Summary
Dette papir beskriver en protokol til forberedelse af en co-kultur af kryptokok-celler og amobers, der er undersøgt ved hjælp af Still, fluorescerende billeder og høj opløsning transmission Electron mikroskop billeder. Illustreret her er, hvordan kvantitative data kan supplere sådanne kvalitative oplysninger.
Abstract
For at simulere Cryptococcus infektion, Amoeba, som er den naturlige rovdyr af kryptokok-celler i miljøet, kan bruges som en model for makrofager. Denne rovfisk organisme, svarende til makrofager, beskæftiger fagocytose at dræbe internaliserede celler. Ved hjælp af en confokal laser-scanning mikroskop, billeder, der skildrer interaktive øjeblikke mellem kryptokok-celler og amøbe er fanget. Opløsnings kraften i elektronmikroskopet hjælper også med at afsløre de ultrastrukturelle detaljer af kryptokok--celler, når de fanges inde i amøbe Food vakuole. Da fagocytose er en kontinuerlig proces, er kvantitative data derefter integreret i analysen for at forklare, hvad der sker på tidspunktet, når et billede er fanget. For at være specifik læses relative fluorescens enheder for at kvantificere amoebas effektivitet i internalisering af kryptococcal-celler. Til dette formål, kryptokok-celler er farvet med et farvestof, der gør dem fluorescerer når fanget inde i det sure miljø af fødevarer vakuole. Når de anvendes sammen, oplysninger indsamlet gennem sådanne teknikker kan give kritiske oplysninger til at hjælpe med at drage konklusioner om adfærd og skæbne af celler, når internaliseret af amøbe og, muligvis, af andre fagocytiske celler.
Introduction
Mikrober har udviklet sig over tid til at besætte og trives i forskellige økologiske nicher såsom de åbne fysiske grænser for jord og vand, blandt andre1. I disse nicher engagerer mikrober sig ofte i den direkte konkurrence om begrænsede ressourcer; vigtigere, for næringsstoffer, som de bruger til at støtte deres vækst eller plads, som de har brug for at imødekomme den voksende befolkning2,3. I visse tilfælde, nogle holozoiske organismer som amøbe kan endda prædate på kryptokok-celler som en måde at udtrække næringsstoffer fra deres biomasse4,5. Dette gør det muligt for sådanne organismer at etablere territorial dominans ved at kontrollere befolkningstallet for dets bytte. På grund af dette underbuds pres kan nogle bytte blive udvalgt til at producere mikrobielle faktorer, såsom kryptokok-Capsule6, for at forene de negative virkninger af trykket. Men som en utilsigtet konsekvens af dette pres, nogle mikrober erhverve faktorer, der giver dem mulighed for at krydse arten barriere og opsøge nye nicher at kolonisere7, ligesom de lukkede rum i den menneskelige krop, der er rige på næringsstoffer og har ideelle Betingelser. Sidstnævnte kan forklare, hvordan en terrestrisk mikrobe som Cryptococcus (C.) neoformans kan omdanne til at blive sygdomsfremkaldende.
Til dette formål er det vigtigt at studere den indledende kontakt, som kryptokok-celler kan have med amøbe og hvordan dette kan vælge dem til at blive sygdomsfremkaldende. Mere specifikt, dette kan give fingerpeg om, hvordan kryptokok-celler opfører sig, når handlet på af makrofager under infektion. Det er grunden til, at amøbe blev valgt som model for makrofager her, da det er relativt billigt og let at opretholde en kultur af amøbe i et laboratorium8. Af interesse var også at undersøge, hvordan kryptokok-sekundære metabolitter Viz. 3-hydroxy fedtsyrer9,10 påvirke samspillet mellem amobers og kryptokok-celler.
En enkel måde at opfatte samspillet mellem amøbe og dets bytte med det blotte øje er at skabe en græsplæne ved hjælp af sit bytte på overfladen af en agar plade og spot amøbe. Visualisering af plaques eller klare zoner på agar pladen skildrer områder, hvor amøbe kan have fodret med sit bytte. Men på dette makroniveau, kun resultatet af processen er noteret, og processen med fagocytose er mekaniseret ikke kan observeres. Derfor, at værdsætte processen på en celle-til-celle basis, der er flere mikroskopiske metoder, der kan anvendes11,12. For eksempel kan et inverteret mikroskop med et inkubations kammer bruges til videooptagelse af en tidsforskydning af hændelser mellem en Fagocytisk celle og dens mål13. Desværre, på grund af omkostningerne ved et mikroskop med en tidsforskudt funktionalitet, er det ikke altid muligt for laboratorier at købe et sådant mikroskop, især i ressourcefattige-indstillinger.
