Summary
Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.
Abstract
Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) têm provado para ser uma ferramenta valiosa para estudar a doença e desenvolvimento humano. Mais avançando iPSCs como uma regeneração terapêutica requer um seguro, robusto e o expediente protocolo reprogramação. Aqui, apresentamos um protocolo clinicamente relevante, passo a passo para a reprogramação de fibroblastos dérmicos humanos extremamente alta eficiência em iPSCs usando uma abordagem não-integração. O núcleo do protocolo consiste em expressar fatores pluripotência (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, fusão de OCT4-MyoD) em vitro mensageiro transcrito RNAs sintetizados com modificado nucleotídeos (mRNAs modificados). Os reprogramação mRNAs modificados são transfectados em fibroblastos primários cada 48h juntamente com madura imita de microRNA-367/302 específicas de células-tronco embrionárias por duas semanas. As colônias de iPSC resultante podem ser isoladas e expandiu-se diretamente no alimentador-livre de condições. Para maximizar a eficiência e consistência do nosso protocolo de reprogramação através de amostras de fibroblasto, otimizamos a vários parâmetros, incluindo o regime de Transfeccao de RNA, sincronismo de transfections, as condições de cultura e densidades de semeadura. Importante, nosso método gera alta qualidade iPSCs da maioria das fontes de fibroblasto, incluindo amostras de doentes, envelhecidas, e/ou senescentes difícil-para-reprogramar.
Introduction
Reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) exige expressão estendida de um conjunto de factores de transcrição que são importantes na manutenção da pluripotência1,2. Ao produzir iPSCs para aplicações clínicas, é essencial que a carga mutacional nas células de entrada é minimizada durante o processamento e a eficiência da geração de iPSC é mantida a um nível relativamente elevado em amostras de pacientes. No entanto, a maioria dos métodos, incluindo protocolos de integração-livres, de reprogramação sofre muito baixas eficiências de reprogramação, qual utilidade clínica do limite dessas abordagens3. A baixa eficiência de reprogramação também pode promover a reprogramação selectiva de células com mutações preexistentes, aumentando a carga mutacional em iPSCs resultante. Além disso, todos os métodos reprogramação baseado em DNA, tais como lentivirus e epissomal-abordagens, sofrem com a preocupação de segurança que DNA aleatoriamente pode integrar o genoma e criar a oportunidade para mutagênese insercional prejudicial e indesejadas ( potencialmente oncogênicos) expressão de genes de pluripotência em tecido a jusante derivados4.
Uma abordagem promissora para alcançar a indução eficiente de pluripotência em células somáticas e reduzir a carga mutacional em iPSCs resultante é usar sintéticos tampados mensageiro RNAs contendo modificado nucleobases (mRNAs modificados) para reprogramação5. A eficiência de modificados mRNA abordagens reprogramação pode ainda ser reforçada pela adição de células-tronco embrionárias (ESC)-específico microRNAs (miRNAs)-367/302s3, que têm sido mostrados para reprogramar células somáticas com maior eficiência6 ,7. No entanto, mesmo com a adição dos miRNAs-367/302, a abordagem de reprogramação baseada em mRNA modificada frequentemente falha durante a aplicação de células recém isoladas de pacientes3. Inconsistências de endereço desta abordagem baseada em mRNA modificados, informamos recentemente uma estratégia otimizada, livre de integração que induz a pluripotência em fibroblastos humanos primários, com uma elevada taxa de sucesso e utiliza ambos os mRNAs modificados codificação reprogramação de fatores e maduro miRNA-367/302 imita8. Em nosso método, o mRNA modificados reprogramação coquetel inclui uma versão modificada do OCT4 fundido com o MyoD transactivation domínio (chamado M3O)9 e cinco outros fatores reprogramação (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A e NANOG). Combinando o mRNA modificados codificação os pluripotência fatores com a miRNA imita parecia ter um efeito sinérgico na reprogramação eficiências no presente protocolo. Otimizações adicionais do regime de Transfeccao de RNA, cela semeadura, e as condições de cultivo também eram necessárias para aumentar a eficiência de reprogramação da abordagem para um altíssimo nível8.
Ao contrário de muitos outros protocolos, nossa abordagem reprogramação normalmente requer apenas alguns milhares de fibroblastos entrados. Além disso, muitos não-integração de estratégias comuns usando epissomal plasmídeos, vírus Sendai, ou RNA auto-replicante envolvem passagem extensa para diluir o vetor de reprogramação em iPSCs gerado. Inversamente, mRNA modificados e imita miRNA maduro tem uma meia-vida curta e é rapidamente eliminadas das células. Tomados em conjunto, a quantidade de tempo de cultura celular cumulativa entre coleta de amostras de pacientes e a geração de iPSCs utilizável é mínima nesta abordagem, efetivamente limitar a acumulação de mutações em iPSCs resultante e melhorar a relação custo-eficácia.
Aqui, apresentamos o protocolo detalhado passo a passo para atingir alta eficiência reprogramação de fibroblastos humanos adultos em iPSCs usando nosso combinatória modificados mRNA/miRNA-abordagem8. Este protocolo de reprogramação RNA-based fornece um método simples, econômico e robusto para a geração de iPSCs livre de integração para pesquisa e potencial de aplicações clínicas. Além disso, é aplicável para a reprogramação de uma variedade de linhas de fibroblasto incluindo difícil-para-reprogramar, doença associada, fibroblasto envelhecido e senescente. Um esquema do protocolo para reprogramação de fibroblastos humanos é mostrado na Figura 1. O protocolo especificamente descreve um método para reprogramação três poços de fibroblastos humanos de adultos primários em um prato de formato 6-poços. Dois poços normalmente produzem um número suficiente de colônias de iPSC de alta qualidade. Em muitos casos, único bem é necessário, e o terceiro também pode ser usado para análise de eficiência de reprogramação. Se necessário, o número de poços pode ser ampliado.
Protocol
Trabalhar em condições de livre de RNase e utilizar técnicas assépticas quando possível. Execute todas as manipulações relacionadas à cultura de células em uma câmara de segurança biológica com técnicas assépticas. Siga as normas de biossegurança institucional para o trabalho com células humanas.
