Summary
Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.
Abstract
Per simulare l'infezione da Cryptococcus, l'ameba, che è il predatore naturale delle cellule criptococcali nell'ambiente, può essere utilizzato come modello per i macrofagi. Questo organismo predatorio, simile ai macrofagi, utilizza la fagocitosi per uccidere le cellule interiorizzate. Con l'aiuto di un microscopio a scansione laser confocale, vengono catturate immagini che raffigurano momenti interattivi tra cellule criptococcali e ameba. La potenza di risoluzione del microscopio elettronico aiuta anche a rivelare il dettaglio ultrastrutturale delle cellule criptococcali quando intrappolate all'interno del vacuole alimentare ameba. Poiché la fagocitosi è un processo continuo, i dati quantitativi vengono quindi integrati nell'analisi per spiegare cosa accade nel momento in cui un'immagine viene acquisita. Per essere specifici, le unità di fluorescenza relativa vengono lette al fine di quantificare l'efficienza dell'ameba nell'internalizzare le cellule criptococcali. A questo scopo, le cellule criptococcali sono macchiate con un coloranti che le fa fluorescenza una volta intrappolate all'interno dell'ambiente acido del vacuole alimentare. Se usate insieme, le informazioni raccolte attraverso tali tecniche possono fornire informazioni critiche per aiutare a trarre conclusioni sul comportamento e sul destino delle cellule quando vengono interiorizzate da ameba e, eventualmente, da altre cellule fagocitiche.
Introduction
I microbi si sono evoluti nel tempo per occupare e prosperare in diverse nicchie ecologiche come i confini fisici aperti del suolo e dell'acqua, tra gli altri1. In queste nicchie, i microbi spesso si impegnano nella competizione diretta per risorse limitate; importante, per i nutrienti che usano per sostenere la loro crescita o lo spazio, che hanno bisogno di ospitare la popolazione in espansione2,3. In alcuni casi, alcuni organismi olozoici come l'ameba possono anche precedere le cellule criptococcali come un modo per estrarre sostanze nutritive dalla loro biomassa4,5. A sua volta, questo permette a tali organismi di stabilire il dominio territoriale attraverso il controllo del numero di popolazione della sua preda. A causa di questa pressione predatoria, alcune prede possono essere selezionate per produrre fattori microbici, come la capsula criptococcale6, per riconciliare gli effetti negativi della pressione. Tuttavia, come conseguenza involontaria di questa pressione, alcuni microbi acquisiscono fattori che permettono loro di attraversare la barriera delle specie e cercare nuove nicchie per colonizzare7, come gli spazi confinati del corpo umano che sono ricchi di sostanze nutritive e hanno l'ideale Condizioni. Quest'ultimo può spiegare come un microbo terrestre come Cryptococcus (C.) i neoforman possono trasformarsi per diventare patogeni.
A tal fine, è importante studiare il contatto iniziale che le cellule criptococcali possono avere con ameba e come questo può selezionarli per diventare patogeni. Più specificamente, Questo può dare indizi su come le cellule criptococcali si comportano quando agito su macrofagi durante l'infezione. È per questo motivo che l'ameba è stata scelta come modello per i macrofagi qui, in quanto è relativamente economico e facile mantenere una cultura dell'ameba in un laboratorio8. Di interesse era anche quello di esaminare come i metaboliti secondari criptococcali viz. 3-idrossici acidi grassi9,10 influenzano l'interazione tra amebe e cellule criptococcali.
Un modo semplice per percepire l'interazione tra ameba e la sua preda ad occhio nudo è quello di creare un prato utilizzando la sua preda sulla superficie di un piatto di agar e avvistare l'ameba. La visualizzazione di placche o zone chiare sulla piastra di agar raffigura aree in cui l'ameba può essersi nutrita della sua preda. Tuttavia, a questo macro livello, si nota solo l'esito del processo e il processo di fagocitosi è meccanizzato non può essere osservato. Pertanto, per apprezzare il processo da cellula a cellula, ci sono diversi metodi microscopici che possono essere utilizzati11,12. Ad esempio, un microscopio invertito con una camera di incubazione può essere utilizzato per registrare video di eventi tra una cellula fagocitica e il suo obiettivo13. Purtroppo, a causa del costo di un microscopio con una funzionalità time-lapse, non è sempre possibile per i laboratori acquistare un tale microscopio, soprattutto nelle impostazioni di scarso spazio.