For at omgå ovennævnte begrænsning, denne undersøgelse præsenterer en sekventiel sonderende design, der evaluerer samspillet mellem C. neoformans Viz C. neoformans uofs Y-1378 og C. neoformans Lmpe 046 med acanthamoeba Castellani . For det første anvendes en kvalitativ metode, der går forud for en kvantitativ metode. Stillbilleder optages ved hjælp af en inverteret fluorescens mikroskop, samt et transmission elektronmikroskop til at skildre Amoeba-Cryptococcus interaktioner. Dette blev efterfulgt af kvantificering af fluorescens ved hjælp af en plade læser til at estimere effektiviteten af amøbe til internalisere kryptokok-celler. Når du forener resultater fra disse metoder under data-fortolkning fase, dette kan lige så afsløre så meget kritiske oplysninger som perusing en fagocytose time-lapse video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus neoformans og nogle Acanthamoeba castellanii stammer betragtes som biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) patogener; således, forskere skal tage passende forholdsregler, når du arbejder med disse organismer. For eksempel bør laboratoriepersonale have specifik uddannelse og personlige værnemidler (PPE) såsom laboratorie frakker, handsker og øjenværn. En biologisk sikkerhed kabinet (niveau-2) bør anvendes til procedurer, der kan forårsage infektion14.
1. dyrkning og standardisering af svampeceller (modificeret fra Madu et al. 15 )
- Afstribe de test svampe stammer (dvs., c. neoformans uofs Y-1378 og C. neoformans lmpe 046) fra bestanden kulturer (ikke ældre end 9 måneder) på gær-peptone-DEXTROSE (YPD) agar plader. Oplysninger om YPD agar ingredienser findes i tabel 1.
Bemærk: c. neoformans uofs Y-1378 har vist sig at producere 3-hydroxy fedtsyrer, mens c. neoformans lmpe 046 ikke producerer 3-hydroxy fedtsyrer. Der henvises til supplerende fil 1 for oplysninger om, hvordan tilstedeværelsen af disse molekyler bestemmes. - Agarpladerne inkubates i 48 h ved 30 °C.
Bemærk: en plade kan opbevares i op til 2 måneder ved 4 °C, før den kan kasseres eller bruges til at lave en bestand kultur16. - Skrabe en løkke af kryptokok-celler (c. neoformans uofs Y-1378 eller c. neoformans lmpe 046) fra den 48 h-gamle plade og inokulere i en 250 ml konisk kolbe indeholdende 100 ml af den kemisk definerede YNB bouillon (6,7 g/L) suppleret med 4% ( w/v) glucose. Oplysninger om YNB Broths ingredienser findes i tabel 2.
- Kolberne inkubaterer ved 30 °C i 24 timer, mens der omryes med 160 rpm på en rotations shaker.
- Efter en inkubationsperiode på 24 timer skal du tælle svampecellerne ved hjælp af et hemocytometer og justere celletallet til 1 x 106 celler/ml med PBS ved pH 7,4.
Bemærk: de forberedte c. neoformans uofs Y-1378 inokulum blev anvendt i trin 3,1 og 3,2, mens c. neoformans lmpe 046 inokulum kun blev anvendt i trin 3,2.
2. dyrkning og standardisering af amøbe-celler (modificeret fra Madu et al. 15 )
- Tø en bestand kultur af Acanthamoeba castellanii og bringe det til stuetemperatur (RT).
Bemærk: Amoeba blev udarbejdet på grundlag af de modificerede protokoller af Axelsson-Olsson et al.8 og Schuster17. - 1 mL af den optøede kultur afpipetteres og inokuleres i et 50 mL centrifugeglas, der indeholder 15 mL ATCC-medium 712. Oplysninger om ATCC medium 712 's ingredienser findes i tabel 3.
- Ryst det forsigtigt og centrifugeres straks i 5 minutter ved 400 x g og 30 °c.
- Aspirere supernatanten.
- Cellerne opslæmmes i 15 mL ATCC medium 712, og røret inkubates ved 30 °C i 14 dage.
Bemærk: periodisk kontrollere cellerne, ved hjælp af en simpel lys mikroskop, at afgøre, om de er i en trofozoit tilstand. Når de er i en trofozoit tilstand, starte en frisk kultur. - 1 mL afpipetteres fra en kultur, der viser celler i en trofozoit-tilstand og bruger den til at inokulere et sterilt 50 mL centrifugeglas, der indeholder 15 mL frisk, steril ATCC-medium 712.