1. reagentes e equipamentos para preparação de reprogramação de iniciação
- Prepare os fatores modificado-mRNA cocktails codificação reprogramação.
- Siga o protocolo anteriormente publicados10 para executar em vitro transcrição, tampar e dephosphorylation procedimentos para cada mRNA modificados codificação individual fator reprogramação. Após a etapa final de purificação, Eluir o mRNA modificados com água livre de nuclease, complementar a solução de mRNA purificado modificados com 1 inibidor de RNase U / µ l, dosar os mRNAs modificados usando um espectrofotômetro e armazenar a-80 ° C por até 6 meses. Prepare várias alíquotas de cada mRNA modificado para minimizar o número de ciclos de gelo-degelo.
Nota: Protocolos semelhantes para modificados mRNA produção ter sido relataram em outro lugar5,8,11. Modelos para a transcrição em vitro podem ser gerados pela amplificação por PCR de modelos correspondentes do plasmídeo usando as primeiras demão constantes da Tabela de materiais , de acordo com o protocolo anteriormente publicados10. Modelos de plasmídeo para cada fator de reprogramação (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) e mWasabi (controle para transfeccao) estão disponíveis a partir de Addgene, um repositório de plasmídeo sem fins lucrativos. - Misture todos os mRNAs modificados em uma relação molar de 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) e incluem 10% mWasabi modificado mRNA como um controle para a eficiência do transfection. Ajuste a concentração do mRNA modificada completa reprogramação a mistura para uma concentração final de 100 ng / µ l, adicionando água livre de nuclease suplementada com 1 inibidor de RNase U / µ l. Prepare-se sete 33 alíquotas µ l dos completos modificado cocktail de mRNA. Armazenar as alíquotas de reprogramação mistas a-80 ° C.
Nota: para cada transfeccao, 1.000 ng do coquetel modificados do mRNA é adicionado por bem (ou seja, um total de 3.000 ng para 3 poços). Cada alíquota 33 µ l é dimensionada para transfect 3 poços de uma placa de formato 6-poços e inclui 3 µ l de volume em excesso para compensar erros de pipetagem. Preparando-se sete 33 alíquotas µ l é suficiente para completar uma reprogramação de fibroblastos completo de 3 poços em um prato de formato 6-poços.
- Siga o protocolo anteriormente publicados10 para executar em vitro transcrição, tampar e dephosphorylation procedimentos para cada mRNA modificados codificação individual fator reprogramação. Após a etapa final de purificação, Eluir o mRNA modificados com água livre de nuclease, complementar a solução de mRNA purificado modificados com 1 inibidor de RNase U / µ l, dosar os mRNAs modificados usando um espectrofotômetro e armazenar a-80 ° C por até 6 meses. Prepare várias alíquotas de cada mRNA modificado para minimizar o número de ciclos de gelo-degelo.
- Prepare o coquetel de reprogramação miRNA imita.
- Dissolver o liofilizado miRNA imita (Syn-tem-miR-302a - 3P, Syn-tem-miR-302b - 3P, Syn-tem-miR - 302c - 3P, Syn-tem-miR-302d-3 p, Syn-tem-miR-367-3 p) a uma concentração final de 5 pmol / µ l (5 µM) em água livre de nuclease suplementada com 1 U / µ l de inibidor de RNase. Preparar várias alíquotas de cada mímica miRNA e armazenar a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Misture todos os imita miRNA na proporção molar de 1:1:1:1:1 para uma concentração final de 5 pmol / µ l (5 µM). Prepare-se sete 14 alíquotas µ l da miRNA imita a mistura. Armazenar as alíquotas misturadas a-80 ° C.
Nota: Para cada transfeccao, 20 pmol de miRNA imita mistura é adicionado por bem (ou seja, um total de 60 pmol de 3 poços). Cada alíquota 14 µ l é dimensionada para transfect 3 poços de uma placa de formato 6-poços e inclui 2 µ l de volume em excesso para compensar erros de pipetagem. Preparando-se sete 14 alíquotas µ l é suficiente para completar uma reprogramação de fibroblastos completo de 3 poços em um prato de formato 6-poços.
- Prepare o buffer do transfection.
- Pré-aquecer uma garrafa de 500 mL e um frasco de 100 mL de meio de reduzida-soro fresco à temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 2 h. Não use um banho de água.
- Transferi um medidor de pH para uma armário de biossegurança. Lave o eletrodo de vidro com água livre de nuclease. Calibre o medidor de pH de acordo com as instruções do fabricante. Lave o eletrodo com água livre de nuclease.
- Transferi as duas garrafas de meio reduzido-soro para a biossegurança do armário. Use a garrafa de 500 mL RT para ajustar o pH.
- Medir o base pH do meio reduzido-soro inserindo eléctrodo de vidro do medidor de pH para o buffer. Espere até 1 min. antes de ler o pH no medidor.
- Adicione 3-4 mL de 1 M de NaOH em 500 mL de soro e reduzida meio, feche a garrafa e misture bem. Espere até 5 min. antes de abrir a garrafa para medição de pH. Inserir o eletrodo de pH para o buffer e esperar até que a leitura do medidor de pH estabiliza.
- Continue a adicionar volumes pequenos de 1 M de NaOH até pH do meio reduzido-soro 8.15 – 8.17. Calibre o medidor de pH várias vezes durante o processo. Se em algum momento o pH se torna superior 8.18, reduzi-lo adicionando meio reduzido-soro fresco do frasco 100ml pré-aquecido (etapa 1.3.1).
Nota: O pH do buffer reduzido-soro baseado no meio de transfeccao é essencial. Reprogramação será bem sucedida se o pH do buffer do transfection é aproximadamente 8,2 ± 0,05 mas pode falhar se o pH for superior a 8,25. Portanto, é aconselhável parar de adicionar NaOH, uma vez que pH do tampão atinge 8.15 – 8.17. Isto irá garantir que o pH final do buffer do transfection é aproximadamente 8,2 – 8.22 após a esterilização. - Filtro de esterilizar o buffer de transfeccao usando um sistema de filtração de vácuo 0,22 µm. Alíquota o buffer esterilizado em tubos de 5 ou 15 mL com espaço de ar mínimo.