Per aggirare la limitazione di cui sopra, questo studio presenta un disegno esplorativo sequenziale che valuta l'interazione di C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . In primo luogo, viene utilizzato un metodo qualitativo che precede un metodo quantitativo. Le immagini fisse vengono catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito, così come un microscopio elettronico di trasmissione per rappresentare le interazioni ameba-Cryptococcus. Questo è stato seguito dalla quantificazione della fluorescenza utilizzando un lettore di lamiere per stimare l'efficienza dell'ameba per internalizzare le cellule criptococcali. Quando si riconciliano i risultati di questi metodi durante la fase di interpretazione dei dati, ciò può rivelare anche tutte le informazioni critiche come l'utilizzo di un video time-lapse di fagocitosi.
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Protocol
I neoforman di Cryptococcus e alcuni ceppi di Acanthamoeba castellanii sono considerati patogeni di livello di biosicurezza-2 (BSL-2); pertanto, i ricercatori devono prendere le dovute precauzioni quando lavorano con questi organismi. Ad esempio, il personale di laboratorio deve disporre di attrezzature di formazione e protezione personale specifiche (PPE) come camici da laboratorio, guanti e protezione degli occhi. Un armadio di sicurezza biologica (livello 2) deve essere utilizzato per le procedure che possono causare l'infezione14.
1. Coltivazione e standardizzazione delle cellule fungine (modificata da Madu et al. 15 )
- Streak fuori i ceppi fungini di prova (cioè, C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046) da colture stock (non più vecchie di 9 mesi) su piastre di lievito-peptone-dextrose (YPD). Le informazioni sugli ingredienti di YPD agar sono riportate nella Tabella 1.
NOTA: C. neoformans UOFS Y-1378 ha dimostrato di produrre acidi grassi 3-idrossidi, mentre C. neoformans LMPE 046 non produce acidi grassi 3-idrossisci. Fare riferimento al file supplementare 1 per informazioni su come viene determinata la presenza di queste molecole. - Incubare le piastre di agar per 48 h a 30 .
NOTA: Una piastra può essere conservata per un massimo di 2 mesi a 4 gradi centigradi prima di poter essere scartata o utilizzata per fare una coltura stock16. - Raschiare un loop di cellule criptococcali(C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046) dalla piastra di 48 h-old e inoculate in un pallone connico da 250 mL contenente 100 mL del brodo YNB (6,7 g/L) chimicamente definito integrato con il 4% ( w/v) glucosio. Le informazioni sugli ingredienti del brodo YNB sono riportate nella tabella 2.
- Incubare i flaconi a 30 gradi centigradi per 24 h mentre si agita a 160 giri/min su uno shaker rotativo.
- Dopo un periodo di incubazione di 24 h, contare le cellule fungine utilizzando un emocitometro e regolare il numero di cellulare a 1 x 106 cellule / mL con PBS a pH 7.4.
NOTA: l'inoculum Di C. neoformans preparato UOFS Y-1378 è stato utilizzato nei passaggi 3.1 e 3.2, mentre C. neoformans LMPE 046 inoculum è stato utilizzato solo nel passaggio 3.2.
2. Coltivazione e standardizzazione delle cellule di ameba (modificate da Madu et al. 15 )
- Scongelare una cultura stock di Acanthamoeba castellanii e portarla a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Amoeba è stata preparata sulla base dei protocolli modificati di Axelsson-Olsson et al.8 e Schuster17. - Pipetta 1 mL della coltura scongelata e inocularla in un tubo centrifuga tollente da 50 mL contenente 15 mL di MEDIA ATCC 712. Le informazioni sugli ingredienti medi di ATCC 712 sono riportate nella tabella 3.
- Agitare delicatamente e immediatamente centrifugare per 5 min a 400 x g e 30 gradi centigradi.
- Aspirare il super-attuoso.
- Risospendere le cellule in 15 mL del mezzo ATCC 712 e incubare il tubo a 30 gradi centigradi per 14 giorni.