- Inkuber røret ved 30 °C i 1 uge, mens du agiterer med 160 rpm på en rotations shaker.
- Efter en uge, tælle amøbe celler ved hjælp af en hemocytometer og justere celle nummeret til 1 x 107 celler/ml med frisk, steril ATCC medium 712.
- Udfør en rentabilitetsanalyse ved hjælp af en trypan og et blå plet som beskrevet af Strober18. Gå videre med de kulturer, der viser mindst 80% levedygtighed.
3. fluorescens farvning af celler for at studere fagocytose (modificeret fra Madu et al. 15 )
- Indsamling af kvalitative data ved brug af fluorescens mikroskop
Bemærk: Udfør denne analyse med Acanthamoeba castellanii og C. neoformans uofs Y-1378.- Der dispenserer en 200-μl suspension af standardiseret amobers (1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) i kammer brønde af en vedholdende slide og Inkuber i 2 timer ved 30 °c, for at cellerne overholder overfladen.
- Mens amøbe celler er ved at slå sig ned for at overholde, plette de standardiserede C. neoformans uofs Y-1378 celler, der blev justeret til 1 x 106 celler/ml (i 999 μl PBS) med 1 μl fluorescein isothiocyanat i en 1,5 ml plastrør.
Bemærk: klargøre pletten ved at opløse 1 mg fluorescein isothiocyanat i 1 mL acetone. - Omrystes forsigtigt C. neoformans uofs Y-1378-cellerne på en orbital Shaker, der er indstillet til 50 rpm i 2 timer ved RT og i mørke.
- Efter 2 timer centrifugeres ved 960 x g i 5 minutter ved 30 °c for at pille cellerne.
- Aspirer supernatanten til at fjerne PBS med pletten.
- Tilsæt 1 mL PBS til røret for at vaske celle pellet. Vask cellerne ved forsigtigt at pipettere.
- Cellerne centrifugeres ved 960 x g i 5 minutter ved 30 °c. Kassér supernatanten. Gentag vaske trinnet en gang til.
- De vaskede celler opslæmmes i 1 mL PBS.
- Dispensere en 200 μL suspension af de farvede C. neoformans uofs Y-1378 celler til kammer brønde, der indeholder de ufarvede amøbe celler.
- Den tilberedte Co-kultur inkubates ved 30 °C i yderligere 2 h-perioden.
Bemærk: Co-kulturen kan inkuberet til forskellige tidspunkter, der passer til formålet med eksperimentet. - Ved slutningen af co-inkubationsperioden, aspirere indholdet af brøndene.
- Tilsæt 300 μL PBS til brøndene for at vaske kammer brøndene og fjerne eventuelle ubundne Co-dyrkede celler. Gør dette ved blid pipettering. Aspirere indholdet af brøndene. Gentag vaske trinnet en gang til.
- Den 3% glutaraldehyd opløsning fremstilles ved tilsætning af 3 mL glutaraldehyd til 97 mL destilleret vand.
- Fastgør de Co-dyrkede celler ved at tilsætte 250 μL 3% opløsning til kammer brøndene og inkuberet i 1 time.
- Aspirer fixativ og vask kammeret brønde som beskrevet fra trin 3.1.13.
- Demonterer kammer brøndene ved hjælp af et værktøj, der blev forsynet med kammer gliderne.
- Tilsæt en dråbe af antifade-forbindelsen, 1, 4-diazabicyclo-[2.2.2]-oktan til diaset for at forhindre automatisk blegning. Dæk med en dækseddel og forsegle siderne med en neglelak for at forhindre fordampning.
- Se de Co-dyrkede celler ved hjælp af 100x objektiv linse (med olie) af en confokal laser-scanning mikroskop.
Bemærk: det er vigtigt at tage billeder i lyse-felt og fluorescens for at se interaktion mellem amøbe og kryptokok-celler. Når det er muligt, kan fluorescensen blive super pålagt på de lyse feltbilleder. Amoeba celler er typisk større i størrelse (dvs., 45-60 μm), og trofozoit cellerne har en uregelmæssig form. Cryptococcal celler er 5-10 μm i diameter og har en kugle til ægformede form. Når de udsættes for en laser, er det muligt, at unstained amøbe celler kan udsende Auto-fluorescens. Se Beisker og Dolbeare19 og Clancy og cauller20 for metoder til at reducere autofluorescens.
- Erhvervelse af kvantitative data ved brug af fluorescens plade læser
Bemærk: Udfør denne analyse med Acanthamoeba castellanii og c. neoformans uofs Y-1378 eller c. neoformans lmpe 046.- Der dispenserer en 100 μl suspension af standardiseret amobers (justeret til 1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) til en sort, vedholdende 96 brønd mikrotiterplade.
