit met downstream, westelijke vlek analysetools en anderen, indien gewenst. Histon eiwitten worden gedetecteerd op ~ 15 kDa13,22,23 en ook aan andere kleine molecuulgewicht eiwitten, hebben bewezen uitdagend om te detecteren met standaard immunoblotting technieken. Het gebruik van een high-performance en high-throughput transfersysteem in combinatie met optimale resolutie eiwit gels zorgt voor het onderhoud van de inheemse bevestiging eiwit (bij het ontbreken van SDS) en activiteit in de afwezigheid van SDS en hoge spuitrendement van de laagmoleculaire bestanddelen Histon eiwitten, dus een betrouwbare Histon PTM kwantificering te verzekeren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hun dankbaarheid uitspreken aan de Florida departement van gezondheid Ed en Ethel Moore Alzheimer Research Program (subsidies 6AZ08 en 7AZ26), de NIH-NIAAA (subsidie 5R01AA023781-03) en de American Heart Association (grant 17PRE33660831).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
| Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
| 70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
| 100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
| pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
| 4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
| Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
| 1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
| Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
| Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
| Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
| Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
| Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
| Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
| Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
| SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
| Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
| Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
| 100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
| H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |
References
- Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
- DeWoskin, V. A., Million, R. P.
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
- Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
- Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
- Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
- Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
- Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
- Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
- Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
- Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
- Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
- Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
- Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F.
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
- Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
- Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
- Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).