NOTA: Controllare periodicamente le cellule, utilizzando un semplice microscopio luminoso, per determinare se sono in uno stato di trofozoite. Una volta che sono in uno stato di trofozoite, iniziare una nuova cultura. - Pipetta 1 mL da una coltura che mostra le cellule in uno stato di trofozoite e usarlo per inoculare un tubo di centrifugatura sterile 50 mL contenente 15 mL di fresco, sterile ATCC medio 712.
- Incubare il tubo a 30 gradi centigradi per 1 settimana mentre si agita a 160 giri/min su uno shaker rotante.
- Dopo una settimana, contare le cellule amebe utilizzando un emocitometro e regolare il numero di cellulare a 1 x 107 cellule / mL con fresco, sterile ATCC medio 712.
- Esegui un saggio di fattibilità utilizzando una macchia blu trypan come descritto da Strober18. Procedere ulteriormente con le culture che mostrano almeno l'80% di fattibilità.
3. Colorazione fluorescenza delle cellule per studiare la fagocitosi (modificata da Madu et al. 15 )
- Raccolta di dati qualitativi attraverso l'uso del microscopio a fluorescenza
NOTA: Esegui questo test con Acanthamoeba castellanii e C. neoformans UOFS Y-1378.- Distribuisci una sospensione di 200 gradi di amebe standardizzate (1 x 107 cellule/mL nel mezzo ATCC 712) in pozze di scorrimento aderente e incuba per 2 h a 30 gradi per le cellule per aderire alla superficie.
- Mentre le cellule di ameba si stanno assediando per aderire, macchiare le cellule standardizzate C. neoformans UOFS Y-1378 che sono state regolate a 1 x 106 cellule / mL (in 999 l di PBS) con 1 l of fluorescein isothiocyanate in un tubo di plastica da 1,5 mL.
NOTA: Preparare la macchia sciogliendo 1 mg di isotoniocianato da fluoresceina in 1 mL di acetone. - Agitare delicatamente le cellule C. neoformans UOFS Y-1378 su uno shaker orbitale fissato a 50 rpm per 2 h a RT e al buio.
- Dopo 2 h, centrifugare a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pelletare le cellule.
- Aspirare il supernatante per rimuovere il PBS con la macchia.
- Aggiungere 1 mL di PBS al tubo per lavare il pellet cellulare. Lavare le cellule pipettando delicatamente.
- Centrifugare le cellule a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Risospendere le cellule lavate in 1 mL di PBS.
- Distribuisci una sospensione di 200 gradi delle cellule colorate C. neoformans UOFS Y-1378 in pozzi da camera contenenti le cellule di ameba non colorate.
- Incubare la co-cultura preparata a 30 gradi centigradi per un ulteriore periodo di 2 ore.
NOTA: La co-cultura può essere incubata per diversi punti temporali per soddisfare lo scopo dell'esperimento. - Alla fine del periodo di co-incubazione, aspirare il contenuto dei pozzi.
- Aggiungere 300 l di PBS ai pozze per lavare i pozze da camera e rimuovere eventuali celle cocoltivate non legate. Fatelo con un dolce pipettaggio. Aspirare il contenuto dei pozzi. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Preparare la soluzione di glutaraldeide 3% aggiungendo 3 mL di glutaraldeide a 97 mL di acqua distillata.
- Fissare le cellule co-coltivate aggiungendo 250 luna di soluzione del 3% ai pozze della camera e incubando per 1 h.
- Aspirare il fissativo e lavare i pozzi della camera come dettagliato dal passaggio 3.1.13.
- Smontare i pozze da camera utilizzando uno strumento che è stato fornito con i vetrini della camera.
- Aggiungere una goccia del composto anti-dissolvenza, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octane alla diapositiva per evitare lo sbiancamento automatico. Coprire con un coperchio e sigillare i lati con uno smalto per evitare l'evaporazione.
- Visualizza le cellule co-coltivate usando l'obiettivo 100x (con olio) di un microscopio a scansione laser confocale.