- Pladen inkubes i 2 timer ved 30 °c, så amøbe-cellerne kan klæbe til overfladen.
- Mens amøbe celler er ved at slå sig ned for at klæbe, plette de standardiserede C. neoformans uofs Y-1378 celler, der blev justeret til 1 x 106 celler/ml (i 999 μl PBS) med 1 μl phrodo grøn zymosan a biopartikler i en 1,5 ml mikrocentrifuge tube. Stain C. neoformans lmpe 046 celler samt i et separat rør.
Bemærk: farvestoffet, i modsætning til FITC, selektivt pletter celler, der er fanget inde i det sure miljø af en Fagocytisk celle21,22. Til denne teknik er det vigtigt at vedligeholde de kryptococcal celler i et medium med en neutral pH (PBS) og amøbe i et medium med en neutral pH (ATCC medium 712). Et medium med et surt miljø vil resultere i en falsk positiv aflæsning af de relative fluorescens enheder, hvilket indebærer, at et større antal kryptokok-er blevet internaliseret. - Omrystes forsigtigt kryptokok--celler på en orbital Shaker, der er indstillet til 50 rpm i 2 timer ved RT og i mørke.
- Efter 2 timer centrifugeres mikrocentrifuge røret ved 960 x g i 5 minutter ved 30 °c for at pille cellerne. Aspirer supernatanten til at fjerne PBS med pletten.
- Tilsæt 1 mL PBS til røret for at vaske de pelleteret celler. Vask cellerne ved skånsom pipettering.
- Cellerne centrifugeres ved 960 x g i 5 minutter ved 30 °c. Kassér supernatanten. Gentag vaske trinnet en gang til.
- Opslæmmes pellet af vaskede celler i 1 mL PBS.
- Dispensere en 100 μl suspension af farvede kryptokok-celler til brønde, der indeholder unstained amøbe celler.
- Den tilberedte Co-kultur inkubates ved 30 °C i yderligere 2 h-perioden.
Bemærk: Co-kulturen kan inkuberet til forskellige tidspunkter, der passer til formålet med eksperimentet. - Ved slutningen af co-inkubationsperioden måles fluorescensen på en mikroplade læser. Konvertér logaritmiske signaler til relative fluorescens enheder.
Bemærk: farvestof excitation er på 492 nm og emission er på 538 nm. Rådfør dig med Beisker og Dolbeare19 og Clancy og cauller20 om metoder til at reducere autofluorescens.
4. brug af transmissionselektronmikroskopi til at studere fagocytose (modificeret fra Van Wyk og Wingfield 23 )
- Der tilsættes en 5 ml suspension af amobers (justeret til 1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) til et 15 ml centrifugeglas, og de kan afregnes i 30 min ved 30 °c.
- Der tilsættes en 5 mL suspension af C. neoformans uofs Y-1378 celler (justeret til 1 x 106 celler/ml i PBS) til det samme centrifugeglas, som indeholder 5 ml standardiserede amøbe celler.
- Lad røret stå i 2 timer ved 30 °C.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 640 x g i 3 minutter ved 30 °c for at pille de Co-dyrkede celler. Aspirere supernatanten. De Co-dyrkede celler må ikke vaskes.
- De Co-dyrkede celler fastsættes ved at resuspendere pellet i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumphosphat-bufferet 3% glutaraldehyd i 3 timer.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 1.120 x g i 5 minutter ved 30 °c for at pille de Co-dyrkede celler. Aspirere supernatanten.
- Tilsæt 5 mL natriumphosphatbuffer til centrifugeglasset for at vaske de pelleteret celler. Vask ved forsigtigt at pipettere indholdet af røret i 20 s.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 1.120 x g i 5 minutter ved 30 °c for at pille de Co-dyrkede celler.
- Gentag trin 4.8-4.10. Aspirere supernatanten.
- Fastgør de Co-dyrkede celler igen ved at suspendere pellet i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumphosphat-Buffered 1% osmium tetroxid for 1,5 h.
- Fiksering (osmium tetroxide) fjernes ved at vaske de Co-dyrkede celler på samme måde for at fjerne 3% glutaraldehyd.
- Dehydrere TEM-materialet (også kendt som de Co-dyrkede celler) i et klassificeret acetoneseries på henholdsvis 30%, 50%, 70%, 95% og to ændringer på 100% for hver 15 min. For at gøre dette, tilsættes 3 mL acetone opløsning til pelleteret celler og lad det stå i 15 min. Derefter centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved rt kassér supernatanten og tilsæt den højere procentdel af acetone opløsningen.