- Loja alíquotas do buffer do transfection por até 3 meses a 4 ° C. Medir o pH das alíquotas periodicamente. Descarte as alíquotas se o pH for superior a 8,25. Limitar o uso de alíquota para 2 transfections só, desde que a exposição do buffer do transfection para ar atmosférico aumenta o pH do buffer.
- Prepare o suporte de expansão de fibroblasto (FEM): essencial mínimo suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1 x não aminoácidos essenciais, 55 µM 2-Mercaptoetanol, 1 suplemento de glutamina de x, 1 x caneta/estreptococos/fungizone. Armazenar o FEM a 4 ° C.
- Prepare o suporte de reprogramação: DMEM/F12 (sem HEPES) suplementado com substituição de soro de nocaute de 20% (KOSR), 0,5 x não aminoácidos essenciais, suplemento de glutamina 0.5 x, 55 µM 2-Mercaptoetanol, 50 µ g/mL de ácido ascórbico, 1x caneta/estreptococos/fungizone, bFGF 100 ng/mL e 200 ng/mL B18R. Prepare o suporte na iniciação de reprogramação sem bFGF e B18R e armazená-lo em 4 ° C. Não usá-lo para além de 1 mês após a preparação. Adicione bFGF e B18R imediatamente antes de cada utilização a uma alíquota de porte para uso naquele dia.
- Prepare o suporte de chapeamento, adicionando 5% inactivadas pelo calor (HI) FBS no meio de reprogramação, contendo 20% KOSR sem bFGF e B18R da etapa 1.5. Prepare o fresco médio no dia do uso pretendido. Adicione o bFGF e B18R imediatamente antes do uso no dia 0 de reprogramação.
- Calibre as incubadoras de cultura de tecidos antes de iniciar a reprogramação de acordo com as instruções do fabricante usando um analisador de2 CO digital portátil. Use uma incubadora de baixo-O2 para as etapas de reprogramação para garantir a geração de iPSC bem sucedida.
2. cultivo de fibroblastos para reprogramação
- Prepare-se fibroblastos antes do início de reprogramação (dia -2).
- Casaco de uma nova placa de cultura de tecido de 10 cm com 5 mL de 0.1% de gelatina. Bata ou agite a placa para garantir que toda a superfície é revestida. Incube por 15 min a 37 ° C. Aspirar a gelatina e adicionar 10 mL de FME conjunto à parte. Não permita que a superfície revestida da placa para secar antes de adicionar o Fme
- Aspire cuidadosamente o gasto médio de fibroblastos. Enxague as células uma vez com 5 mL de DPBS para remover o soro residual. Adicione 3 mL de EDTA-tripsina. Agitar suavemente a placa para assegurar uma cobertura completa sobre as células.
- Aspire o excesso de líquido, deixando ~ 500 µ l de tripsina. Não aspire o excesso, pois isso pode secar e matar os fibroblastos. Incubar os fibroblastos com tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C.
- Retirar a placa da incubadora e firme, mas suavemente, toque o lado da placa para desalojar as células. Verifique as células sob o microscópio. Se as pilhas são desanexados e flutuante, prossiga. Se as células ainda estão conectadas, incube por mais 3 minutos.
- Rapidamente enxágue/coletar as células desanexadas usando 5ml de FEM para neutralizar o tripsina-EDTA. Mova a suspensão de fibroblasto em um tubo cônico de 15 mL. Certifique-se de que as células são bem misturadas.
- Misture suavemente a suspensão de eritrócitos para quebrar grandes aglomerações de células e, em seguida, contar-lhes um hemocytometer. Transferência de 2.5 x 105 células para o prato de 10 cm revestido de gelatina preparada na etapa 2.1.1. Incube as células durante a noite a 37 ° C, 5% CO2 regular umidificado tecido cultura incubadora.
Nota: A densidade celular é essencial para alcançar alta eficiência de reprogramação, como é importante que os fibroblastos são saudáveis e rapidamente divisória. Chapeamento de 2.5 x 105 células produz uma confluência de 40-60% 2 dias mais tarde para a maioria das amostras de fibroblasto. Ajustar a quantidade em conformidade para células senescentes ou doentes alcançar a desejado 40-60% confluência 48 h mais tarde. - Substitua o médio com 10 mL de FEM fresco no dia seguinte (dia -1).
- Placa de fibroblastos para iniciar a reprogramação (dia 0).
- Verifique se os fibroblastos ser reprogramado na confluência de 40 – 60% (Figura 2, dia 0). Se as células são over - ou Under confluente, passagem os fibroblastos, conforme descrito no passo 2.1 e ajustar a densidade de chapeamento de acordo. Cultura por mais 2 dias.
- Transferência de 4 mL de DPBS em um tubo cônico de 15 mL. Adicione 100 µ l de recombinante humano (rh) laminina-521. Pipete para cima e para baixo para homogeneizar.
- Adicione 1 ml por bem de rhLaminin-521 diluídos em 3 poços de uma placa de 6. Incube a placa revestida a 37 ° C por 2 h.
- Aquecer 6 mL de FEM e 4 mL de chapeamento de médio a 37 ° C. Completar o meio de chapeamento com bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL.
- Aspire cuidadosamente o gasto médio de fibroblastos (etapa 2.2.1). Enxagúe as células com 5 mL de DPBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Agitar suavemente o prato para cobrir as células com tripsina-EDTA.
- Aspire o excesso de líquido, deixando ~ 500 µ l de tripsina, como feito na etapa 2.1.3. Incubar os fibroblastos com tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C. Retirar a placa da incubadora e firme, mas suavemente, toque o lado da placa para desalojar as células. Verifique as células sob o microscópio. Se as pilhas são desanexados e flutuante, prossiga. Se as células ainda estão conectadas, incube por mais 3 minutos.
- Enxaguadura/coletar as células desanexadas usando 5ml de FEM para neutralizar o tripsina-EDTA. Mova a suspensão de fibroblasto em um tubo cônico de 15 mL. Certifique-se que as células são bem misturadas e contá-las em um hemocytometer. Pipete 12.000 células em 4 mL de meio de escaldadas chapeamento da etapa 2.2.4.