NOTA: È importante scattare foto in campo luminoso e fluorescenza per visualizzare l'interazione tra ameba e cellule criptococcali. Ove possibile, la fluorescenza può essere sovraimposta alle immagini a campo luminoso. Le cellule di ameba hanno in genere dimensioni maggiori (cioè 45-60 m), e le cellule trofozoite hanno una forma irregolare. Le cellule criptococcio hanno un diametro di 5-10 m e hanno una forma da globose a ovoide. Quando sono esposte a un laser, è possibile che le cellule amebe instaine possano emettere auto-fluorescenza. Fare riferimento a Beisker e Dolbeare19 e Clancy e Cauller20 per i metodi per ridurre l'autofluorescenza.
- Acquisizione di dati quantitativi tramite l'uso del lettore di lastre a fluorescenza
NOTA: Eseguire questo test con Acanthamoeba castellanii e C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046.- Eroga una sospensione da 100 litri di amebe standardizzata (regolata a 1 x 107 cellule/mL nel mezzo ATCC 712) in una piastra nera aderente 96 well microtiter.
- Incubare la piastra per 2 h a 30 s per consentire alle cellule di ameba di aderire alla superficie.
- Mentre le cellule di ameba si stanno assediando per aderire, macchiare le cellule standardizzate C. neoformans UOFS Y-1378 che sono state regolate a 1 x 106 cellule / mL (in 999 l l di PBS) con 1 l of pHrodo Green zemosan A BioParticles in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml. Macchie C. neoformans LMPE 046 cellule e in un tubo separato.
NOTA: Il coloranti, a differenza del FITC, macchia selettivamente le cellule che sono intrappolate all'interno dell'ambiente acido di una cellula fagocitica21,22. Per questa tecnica, è importante mantenere le cellule criptocococcali in un mezzo con un pH neutro (PBS) e un'ameba in un mezzo con un pH neutro (ATCC medium 712). Un mezzo con un ambiente acido si tradurrà in una lettura falsa positiva delle unità di fluorescenza relative, il che implica che un maggior numero di criptococcali sono stati internalizzati. - Agitare delicatamente le cellule criptococcali su uno shaker orbitale fissato a 50 rpm per 2 h a RT e al buio.
- Dopo 2 h, centrificare il tubo di microcentrifuga a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pelletare le cellule. Aspirare il supernatante per rimuovere PBS con la macchia.
- Aggiungere 1 mL di PBS al tubo per lavare le cellule pellete. Lavare le cellule con una leggera pipettatura.
- Centrifugare le cellule a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Risospendere il pellet delle cellule lavate in 1 mL di PBS.
- Distribuisci una sospensione di 100 gradi di sospensione delle cellule criptococcali macchiate in pozzi contenenti cellule ameba non colorate.
- Incubare la co-cultura preparata a 30 gradi centigradi per un ulteriore periodo di 2 ore.
NOTA: La co-cultura può essere incubata per diversi tempi per soddisfare lo scopo dell'esperimento. - Alla fine del periodo di co-incubazione, misurare la fluorescenza su un lettore di microplacino. Convertire i segnali logaritmici in unità di fluorescenza relative.
NOTA: l'eccitazione del tinri è a 492 nm e l'emissione è a 538 nm. Consulta Beisker e Dolbeare19 e Clancy e Cauller20 per metodi per ridurre l'autofluorescenza.
4. Uso della microscopia elettronica a trasmissione per studiare la fagocitosi (modificato da van Wyk e Wingfield 23 )
- Aggiungere una sospensione di 5 mL di amebae (regolata a 1 x 107 celle / mL in ATCC medio 712) a un tubo di centrifuga di 15 mL e consentire loro di accontentarsi di 30 min a 30 .
- Aggiungere una sospensione di 5 mL delle cellule UOFS Y-1378 di C. neoformans (regolate a 1 x 106 cellule/ mL in PBS) allo stesso tubo centrifuga che contiene 5 mL di cellule amebe standardizzate.
- Lasciare il tubo riposare per 2 h a 30 gradi centigradi.
- Centrifugare il tubo a 640 x g per 3 min a 30 gradi centigradi per pellet aree reflue le cellule co-coltivate. Aspirare il super-attuoso. Non lavare le cellule cocoltivate.
- Fissare le cellule co-coltivate rispendendo il pellet in 3 mL di 1,0 M (pH - 7,0) di sodio bufferizzato 3% glutaraldeide per 3 h.