- Forbered epoxy af normal konsistens i henhold til protokollen ved Spur24.
Bemærk: epoxyharpiks anvendes til skæring. - Indarbejd TEM-materialet i den frisk fremstillede epoxyharpiks. Det gør du ved at følge nedenstående trin.
- Der tilsættes 3 mL frisklavet epoxy til et rør, som indeholder TEM-materialet ophængt i 3 mL 100% opløsning af acetone. Lad røret stå i 1 h.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 30 °c. Du aspirerer epoxy-acetone opløsningen.
- Tilsæt 6 mL frisklavet epoxy til pellet i røret. Lad røret stå i 1 h.
- Centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 30 °c. Aspirer alle epoxy-acetone-opløsningen.
- Tilsæt 3 mL frisklavet epoxy til røret. Lad røret stå i 8 timer.
- Centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 30 °c. Aspirer alle epoxy opløsningen
- Tilsæt 3 mL frisklavet epoxy til røret. Opbevar TEM-materialet i epoxy opløsningen natten over i en vakuum-desiccator.
Forsigtig: epoxy harpiks er et radioaktivt materiale. Brug PV til at håndtere epoxyharpiks. Epoxyharpiks bør også håndteres i en røg hætte. Forskerne bør følge sikkerhedsforskrifterne for udsmid af sådant materiale som specificeret af hvert land25.
- Polymeriserer TEM-materialet i 8 timer ved 70 °C.
- På ultramicrotomen, trim små sektioner på ca. 0,1 mm x 0,1 mm og 60 nm tykkelse fra epoxy-indlejret materiale med en monteret glas kniv. Saml sektioner på et gitter, og Placer gitrene i en TEM-prøveholder boks før farvning.
- Pletter sektionerne med et fald på 6% ammoniumuranylcarbonat acetat i 10 min i mørket. Sørg for, at afsnittene er helt dækket. |
Bemærk: rekonstruere pletten (6 g) i 100 mL destilleret vand.
Forsigtig: uranyl acetat er et radioaktivt materiale. Brug PV til at håndtere ammoniumuranylcarbonat acetat. Uranyl acetat bør også håndteres i en røg hætte. Forskerne bør følge sikkerhedsforskrifterne for udsmid af sådant materiale som specificeret af hvert land25. - Skyl sektionerne ved at dyppe dem fem gange i et bægerglas, der indeholder 100 mL destilleret vand.
Bemærk: det destilleret vand skal bortskaffes i overensstemmelse hermed, da det indeholder spor af ammoniumuranylcarbonat acetat. - Pletter afsnittet med en dråbe blycitrat i 10 min i mørket. Sørg for, at afsnittene er helt dækket.
Bemærk: Blycitrat skal udarbejdes i henhold til protokollen af Reynold26. - Skyl sektionerne ved at dyppe dem fem gange i et bægerglas, der indeholder 100 mL destilleret vand.
- Enkeltvis samles gitrene med farvede sektioner på en TEM-prøveholder boks.
- Se sektioner med et transmissions elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrober er mikroskopiske organismer, der ikke kan opfattes med det blotte øje. Men, deres virkning kan resultere i observerbare klinisk indlysende sygdomme, såsom hudinfektioner. Når man studerer visse aspekter af mikrober, der spænder fra deres morfologi, biprodukter, og interaktioner, at være i stand til at give billeder og video beviser er af allerstørste betydning.
Vi søgte først at visualisere samspillet mellem kryptokok-celler og Amoeba. Til dette formål, lyse-feltbilleder, der viste 2 h Co-inkuberet celler blev undersøgt først. Et billede afslørede en kryptokok-celle, der var i nærheden af Amoeba. En af amøbe cellerne blev set med forlænget pseudopodia for at indfange en kryptococcal celle (figur 1a). Dernæst blev et tilsvarende billede i fluorescens registreret for henvisninger (figur 1b). Den grønne fluorescens på overfladen af de farvede celler hjulpet i at bekræfte tilstedeværelsen af kryptokok-celler. Den ubefarvede amøbe også Auto-fluoresced. Dette, ud over den tilsyneladende forskel størrelse og morfologi, bistået i yderligere at skelne de to celletyper.