Nota: Não centrifugar as células em qualquer ponto. O número de células chapeados pode ser ajustado para cima ou para baixo conforme necessário para linhas ou rápido-crescimento lento, respectivamente. - Retirar a placa revestida da incubadora e Aspire rhLaminin-521 diluídos de Poços revestidos. Não permita que a superfície dos poços para secar. Suavemente Ressuspender as células em meio de chapeamento. Pipetar 1 mL da suspensão de células para cada um revestido bem (ou seja, 3.000 células por poço).
- Coloque as células chapeadas em uma incubadora de cultura de tecidos de tri-gás com O2 conjunto 5% (baixo-O2). Quando a placa estiver ajustada para baixo, delicadamente mas completamente disperse as células alternando entre um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Repita os movimentos 2 vezes mais. Incube as células durante a noite. Não agite o prato para misturar.
- Pipetar 4 mL de meio de um tubo cônico de 15 mL de reprogramação e colocá-lo na incubadora com um tampão afrouxada para equilibrar a noite baixo-O2 . Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte.
3. início de reprogramação (dia 1)
Nota: Uma vez iniciada a reprogramação, manutenção diária é necessária para cerca de 1 mês. Não se esqueça de planejar de acordo. Todos incubação do celular subsequentes deve ser realizadas em condições de baixo-O2 no 37 ° C, 5% de CO2, incubadora de cultura de tecidos de tri-gás umidificado 5% O2 .
- Substitua o meio de chapeamento de pelo menos 1 h antes do transfection.
- Retire o meio equilibrado e reprogramação da incubadora de baixo-O2 . Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL. Misture bem.
- Procedendo com 1 bem de cada vez, use uma pipeta de 1 mL para remover o gasto médio e substituí-lo com 1 mL de reprogramação suplementado com bFGF e B18R. Repita isto para cada poço. Não utilize aspiração vácuo, que seca as células excessivamente, provoca estresse e reduz a eficiência de reprogramação. Mova a placa com células de volta para a incubadora de baixo-O2 .
- Transfect fibroblastos com 5 µ l de reagente de transfeccao RNAiMax por 1 µ g de mRNA modificados, e 1 µ l de reagente de transfeccao por 6 pmol de miRNA imita por transfecção.
Nota: Melhores resultados são obtidos quando transfections prosseguir para 16 – 20 h. O reagente de transfeccao é diluída 10 x; a 100 ng / µ l cocktail modificados mRNA é diluído x 5; e a 5 imita pmol / µ l miRNA mistura é diluída 8,33 x com o buffer de transfeccao antes de complexação. Consulte a tabela 1 para obter um resumo da instalação do transfection.- Enquanto prepara o transfeccao mistura, minimize exposição potencial dos reagentes a RNase, seguindo práticas de laboratório padrão.
- Equilibrar uma alíquota do buffer do transfection (etapa 1.3) por cerca de 1h na RT Não use um banho-maria a 37 ° C ou incubadora para aquecer o buffer do transfection.
- Retire uma alíquota única de mRNAs modificados (33 µ l) e miRNA imita (14 µ l) de-80 ° C e aquecê-las a RT por aproximadamente 3-5 min, até derretido. Não descongele as alíquotas a 37 ° C. Girá-los para baixo brevemente em uma microcentrífuga.
- Aquecer o reagente de Transfeccao para RT por aproximadamente 3-5 min. Não use um banho-maria a 37 ° C ou incubadora. Inverter o tubo fechado 2 – 3 vezes para misturar o reagente. Gire para baixo brevemente em uma microcentrífuga.
- Transferi 279 µ l de buffer de Transfeccao de RT em um tubo de microcentrifugadora RNase-livre. Adicione 31 µ l do reagente de Transfeccao para alcançar um volume final de 310 µ l. Mix completamente por pipetagem. Fazer não o vórtice. Incube o tubo em RT por 1 min.
Nota: Este volume de reagente de transfeccao diluído é suficiente para o complexo mRNA modificados e miRNA imita alíquotas da etapa 3.2.3. - Adicione 132 µ l de buffer de Transfeccao de RT para a alíquota de 33 µ l de mRNA modificados. Pipetar delicadamente para misturar: volume final é µ l 165.
- Adicione 102.6 µ l de buffer de Transfeccao de RT para a alíquota de 14 µ l de miRNA imita. Pipetar delicadamente para misturar: volume final é 116.6 µ l.
- Adicione 165 µ l do reagente diluído transfeccao de passo 3.2.5 para o diluídos modificado do mRNA da etapa 3.2.6. Pipeta para misturar: volume final é 330 µ l.
- Adicione 116.6 µ l de reagente de transfeccao diluídos de passo 3.2.5 à mistura do passo 3.2.7 imita miRNA diluídos. Misture bem (o volume final é 233.2 µ l). Incubar durante 15 min em RT para permitir que o buffer de Transfeccao para complexos com os mRNAs modificados e miRNA imita.
- Remova a placa com células da incubadora de baixo-O2 . Adicione 100 µ l (1 µ g) do complexado modificado mistura de transfeccao mRNA para cada poço, gota a gota através do poço. Disperse os complexos de transfeccao por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Não agite o prato para misturar.
- Adicione 66,7 µ l (20 pmol) da mistura do transfection miRNA complexado imita a cada poço, gota a gota através do poço. Disperse a complexos de transfeccao por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Não agite o prato para misturar.
- Coloque as células transfectadas dentro da incubadora de tri-gás com O2 conjunto 5% (baixo-O2). Quando a placa estiver ajustada para baixo, disperse os complexos de transfeccao novamente por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita.
- Pipetar 4 mL de reprogramação médio em um tubo cônico de 15 mL e colocá-lo na incubadora de baixo-O2 com tampa solta para equilibrar durante a noite. Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte.
| Tubo 1 - RNAiMax diluição (mistura 1) | ||
| Reagente | Concentração | Volume de |
| Buffer de transfeccao | Μ L 279 | |
| RNAiMax (adicione 2) | 10 x | Μ L 31 |
| Total: 310 µ l | ||
| (incubar 1 min à temperatura ambiente) | ||
| Tubo 2 - mRNA modificados mix (mistura 2) | ||
| Reagente | Concentração | Volume de |
| mistura de mRNA modificados | 100 ng / µ l (5x) | Μ L 33 |
| Buffer de transfeccao | Μ L 132 | |
| Total: 165 µ l | ||
| (adicione igual volume de RNAiMax diluído de 1 tubo) | ||
| Tubo 3 - miRNA imita mistura (mistura 3) | ||
| Reagente | Concentração | Volume de |
| miRNA imita mistura | 5 pmol / µ l (8.33 x) | Μ L 14 |
| Buffer de transfeccao | 102.6 Μ l | |
| Total: 116.6 µ l | ||
| (adicione igual volume de RNAiMax diluído de 1 tubo) | ||
Tabela 1: Preparação da mistura do transfection.