- Centrifugare il tubo a 1.120 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pellet aree celle co-coltivate. Aspirare il super-attuoso.
- Aggiungere 5 mL di tampone di fosfato al tubo centrifuga per lavare le cellule pellete. Lavare con delicatamente il contenuto del tubo per 20 s.
- Centrifugare il tubo a 1.120 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pellet aree celle co-coltivate.
- Ripetere i passaggi da 4.8 a 4.10. Aspirare il super-attuoso.
- Fissare nuovamente le cellule co-coltivate risuspendendo il pellet in 3 mL di 1,0 M (pH - 7,0) di fosforo bufferizzato 1% tetrossido di osmio per 1,5 h.
- Rimuovere il fissativo (osmio tetrossido) lavando le cellule co-coltivate in modo simile alla rimozione del 3% di glutaraldeide.
- Disidratare il materiale TEM (noto anche come cellule co-coltivate) in un acetoneserie di grado del 30%, 50%, 70%, 95% e due cambi del 100% per 15 min ciascuno, rispettivamente. Per farlo, aggiungere 3 mL della soluzione di acetone alle celle pellete e lasciarlo riposare per 15 min. Quindi, centrifugare a 200 x g per 10 min a RT Scartare il supernatante e aggiungere la più alta percentuale della soluzione di acetone.
- Preparare la resina epossidica della normale consistenza secondo il protocollo di Spur24.
NOTA: la resina epossidica viene utilizzata per la sezionamento. - Incorporare il materiale TEM nella resina epossidica appena preparata. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
- Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata a un tubo contenente il materiale TEM risospeso in 3 mL di soluzione 100% di acetone. Lasciare riposare il tubo per 1 ora.
- Centrifugare il tubo a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirare la soluzione epossidica-acetone.
- Aggiungere 6 mL della resina esinae appena preparata al pellet nel tubo. Lasciare riposare il tubo per 1 ora.
- Centrifuga a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirate tutta la soluzione epossidica-acetone.
- Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata al tubo. Lasciare riposare il tubo per 8 ore.
- Centrifuga a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirati tutta la soluzione epossidica
- Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata al tubo. Conservare il materiale TEM nella soluzione epossidica durante la notte in un desiccatore sottovuoto.
AVVISO: La resina epossidica è un materiale radioattivo. Utilizzare PPE per gestire la resina epossidica. La resina epossidica deve essere maneggiata anche in un cofano di fumi. I ricercatori devono seguire le norme di sicurezza per lo scarto di tale materiale come specificato da ogni paese25.
- Polimerizzare il materiale TEM per 8 h a 70 gradi centigradi.
- Sull'ultramicrotome, tagliare piccole sezioni di circa 0,1 mm x 0,1 mm e 60 nm di spessore dal materiale epossidico-incorporato con un coltello in vetro montato. Assemblare sezioni su una griglia e posizionare le griglie in una scatola portante del campione TEM prima di colorare.
- Macchia le sezioni con una goccia del 6% di acetato di uranilo per 10 min al buio. Assicurarsi che le sezioni siano completamente coperte.
NOTA: Ricostituire la macchia (6 g) in 100 mL di acqua distillata.
AVVISO: L'acetato di urane è un materiale radioattivo. Utilizzare PPE per gestire l'acetato di uranilo. L'acetato di uranilo deve essere maneggiato anche in una cappa di fumi. I ricercatori devono seguire le norme di sicurezza per lo scarto di tale materiale come specificato da ogni paese25. - Risciacquare le sezioni immergendole cinque volte in un becher contenente 100 mL di acqua distillata.
NOTA: L'acqua distillata deve essere smaltita di conseguenza in quanto contiene tracce di acetato di uranilo. - Macchiare la sezione con una goccia di citrato di piombo per 10 min al buio. Assicurarsi che le sezioni siano completamente coperte.
NOTA: il citrato di piombo deve essere preparato secondo il protocollo da Reynold26. - Risciacquare le sezioni immergendole cinque volte in un becher contenente 100 mL di acqua distillata.
- Assemblare singolarmente le griglie con sezioni colorate su una scatola portacampioni TEM.
- Visualizzare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione.