Autofluorescens er en kvalitet ofte observeret, når biologiske strukturer naturligt udsender lys, at de har absorberet (f. eks efter udsættelse for en laser under konfokale Laserscanning mikroskopi)27. I figur 1c, blev kryptokok-celler noteret (på samme tidspunkt af 2 h), der allerede var internaliseret af Amoeba. Det tilsvarende billede i fluorescens blev også hentet for henvisninger (figur 1d). Baseret på de beviser ved hånden, er det fristende at konk gøre, at amøbe dræbte de to fangede celler. Men, fagocytose er en dynamisk proces, hvor værten, rovdyr og patogen, og Prey ansætte forskellige strategier til at ødelægge eller unddrage sig hinanden28. Den handling af kryptokok-celler unddrage fagocytiske celler er elegant demonstreret af vomocytosis29,30, som er en ikke-lytisk udvisning proces af fangede celler fra makrofager. Denne dristige træk er blevet fanget i time-lapse videoer29,30. Desværre, dette fremhæver begrænsningen af at studere stillbilleder af faste celler, som i vores undersøgelse, at belyse en dynamisk proces som fagocytose. Til det punkt, en forsker kan savne intervallet, når en celle undslipper fra sin Capturer.
For at kompensere for ovenstående blev det overvejet at aflæse relative fluorescens enheder. I den nuværende undersøgelse, blev aflæsninger taget efter en 2 h Co-inkubationsperiode og hjalp til at sammenligne respons af de to test kryptokok-stammer [dvs., en, der producerer 3-hydroxy fedtsyrer (C. neoformans uofs Y-1378) og den anden, der ikke (c. neoformans lmpe 046)]. Det var en hypotese, at 3-hydroxy fedtsyrer kan fungere som en virulens afgørende, der hæmmer optagelsen af kryptokok-celler, herunder fagocytose af Amoeba. For mere information om indflydelsen af 3-hydroxy fedtsyrer på Amoeba, anbefales det at henvise til Madu et al.15,31. Figur 2 viser mængden af kryptococcal-celler, der blev internaliseret baseret på aflæsning af fluorescens enheder. Ved sammenligning af de to kryptokok-isolater, var det klart, at celler, der producerer de 3-hydroxy fedtsyrer blev internaliseret mindre hyppigt sammenlignet med celler, der ikke producerer 3-hydroxy fedtsyrer.
For at forbedre de kvalitative data indgik transmissionelektron mikroskopi i analysen (figur 3a). Her blev det bemærket, at stammen, der producerer 3-hydroxy fedtsyrer (C. neoformans uofs Y-1378) havde strittende protuberancer på kapslen (figur 3b), som kan anvendes af cellen til at frigive 3-hydroxy fedtsyrer til det ydre miljø.
Det er vigtigt at bemærke, at data (i figur 1, figur 3) formidle skæbne kryptokok-celler som internaliseret og ikke dræbt/fagocyteret. For at afgøre, om cellerne overlevede den fagocytiske begivenhed, anbefales det at inkludere en yderligere analyse, hvor forskeren af amøbe cellerne og forbereder en spread Plate agar for at optælle de kryptococcal kolonidannende enheder (CFU). Ved at tælle cfus rapporterede Madu et al.15 , at kryptococcal-celler, der producerede 3-hydroxy fedtsyrer, også var resistente over for den fagocytiske handling af amøbe efter internalisering. Således, disse celler gav en signifikant højere overlevelsesrate i forhold til celler, der ikke producerer 3-hydroxy fedtsyrer.
Figur 4 viser betydningen af TEM-prøveforberedelse og-undersøgelse. I dette tilfælde var C. neoformans uofs Y-1378-sektioner målbevidst overeksponeret for elektron Bombardment. I slutningen kan det optagne billede ikke bruges, da det kompromitterer kvaliteten af de oplysninger, der kan udledes. Samlet, de indhentede oplysninger viser, at ved at kombinere disse forskellige teknikker, en forsker er i stand til at udlede tilstrækkelige oplysninger til at bestemme skæbnen for kryptokok-celler, når Co-kultiveret med Amoeba.
| Ingrediens | Mængde |
| bakteriologisk pepton | 20 g/L |
| gær ekstrakt | 10 g/L |
| Glukose | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tabel 1: ingredienser til fremstilling af YPD agar. Tilsæt den nødvendige mængde alle ingredienserne i 1 L vand. Varme under omrøring for at opløse ingredienserne fuldstændigt. Når det er gjort autoklave før brug.