4. substituição de reprogramação médio entre Transfections (dias 2, 4, 6, 8, 10 e 12)
- Substitua o pós-transfection médio 16 – 20 h, conforme descrito em 3.1.1–3.1.2. Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL em alíquotas médias reprogramação.
- Monitorar mWasabi expressão diariamente para confirmar a qualidade de transfeccao usando um microscópio configurado para visualizar EGFP.
Nota: a expressão mWasabi deve ser minimamente aparente no dia 2 e aumento de brilho com cada transfeccao adicional.
5. todos os outros-dias Transfections (dias 3, 5, 7, 9, 11 e 13)
- Execute o transfeccao, conforme descrito no passo 3.2. Não altere o meio nos dias do transfection.
- Preparar uma aliquota de 4 mL de reprogramação médio e coloque-o na incubadora de baixo-O2 para equilibrar a mudança média no dia seguinte. Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte.
6. os procedimentos a efectuar após a Final do Transfection
- Executar alterações médias diárias do dia 14, através de aproximadamente dia 17. Aquecer 7 mL de reprogramação de médio a 37 ° C. Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL.
Nota: B18R não é mais necessário após o final do transfection. Além do dia 14, já não é necessário equilibrar o meio durante a noite na incubadora de baixo-O2 . - Remova o meio de todos os poços, com uma pipeta sorológica. Continue a evitar o uso de aspiração. Adicione 2 mL de reprogramação suplementado com bFGF por bem.
- Nos dias 17 e 18, analise os poços reprogramados sob um microscópio invertido ou dissecação. Se colônias formam-se em estreita proximidade com os outros devido a alta eficiência de reprogramação e não podem ser manualmente isoladas, separe as colônias através da realização de uma passagem opcional de poços reprogramados descritos na etapa 7 abaixo. Se as colónias são esparsas e bem separadas, escolha manualmente os clones directamente a partir do reprogramadas bem como descrito na etapa 8 e subcultura iPSCs de acordo com protocolos padrão.
7. procedimento opcional: Células de passagem de poços reprogramado usando EDTA
- Prepare 0,5 mM EDTA em DPBS (EDTA) diluindo a solução estoque de EDTA 0,5 M. Filtro de esterilizar EDTA usando um sistema de vácuo da filtragem de 0,22 µm.
- Prepare-se isento de alimentador pluripotentes células-tronco (PSC) médio (por exemplo, mTeSR1) de acordo com as instruções do fabricante. Pré-aquecer 32 mL de meio PSC 37 ° c.
- Cubra todos os poços de duas placas de formato 6-poços com hESC qualificado da matriz extracelular (ECM) seguindo as instruções do fabricante. Placas de vedação com parafina de cinema e incubam-os por 1 h no RT
- Aspirar a solução ECM as chapas previamente aquecido e substituí-lo com 2 mL do meio de CPS por bem. Não permita que a superfície dos poços para secar. Reserve-os.
- Aspire a reprogramação médio de 2 poços reprogramadas em um dia, quando as colônias são grandes e claramente formado (geralmente dia 18). Lave uma vez com 1 mL de EDTA e Aspire.
- Adicione 1 mL de EDTA por bem. Incubar durante 4 min a 37 ° C.
- Delicadamente, retirar a placa da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.
Nota: neste ponto, as células podem ser muito frouxamente aderidas e facilmente desalojados. - Aspire cuidadosamente com EDTA de dois poços. Adicione 3 mL de meio PSC pré-aquecido a cada bem tratados com EDTA. Use um raspador de célula para delicadamente mas completamente deslocar células de dois poços.
- Use uma pipeta sorológica suavemente Pipetar a suspensão de eritrócitos e terminar em grandes aglomerações. Não Pipete até que todos os grupos de célula sumiram. Preserve clusters de iPSC.
Nota: Chapeamento de grandes massas que não afetará consequência natural de colônia de iPSC. Se houver células excessivamente grandes aglomerados, simplesmente Evite transferi-los para o próximo prato. - Usando uma pipeta sorológica, distribua uniformemente as células de cada poço tratados com EDTA por pipetagem 0,5 mL em cada poço da placa ECM-revestido 6-poços.
Nota: Não combinar células reprogramadas poços (i.e., reprogramado bem 1 deve ser uniformemente distribuída para a primeira placa de 6, e reprogramadas bem 2 deve ser uniformemente distribuída para a segunda placa de 6). - Mova as células chapeadas de volta para a incubadora de baixo-O2 . Para distribuir as células, agite cada placa e para trás e de lado. Não agitar o frasco. Substitua o meio PSC diariamente.
8. colheita iPSC colônias
- Pré-aquecer 15 mL do meio PSC 37 ° c. Cubra todos os poços de uma placa única de 6 com ECM hESC qualificado, seguindo as instruções do fabricante. Selar as placas com película de parafina e incube-os por 1 h no RT
- Aspire o meio de cultura de poços, sendo usado para coletar iPSCs. Lave uma vez com 1 mL de EDTA e Aspire. Adicione 1 mL de EDTA por bem. Incubar durante 4 min a 37° C. Enquanto as células estão incubando, aspirar a solução ECM as chapas previamente aquecido e substitua por 2 mL do meio de CPS por bem. Reserve as placas.
- Remova cuidadosamente a placa com iPSCs para ser colhidos a partir da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.
Nota: neste ponto, as células podem ser muito frouxamente aderidas e facilmente desalojados. - Aspire cuidadosamente com EDTA. Muito suavemente adicione 3 mL de meio PSC previamente aquecido, tomando cuidado para não desalojar colônias de iPSC.