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Representative Results
I microbi sono organismi microscopici che non possono essere percepiti ad occhio nudo. Tuttavia, il loro impatto può provocare malattie clinicamente evidenti osservabili, come le infezioni cutanee. Quando si studiano alcuni aspetti dei microbi, che vanno dalla loro morfologia, sottoprodotti e interazioni, essere in grado di fornire prove pittoriche e video è della massima importanza.
Per prima cosa abbiamo cercato di visualizzare l'interazione tra cellule criptococcali e ameba. A questo scopo, sono state studiate per prime immagini a campo luminoso che hanno mostrato 2 h di cellule co-incubate. Un'immagine ha rivelato una cellula criptococcale che era nelle immediate vicinanze di ameba. Una delle cellule ameba è stata vista con pseudopodi a estensione per catturare una cellula crittografica (Figura 1A). Successivamente, è stata acquisita un'immagine corrispondente in fluorescenza per il riferimento (Figura 1B). La fluorescenza verde sulla superficie delle cellule macchiate ha aiutato a confermare la presenza di cellule criptococcali. Anche l'ameba incontaminata si auto-fluoresce. Questo, oltre all'apparente dimensione della differenza e alla morfologia, ha contribuito a distinguere ulteriormente i due tipi di cellule.
L'autofluorescenza è una qualità spesso osservata quando le strutture biologiche emettono naturalmente luce che hanno assorbito (ad esempio, a seguito dell'esposizione a un laser durante la microscopia a scansione laser confocale)27. Nella figura 1C, sono state notate cellule criptococcali (nello stesso punto temporale di 2 h) che erano già internalizzate da ameba. L'immagine corrispondente in fluorescenza è stata acquisita anche per riferimento (Figura 1D). Sulla base delle prove a portata di mano, si è tentati di concludere che l'ameba ha ucciso le due cellule intrappolate. Tuttavia, la fagocitosi è un processo dinamico in cui l'ospite, predatore e patogeno, e le prede impiegano diverse strategie per distruggere o eludere l'un l'altro28. L'atto delle cellule criptococciche che elucono le cellule fagocitiche è elegantemente dimostrato dalla vomocitosi29,30, che è un processo di espulsione non litico di macrofagi. Questa mossa audace è stata catturata nei video time-lapse29,30. Purtroppo, questo mette in evidenza la limitazione dello studio di immagini fisse di cellule fisse, come nel nostro studio, per chiarire un processo dinamico come la fagocitosi. Al punto, un ricercatore può perdere l'intervallo quando una cellula fuoriesce dal suo catturatore.
Per compensare quanto sopra, è stata presa in considerazione la lettura di unità di fluorescenza relative. Nello studio attuale, le letture sono state prese dopo un periodo di co-incubazione di 2 h e hanno contribuito a confrontare la risposta dei due ceppi criptococcali di prova [cioè, uno che produce 3-acidi grassi idrossisci (C. neoformans UOFS Y-1378) e l'altro che non lo fa (C. neoformans LMPE 046)]. È stato ipotizzato che gli acidi grassi 3-idrossidi possono agire come un determinante virulenza che compromette l'assorbimento delle cellule criptococcali, tra cui la fagocitosi da ameba. Per ulteriori informazioni sull'influenza di 3 acidi grassi idrossisti sull'ameba, si consiglia di fare riferimento a Madu et al.15,31. Figura 2 Mostra la quantità di cellule criptococcali che sono state internalizzate in base alla lettura di unità di fluorescenza. Confrontando i due isolati criptococcali, era chiaro che le cellule che producono gli acidi grassi 3-idrossici sono state internalizzate meno frequentemente rispetto alle cellule che non producono acidi grassi 3-idrossi.
Per migliorare i dati qualitativi, la microscopia elettronica di trasmissione è stata inclusa nell'analisi (Figura 3A). Qui, è stato notato che il ceppo che produce 3 acidi grassi idrossido (C. neoformans UOFS Y-1378) aveva protuberanze appuntite sulla capsula (Figura 3B), che possono essere utilizzate dalla cellula per rilasciare 3-idrossici acidi grassi all'ambiente esterno.