| Ingrediens | Mængde |
| ammoniumsulfat | 5 g/L |
| Biotin | 2 μg/L |
| calcium pantothenat | 400 μg/L |
| Folinsyre | 2 μg/L |
| Inositol | 2000 μg/L |
| Niacin | 400 μg/L |
| p-aminobenzoinsyre | 200 μg/L |
| pyridoxin hydrochlorid | 400 μg/L |
| Riboflavin | 200 μg/L |
| thiaminhydrochlorid | 400 μg/L |
| borsyre | 500 μg/L |
| kobbersulfat | 40 μg/L |
| kalium kaliumiodid | 100 μg/L |
| jern chlorid | 200 μg/L |
| mangansulfat | 400 μg/L |
| natriummolybdaten | 200 μg/L |
| zinksulfat | 400 μg/L |
| mono kalium fosfat | 1 g/L |
| magnesiumsulfat | 0,5 g/L |
| Natriumchlorid | 0,1 g/L |
| calciumchlorid | 0,1 g/L |
Tabel 2: ingredienser til fremstilling af YNB bouillon. Tilsæt den nødvendige mængde alle ingredienserne i 1 L vand. Varme under omrøring for at opløse ingredienserne fuldstændigt. Når det er gjort autoklave før brug.
| Del I: basal medium. | |
| Ingrediens | Mængde |
| proteose pepton | 20 g/L |
| gær ekstrakt | 1 g/L |
| agar (hvis nødvendigt) | 20 g/L |
| Del II: tillæg. | |
| Ingrediens (stamopløsninger) | Mængde |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7h2O | 10 ml |
| 0,25 M na2HPO4 x 7h2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2po4 | 10 mL |
| Na citrat x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M FE (NH4) 2 (so4) 2 x 6h2O | 10 mL |
Tabel 3: ingredienser til fremstilling af ATCC medium 712. Forbered basal mediet i 900 mL vand. Forbered kosttilskud separat og tilføje til det basale medium. Når du er færdig justere pH til 7,4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH og autoklave. Filter Steriliser 50 mL opløsning af 2 M glucose (18 g/50 mL) og tilsæt aseptisk til det komplette medium før brug.
Figur 1 : Lyse-felt og tilsvarende fluorescerende mikrografer viser amøbe-Cryptococcus interaktive øjeblikke. A) der kan ses en amøbe-celle i umiddelbar nærhed af en C. neoformans uofs Y-1378-celle. Det tilsvarende fluorescerende billede vises i (B). (C) skildring af to C. neoformans uofs Y-1378 celler, der er fanget inde i amøbe Food vakuole. Det tilsvarende fluorescerende billede vises i (D). Dette tal er blevet ændret fra Madu et al.15. A = Amoeba; C = c. neoformans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Resultaterne af internaliserings analysen af kryptococcal-celler, som er co-dyrket med Amoeba. Aflæsning af relative fluorescens enheder giver mulighed for fortolkning og sammenligning af amobers effektivitet for at internalisere c. neoformans uofs Y-1378 og c. neoformans lmpe 046. Fejllinjerne repræsenterer de beregnede standardfejl baseret på tre biologiske replikater. Dette tal er blevet ændret fra Madu et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Transmissions elektron mikrografer, der viser Amoeba- Cryptococcus interaktioner. TEM-mikrografer (a, B) bekræfter observationerne i figur 1c, D. (a) vist er en C. neoformans uofs Y-1378 celle fanget inde i amøbe Food vakuole, mens (B) er et nærbillede af figur 3a . Dette tal er blevet ændret fra Madu et al.15. A = amøbe celle; C = c. neoformans celle. Den røde pil peger på et kapsulært protuberance. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : En transmissions elektron Mikrograf, der viser C. neoformans Uofs Y-1378 celler. Cellerne er beskadigede og kan derfor ikke give meningsfulde data. Røde pile angiver punkter, hvor sektionen er revet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I avisen blev forskellige teknikker med succes anvendt til at afsløre det mulige udfald, der kan opstå, når amøbe interagerer med kryptokok-celler. Også, vi var interesseret i at vise virkningerne af 3-hydroxy fedtsyrer på resultatet af Cryptococcus-Amoeba interaktioner.
Den første anvendte teknik var confokal mikroskopi, som gjorde stillbilleder. Den største ulempe ved denne teknik her var, at det kun gav os oplysninger, der er begrænset til et bestemt tidspunkt. Enhver konklusion, der kan drages på grundlag af resultaterne egner sig til induktive ræsonnement, hvor man kan nå frem til en konklusion baseret på en række observationer32. Men bare fordi man bemærker flere situationer, hvor et mønster eksisterer, betyder ikke, at dette mønster er sandt for alle situationer. Således, i undersøgelsen, er det vist og muligvis advarede om, hvordan sådanne begrænsede oplysninger kan føre til ubegrundede konklusioner. Til det punkt, i mangel af modstridende eller støttende, supplerende beviser, kan det konk ¦ fses, at internalisering kan have ført til fagocytose af celler.