- Mova a placa para um escopo invertido ou dissecação para melhor Visualizar colônias. Prepare uma pipeta de 1 mL com uma ponta estéril. Pressione o êmbolo totalmente e, em seguida, use a ponta da pipeta para raspar suavemente uma colônia enquanto desenha lentamente o líquido na ponta para coletar a colônia. Desenhar como meio pouco possível ao escolher a colônia de iPSC.
- Para transferir a colônia, pipete acima e para baixo 3 a 4 vezes em um único poço da placa ECM-revestido de passo 8.2. Repita até 6 colônias foram escolhidas e transferidas para poços individuais. Escolha não mais de 2 colônias de qualquer poço único se uma passagem opcional descrito no passo 7 foi executada.
- Use um protocolo padrão células-tronco humanas para congelar para baixo todos os poços restantes. Descongelar e re-placa estoques congelados se mais colônias devem ser colhidas mais tarde.
9. caracterização de iPSCs
- Realize TRA-1-60 de coloração para análise de reprogramação de eficiência (dia 18).
Nota: 2 dos 3 reprogramado poços são passados para a colheita futura colônia. Bem o restante pode ser usado para coloração de TRA-1-60. Este procedimento pode ser realizado na bancada do laboratório.- Lave o reprogramadas bem com 1 mL de PBS. Fixe as células com metanol gelada a-20 ° C por 5 min.
- Aspire o metanol. Seco o poço de aproximadamente 2 min. tenha cuidado para não secar demasiado. As células tenham secado bastante quando eles se tornam uma cor translúcida/fosco.
- Lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave. Durante as lavagens, prepare-se 3 mL de peróxido de hidrogênio 3% em PBS.
- Aspire a PBS. Adicione 2 mL de solução diluída de peróxido. Incube durante 15 min em RT com agitação suave. Preparar 4 mL da solução de bloqueio: 10% albumina de soro bovino (BSA) em PBS.
- Aspire a solução de peróxido. Lave os bem 2 vezes com 1 mL de PBS por 5 min.
- Aspire PBS e adicionar 2 mL de solução de bloqueio dentro do poço. Incubar durante 1 h em RT.
- Lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave.
- Dilua o principal anticorpo anti-TRA-1-60 de 1: 100 em solução bloqueio suplementada com 0,05% de azida de sódio. Prepare-se 1 mL da diluição de anticorpo para 1 bem de um prato de formato 6-poços. Adicionar a diluição do anticorpo para o bem e enrole a placa com parafilm para evitar a evaporação. Incube durante uma noite a 4 ° C, com agitação suave.
Nota: Se necessário, a incubação com o anticorpo primário pode ser feita por 1h no RT com agitação suave. A diluição do anticorpo primário pode ser reutilizada até 5 vezes. - Após a incubação com o anticorpo primário, lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave.
- Dilua anti-rato HRP-conjugado anticorpo secundário no 1: 200 na solução de bloqueio. Incube o poço com a diluição de anticorpo secundário para 2h em RT com agitação suave.
- Aspirar a diluição do anticorpo secundário e lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave.
- Durante a terceira lavagem, prepare a solução de substrato, seguindo as instruções do fabricante. Após a lavagem final, Aspire PBS. Adicione 1 mL da solução de substrato e incubar até a cor desejada desenvolve (aproximadamente 10 min).
- Aspire a solução de substrato. Enxágue bem com água por 5 min agitando suavemente.
- Conte as colônias, se desejado. Reprogramação de eficiência = (número de colônias) / (número de fibroblastos chapeados) x 100%.
- Para armazenamento a longo prazo, aspirar a água do prato manchada e secar ao ar durante a noite às RT. fechar a placa seca com parafilm e armazenar a 4 ° C por até 2 anos avaliar a eficiência de reprogramação mais tarde.
Representative Results
Normalmente demora cerca de 5-6 semanas desde o início do fibroblasto reprogramação para congelamento dos primeiros frascos de iPSCs (Figura 1). Protocolo de reprogramação geralmente pode ser Categorizado em duas fases. Fase 1 inclui a cultura de fibroblastos e sete transfections, com o reprogramação do RNA cocktail realizados a cada 48 h. fase 2 inclui expansão de isolamento e caracterização das colônias iPSC.
Antes de iniciar o protocolo, deve ser assegurado que os fibroblastos ser reprogramado são de boa qualidade. Fibroblastos saudáveis devem aparecer fusiformes, bipolar e refractile com um tempo de duplicação de cerca de 24 h. Por dia 0, 250.000 células banhadas em um prato de 10cm no dia -2 devem crescer a confluência de 40 – 60% (Figura 1, dia 0) e produzir aproximadamente 6-10 x 105 células. Células proliferando a um ritmo mais lento podem ser compensadas com chapeamento em uma maior densidade de no dia -2 e no dia 0 para reprogramação.
Fibroblastos devem aparecer muito esparso chapeamento seguir num poço de um prato de formato 6-poços para reprogramação (dia 1,Figura 2). Vinte e quatro horas após o primeiro transfeccao, fibroblastos perderá sua forma de eixo e adotar uma morfologia mais arredondada (Figura 2, dia 2), que é mantida através do restante da reprogramação. Fluorescência verde de mWasabi mRNA deve ser minimamente observável no dia 2 e constantemente aumentar em brilho para ser claramente visível de dia 4. A capacidade de detectar mWasabi fluorescência pode depender de instalação e sensibilidade de escopo. Densidade de células gradualmente e consistentemente aumentará durante os três primeiros transfections (dias 1-6), com uma explosão aparente proliferação ocorrendo entre os dias 7 e 8. As células devem aparecer em grande parte confluentes por dia 10 (Figura 2, dia 10). As primeiras colônias de iPSC podem aparecer assim que dia 11 (Figura 2, dia 11); no entanto, colônias podem não ser observável até tão tarde quanto dia 18. Geralmente, por dias 15 – 18, haverá colônias de iPSC grandes e óbvias que são claramente distintas do entorno, incompleta reprogramados fibroblastos (Figura 2, dia 15 e Figura 3, dia 17). Immunostaining para o marcador de pluripotência TRA-1-60 pode ser realizada para avaliar a eficiência de reprogramação (Figura 3, dia 17, TRA-1-60). Na nossa experiência, a maioria das linhas de fibroblasto rendem centenas de colónias por reprogramado bem (Figura 3, inserir B).