È importante notare che i dati (nella Figura 1, Figura 3) trasmettono il destino delle cellule criptococcali come internalizzati e non uccisi / fagocito. Per determinare se le cellule sono sopravvissute all'evento fagocitico, si consiglia di includere un ulteriore saggio in cui il ricercatore lide le cellule di ameba e prepara un agar piastra diffusione per enumerare la colonia criptococcica formando unità (CFU). Contando le CFU, Madu et al.15 hanno riferito che le cellule criptocococcali che producono acidi grassi 3-idrossici erano anche resistenti all'azione fagocitica dell'ameba dopo l'internalizzazione. Così, queste cellule hanno prodotto un tasso di sopravvivenza significativamente più alto rispetto alle cellule che non producono acidi grassi 3-idrossi.
La figura 4 mostra l'importanza della preparazione e dell'esame dei campioni TEM. In questo caso, il C. neoformans UOFS Y-1378 sezioni sono state volutamente sovraesposte al bombardamento di elettroni. Alla fine, l'immagine catturata non può essere utilizzata, in quanto compromette la qualità delle informazioni che possono essere dedotte. Nel loro insieme, le informazioni ottenute mostrano che combinando queste diverse tecniche, un ricercatore è in grado di dedurre informazioni sufficienti per determinare il destino delle cellule criptococcali quando co-coltivate con ameba.
| Ingrediente | quantità |
| peptone batteriologico | 20 g/L |
| Estratto di lievito | 10 g/L |
| glucosio | 20 g/L |
| agar-agar m inv | 15 g/L |
Tabella 1: Ingredienti per fare YPD agar. Aggiungere la quantità richiesta di tutti gli ingredienti in 1 L di acqua. Riscaldare mescolando mescolando per sciogliere completamente gli ingredienti. Una volta fatto autoclave prima dell'uso.
| Ingrediente | quantità |
| solfato di ammonio | 5 g/L |
| Biotina | 2 g/L |
| pantotone di calcio | 400 g/L |
| acido folico | 2 g/L |
| Inositolo | 2000 g/L |
| Niacina | 400 g/L |
| acido p-aminobenzoico | 200 g/L |
| cloruro pirossina | 400 g/L |
| riboflavina | 200 g/L |
| tiamina cloruro | 400 g/L |
| acido borico | 500 g/L |
| solfato di rame | 40 g/L |
| iodio di potassio | 100 g/L |
| cloruro ferrico | 200 g/L |
| solfato di manganese | 400 g/L |
| molybdate di sodio | 200 g/L |
| solfato di zinco | 400 g/L |
| fosfato monopotassio | 1 g/L |
| solfato di magnesio | 0,5 g/L |
| cloruro di sodio | 0,1 g/L |
| cloruro di calcio | 0,1 g/L |
Tabella 2: Ingredienti per la realizzazione del brodo YNB. Aggiungere la quantità richiesta di tutti gli ingredienti in 1 L di acqua. Riscaldare mescolando mescolando per sciogliere completamente gli ingredienti. Una volta fatto autoclave prima dell'uso.
| Parte I: Mezzo basale. | |
| Ingrediente | quantità |
| peptone proteoso | 20 g/L |
| Estratto di lievito | 1 g/L |
| agar (se necessario) | 20 g/L |
| Parte II: Supplementi. | |
| Ingrediente (soluzioni di stock) | quantità |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7H2O | 10 ml |
| 0,25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 mlL |
| 0.25 M KH2PO4 | 10 mL |
| Na Citrate x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M Fe(NH4)2(SO4)2 x 6H2O | 10 mL |
Tabella 3: Ingredienti per la realizzazione di 712 media ATCC. Preparare il mezzo basale in 900 mL d'acqua. Preparare i supplementi separatamente e aggiungere al mezzo basale. Una volta fatto regolare il pH a 7.4 con 1 N HCl o 1 N NaOH e autoclave. Filtrare sterilizzare soluzione 50 mL di 2 M glucosio (18 g/50 mL) e aggiungerlo asellicamente al mezzo completo prima dell'uso.