Tempoet i udviklingen i Imaging giver nye muligheder for at gøre videnskabelige opdagelser, som det var tilfældet med afdækningen af vomocytosis29,30. For at illustrere dette punkt uden brug af et mikroskop, der kan optage timelapse-videoer, ville denne opdagelse ikke have været mulig. Derfor vil en manglende adgang til sådanne high-end instrumentering altid være en hindring i ressourcefattige-indstillinger, der ikke er på forkant med at afdække sådanne processer. En måde at overvinde dette på er at opsøge nye samarbejder eller opdage innovative måder at løse forskningsspørgsmål på. En velkommen udvikling har været indførelsen og anvendelsen af specialiserede pletter som den fagocytiske plet, der anvendes her21,22. Denne plet er pH-følsom og fluorescerer kun i sure miljøer som i lumen amøbe fødevarer vakuole15. Det er værd at påpege, at pletten kun giver oplysninger i forbindelse med internalisering af celler. Bestemmelse, hvis cellerne i sidste ende er fagocytiserede i yderligere eksperimenter kan være påkrævet.
Vigtigere er en sådan plet også vist sig at være nyttig i målingen af fluorescens. Sidstnævnte tillod integration af kvantitative data i et forsøg på at forklare, hvad der sker biologisk på et bestemt tidspunkt. Her blev cellernes skæbne konstateret (dvs. det blev fastslået, om tilstedeværelsen af 3-hydroxy-fedtsyrer svækkede eller fremmede internaliseringen af celler) ved at ekstrapolere betydningen fra målingerne af relative fluorescens enheder.
I modsætning til i denne undersøgelse, forskere kan også vælge at måle fluorescens af celler over en periode. De indhentede oplysninger er nyttige til at bestemme antallet af celler, der er internaliseret på et tidspunkt og efter, hvordan beløbet ændres i løbet af perioden. Ligeledes kan billeder også tages på tilsvarende tidspunkter.
Denne undersøgelse viser, at der er mulighed for at kombinere en række metoder for at nå frem til en begrundet konklusion. Tilgangen med at kombinere flere tilgange til at overvåge fagocytose enten at sammenligne eller supplere en indledende teknik er ikke nyt. F. eks. sammenlignede Meindl og kollegaer33 tre teknikker (billedanalyse, fluorescens og flowcytometri-aflæsninger) for at undersøge, hvordan fluorescens-mærket partikelstørrelse påvirker makrofag fagocytose. Undersøgelsen viste, at af de tre teknikker, plade læsning kan være den bedste mulighed for at overvåge fagocytose33.
TEM er især et kraftfuldt værktøj, da det giver et fugleperspektiv i lumen af fødevarer vakuole. Ofte, denne detaljeringsgrad er ofte savnet af confokal mikroskopi i form af stillbilleder, herunder time-lapse videoer. Til dette punkt af TEM, var det interessant at visualisere protuberanser på overfladen af kryptokok-kapsel. Det var tidligere en hypotese, at disse celleoverflade strukturer bruges som en kanal til at frigive 3-hydroxy fedtsyrer i det omgivende miljø for eventuelt at fremme cellens overlevelse9,10,15, 31. detaljerne på tem-mikrografen afslører yderligere, at protuberanser på den internaliserede celle ikke er fordrejet og har bevaret deres integritet. Således (i betragtning af integriteten af de fremstillere), er det muligt, at de kan levere 3-hydroxy fedtsyrer i fødevarer vakuole miljø og ændre interne forhold, der fører til celle overlevelse som rapporteret af Madu et al.15,31. En væsentlig begrænsning af brugen af elektronmikroskopet er, at prøveforberedelsen er meget omstændelig. For at undgå at destruere prøverne som vist i figur 4, skal eksperimententer desuden være veluddannede til manuelt at betjene ultramicrotomen og mikroskop.
Afslutningsvis er det hensigten, at forskerne vil blive tilskyndet af udsigten til at studere fagocytose blot ved at kombinere stadig fluorescerende billeder med kvantitative data. Det er betroet, at forskerne kan få nok oplysninger fra denne protokol og optimere det i deres egne undersøgelser. Dette kan omfatte udvikling af antistoffer mod målrettede metabolitter og anvendelse af dette til immunofluorescens undersøgelser, herunder mærkning med Immuno-guld i forbindelse med TEM-undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af et tilskud fra Sydafrikas National Research Foundation (tilskudsnummer: UID 87903) og universitetet i Free State. Vi er også taknemmelige for tjenester og assistance, der tilbydes af Pieter van Wyk og Hanlie Grobler under vores mikroskopi undersøgelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