Densidade de chapeamento de qualidade inferior é a razão mais comum para a redução da eficiência de reprogramação em nosso protocolo e é frequentemente associada com fibroblastos que são doentes, senescentes, e/ou alta-passagem. Se chapeamento densidade é muito baixo, haverá grandes remendos estéril acelulares na extremidade de reprogramação (Figura 4) e colônias de iPSC não podem formar (Figura 4). Células reprogramadas devem estar muito confluentes no dia 14 (comparar a Figura 4A e 4B , a Figura 2, dia 14). Da mesma forma, se as células são banhadas demasiado densamente ou se proliferam muito rapidamente, reprogramação eficiência é drasticamente reduzido.
Para manter a homogeneidade de iPSCs paciente-derivados, é importante expandir linhas de células de uma única colônia. Desde que reprogramação eficiência é muito alta em nosso protocolo, vizinhas colônias de iPSC podem formar-se nas proximidades e crescer em cada outro (Figura 3, dias 15-17). Isso às vezes torna difícil separar mecanicamente uma única colônia para expansão clonal. Descobrimos que é útil para a primeira passagem bem um reprogramadas e diluí-la através de uma maior área de cultura. Uma relação boa passagem consiste em dividir uniformemente uma placa 6-bem-formato reprogramada bem através de uma placa inteira de 6.
Após a passagem de diluição, iPSCs crescer como colônias e são facilmente distinguíveis de fibroblastos (Figura 5, dia 18). Inicialmente, iPSC colônias podem ser embaladas frouxamente, e células individuais têm uma relativamente grande área citoplasmática. Ao longo de 4 a 7 dias, as iPSCs proliferam e formam uma colônia característica hermeticamente embalados com bordas definidas. Células individuais dentro da colônia tem uma grande fração nuclear com nucléolos proeminentes (Figura 5, dia 22). Deve haver muitas colônias que se formam em cada poço, e apenas aqueles com morfologia de iPSC clássico devem ser escolhidos para a expansão.
Figura 1 : Reprogramação de fibroblastos humanos em induzidas (iPSCs) as células-tronco pluripotentes. É apresentado um protocolo esquemático para a reprogramação de fibroblastos humanos. Fibroblastos são passados primeiro em uma baixa densidade em um poço de um prato de formato 6-poço, seguido de sete transfections realizadas em intervalos de 48 h. Médio é substituído 16 – 20 h após cada transfeccao. Reprogramadas iPSCs primeiro são passadas em aproximadamente dia 18, clonal colônias e são apanhados por dia 26. Normalmente, linhas de iPSC derivado de fibroblasto podem ser congeladas para armazenamento a longo prazo por dia 38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante imagens diárias durante cada dia de reprogramação. Fibroblastos devem ser aproximadamente de 40 a 60% de confluencia aquando da passagem para iniciar a reprogramação (dia 0, as células são banhadas em um prato de 10 cm). O primeiro transfection (T1) ocorre no dia 1, e as células devem aparecer muito escassas neste ponto. No dia seguinte (dia 2), uma morfologia mais arredondada deve tornar-se aparente. Células irão continuar a aumentar em densidade em todo o protocolo com clusters de iPSC, começando a aparecer assim que dia 11 (circulado em vermelho). No dia 15, colônias de iPSC será grandes com limites discretos. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Formação de colônia após transfections com reprogramação modificado mRNAs e miRNA imita. Baixo-ampliação de imagens foram tirada de um representante de reprogramação nos dias 15 a 17. Após o final do transfection, reprogramadas iPSCs irá formar colônias claras com limites definidos que expandir em tamanho e condensar-se para tornar-se claramente distinto do incompleta reprogramados fibroblastos circundantes. Immunostaining para o marcador de pluripotência TRA-1-60 indica a presença de iPSCs (baixo-relevo A) e pode ser usado para cálculo de reprogramação eficiência contando todas as colônias dentro de um único poço (inserir B, exemplos de colônias contáveis circulado em verde). Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagens representativas de densidade de chapeamento sub-ótimo para reprogramação. (A, B) Exemplos de fibroblastos que são muito escassos por dia 14 de reprogramação (compare a Figura 2, dia 14). Imagem de baixa ampliação (C) no dia 17 de reprogramação com um patch grande, estéril circulados em vermelho. (D) o mesmo bem foi corrigido e manchado por TRA-1-60 confirmar pobres totais reprogramação eficiência devido à densidade celular baixa. Escala de barras = 200 µm (A, B) e 1 mm (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagens representativas de iPSCs depois da passagem inicial. Depois de completar a transfections com reprogramação mRNAs modificados e miRNA imita, células reprogramadas são passadas por dias 17 e 20. iPSCs tem uma vantagem de crescimento médio e PSC e rapidamente ultrapassar qualquer fibroblastos que foram reprogramados incompleta. Inicialmente, iPSCs irá formar colônias que podem aparecer soltas com fronteiras mal definidas. Dentro de alguns dias, as células rapidamente se proliferam e assumem a morfologia característica das células firmemente embaladas com uma alta relação núcleo-para-citoplasma, firmemente de clustering em colônias com aréolas distintas. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo descreve um método clinicamente relevante, não-integração, RNA-baseado que permite a reprogramação das linhas de fibroblasto humano normal e doenças associadas em iPSCs com uma altíssima eficiência. Até à data, cada linha de fibroblastos humanos que tentamos reprogramar com o protocolo descrito produziu um número satisfatório de iPSCs de alta qualidade para aplicações a jusante. IPSCs resultante pode ser imediatamente transferidos e expandiu-se em condições de cultura livre do alimentador.
Qualidade de fibroblastos para recodificá-lo:
Reprogramação de sucesso depende fortemente da qualidade dos fibroblastos a começar. Idealmente, a reprogramação deve ser iniciado com os menores fibroblastos de passagem disponíveis para alcançar a máxima eficiência. Reprogramação de eficiência é melhor com fibroblastos de passagem 2 – 4. Reprogramação ainda pode trabalhar com alta-passagem (passagem 5 – 8), fibroblastos senescentes mesmo, embora com uma eficiência reduzida. Às vezes baixo-passagem fibroblastos são indisponíveis ou amostras de pacientes têm uma mutação genética que impede o crescimento saudável. Neste caso, otimização da densidade inicial de chapeamento pode ser necessária. A reprogramação das linhas de fibroblasto comprometido é geralmente associada com morte celular aumentada durante transfections de RNA. Como resultado, as células a reprogramação bem parecerá ser esparsos pelos dias 10 – 14 de reprogramação. Grandes áreas acelulares também estarão visíveis no poço. Se este for o caso, o protocolo de reprogramação precisará ser re-iniciado com um maior número de partida inicial de fibroblastos. Chapeamento de 3.000 entradas células por poço de um prato de formato 6-poços trabalha consistentemente para linhas de fibroblasto mais adultas. No entanto, o aumento do número de chapeamento de 5.000-10.000 (50.000 para linhas senescentes) pode ajudar a melhorar a reprogramação de amostras de doenças associadas, como foi noticiado em nosso anterior publicação8. Por outro lado, células atingindo confluência muito cedo também podem ser resistentes a reprogramação. Se as células em fase transfections com reprogramação RNAs se proliferam muito rapidamente (como acontece às vezes com fibroblastos neonatais primários), inicie a reprogramação com 500 fibroblastos por alvéolo de um prato de formato 6-poço8.
Manipulação do buffer do transfection:
O pH do buffer do transfection (reduzido-soro médio ajustado ao pH de 8,2) é fundamental para alcançar as eficiências de transfeccao ideal exigidas para este protocolo de reprogramação. Por esse motivo, são recomendadas várias precauções sobre a manipulação do buffer do transfection. Nós achamos que mesmo curta exposição do buffer de Transfeccao para ar atmosférico afeta o pH do buffer. Portanto, o buffer de transfeccao deve ser aliquotado para um recipiente de tampa de rosca com espaço mínimo de ar (usamos 5 ou 15 mL tampa de rosca cônica tubos). Para minimizar a exposição de ar ainda mais, use cada buffer de transfeccao alíquota para um máximo de dois transfections. Por último, desde pH de impactos de temperatura, é fundamental que o buffer de transfeccao é incubado para RT para montagem dos complexos do transfection. É aconselhável não aquecer o buffer de Transfeccao para 37 ° C.
Passagem de iPSCs:
Enquanto muitos anteriormente publicado protocolos recomendam escolher colônias de iPSC individual no final da reprogramação, isto pode ser difícil de alcançar quando a eficiência de reprogramação é muito alta ou se as colônias de cluster juntos, como é frequentemente o caso no nosso protocolo. Portanto, se colônias de iPSC estão em estreita proximidade uns aos outros, recomendamos primeiro passagem as células para se espalharem reprogramadas iPSCs antes de escolher manualmente as colónias. Existem várias vantagens ao realizar esta etapa de passagem antecipada. Espalhando-se as colônias lhes dá mais espaço para crescer, produzindo colônias muito maiores para a colheita do que outra forma poderia ser alcançado na fonte original. Isso melhora consideravelmente a taxa de sucesso em estabelecer uma linha de iPSC de um clone escolhido. Encontramos, também, que o tempo adicional de cultura com fibroblastos, embora numa taxa diluída, aparece melhorar a qualidade média das colônias de iPSC escolhido. Os fibroblastos incompleta reprogramados podem fornecer apoio parácrina fatores, que continuam a ajudar a estabelecer as iPSCs e facilitar a transição direta em condições de cultura celular livre de alimentador. Fibroblastos fortuitamente tem uma desvantagem seletiva de crescimento em comparação com iPSCs quando cultivadas em mTeSR1. Portanto, a população de células fibroblasto contaminante rapidamente dilui-se quantidades insignificantes 3 – 4 passagens.
Inibidores ROCK como Y-27632 são frequentemente usados para cultura rotineira de iPSCs humana. Encontramos que cultura frequente e/ou estendida de algumas linhas de iPSC com Y-27632 podem ter efeitos deletérios sobre a qualidade global. Ao usar uma moita passagem método, tais como com EDTA, Y-27632 não é necessário para manter a viabilidade de iPSC após a divisão. Nós eliminamos completamente mídia completa com Y-27632 para todos os isolamento de iPSC, expansão ou cultura de rotina.
Limitações de protocolo:
Uma limitação para a abordagem de reprogramação descrita baseado em RNA é o custo inicial e a complexidade associada com a preparação dos reagentes reprogramação. Embora os procedimentos preparatórios para gerar mRNA reagentes são tudo rotina e tem sido anteriormente descrito (PCR, transcrição em vitro , tratamento de DNase, tampando, desfosforilação, purificação), cumulativamente, a produção de reagentes de mRNA é um processo relativamente longo e não-trivial. O outro grande desafio para este protocolo é a necessidade de transfect células cada 48h, aumentando a intensidade do trabalho do protocolo de reprogramação. Estas considerações podem ser proibitivas se a reprogramação de apenas algumas amostras de pacientes é desejada. No entanto, se a consideração principal é a geração de iPSCs clinicamente relevantes ou alcançar eficiência muito elevada de reprogramação, a abordagem de reprogramação descrita baseado em RNA é ideal.
Em resumo, o alta eficiência baseado em RNA reprogramação método descrito baseia-se na eficiência otimizada do transfection do tipo ser reprogramado, conforme descrito em nosso anterior publicação8células somáticas. O protocolo de Transfeccao de RNA apresentado neste estudo é altamente sintonizado para fibroblastos humanos primários, mas potencialmente pode ser adaptado para outros tipos de células para melhorar a eficiência de reprogramação de várias células somáticas.
Disclosures
I.K. e G.B. são co-inventores em um pedido de patente, intitulada "Métodos e composições para reprogramar células", PCT aplicação no. PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
Estamos gratos por apoio financeiro de institutos nacionais de saúde (T32AR007411-33) e a Universidade do Colorado pele doenças núcleo centro de pesquisa (P30AR057212). Agradecemos também a parceria de pesquisa de Epidermólise bolhosa (EB), EB Medical Research Foundation, cura EB caridade, distrófica Epidermólise bolhosa Research Association (DEBRA) internacional, a Fundação Rei Balduíno Vlinderkindje fundo e portões Fundo de fronteiras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