Figura 1 : Micrografie fluorescenti e di campo luminoso che mostrano ameba- Cryptococcus momenti interattivi. (A) Si può vedere una cellula ameba in prossimità di una cellula C. neoformans UOFS Y-1378. L'immagine fluorescente corrispondente è mostrata in (B). (C) Rappresentazione di due cellule C. neoformans UOFS Y-1378 che sono intrappolate all'interno del vacuole alimentare ameba. L'immagine fluorescente corrispondente è mostrata in (D). Questa cifra è stata modificata da Madu et al.15. A ameba; C - C. neoformans. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : I risultati del saggio di internalizzazione delle cellule criptococcali co-coltivate con ameba. La lettura delle unità di fluorescenza relative consente l'interpretazione e il confronto dell'efficienza delle amebe per interiorizzare C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046. Le barre di errore rappresentano gli errori standard calcolati in base a tre repliche biologiche. Questa cifra è stata modificata da Madu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Micrografie elettroniche di trasmissione che mostrano ameba- Criptococco interazioni. Le micrografie TEM (A, B) confermano le osservazioni nella figura 1C,D. (A) Mostrato è una cellula C. neoformans UOFS Y-1378 intrappolata all'interno del vacuole alimentare ameba, mentre (B) è una vista ravvicinata della figura 3A . Questa cifra è stata modificata da Madu et al.15. A cella ameba; Cella C. neoformans. La freccia rossa indica una protuberanza capsulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Un micrografo elettronico a trasmissione che mostra C. neoformans Cellule UOFS Y-1378. Le celle sono danneggiate e pertanto non possono fornire dati significativi. Le frecce rosse indicano i punti in cui viene strappata la sezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel documento, diverse tecniche sono state impiegate con successo per rivelare il possibile risultato che può sorgere quando l'ameba interagisce con le cellule criptococcali. Inoltre, eravamo interessati a mostrare gli effetti degli acidi grassi 3-idrossici sul risultato delle interazioni Cryptococcus-amoeba.
La prima tecnica utilizzata è stata la microscopia confocale, che ha reso le immagini fisse. Il principale inconveniente di questa tecnica è stato che ci ha fornito solo informazioni che sono limitate a un particolare punto di tempo. Qualsiasi conclusione che si possa trarre sulla base dei risultati si presta al ragionamento induttivo, in cui si può giungere a una conclusione basata su una serie di osservazioni32. Tuttavia, solo perché si osservano diverse situazioni in cui esiste un modello non significa che tale modello è vero per tutte le situazioni. Pertanto, nello studio, è dimostrato ed eventualmente messo in guardia come tali informazioni limitate possano portare a conclusioni infondate. Al punto, in assenza di prove complementari contraddittorie o complementari, si può concludere che l'internalizzazione può aver portato alla fagocitosi delle cellule.
Il ritmo di sviluppo nell'imaging offre nuove opportunità per fare scoperte scientifiche, come nel caso della scoperta della vomocitosi29,30. Per illustrare questo punto senza l'uso di un microscopio in grado di registrare video time-lapse, questa scoperta non sarebbe stata possibile. Pertanto, la mancanza di accesso a tale strumentazione di fascia alta sarà sempre un ostacolo alle impostazioni di scarso livello di risorse che non sono in prima linea nella scoperta di tali processi. Un modo per superarlo è cercare nuove collaborazioni o scoprire modi innovativi per affrontare le domande di ricerca. Uno sviluppo positivo è stato l'introduzione e l'applicazione di macchie specializzate come la macchia fagocitica utilizzata qui21,22. Questa macchia è sensibile al pH e fluorescesa solo in ambienti acidi come nel lume di vacuole alimentare ameba15. Vale la pena sottolineare che la macchia fornisce solo informazioni relative all'internalizzazione delle cellule. Determinare se le cellule sono alla fine fagocito in ulteriori esperimenti può essere necessaria.
È importante sottolineare che tale macchia si è dimostrata utile anche nella misurazione della fluorescenza. Quest'ultimo ha permesso l'integrazione di dati quantitativi nel tentativo di spiegare ciò che accade biologicamente in un determinato momento. In questo caso, il destino delle cellule è stato discernuto (cioè, è stato determinato se la presenza di acidi grassi 3-idrossici compromessa o promosso l'internalizzazione delle cellule) estrapolando significato dalle letture di unità di fluorescenza relative.
A differenza di questo studio, i ricercatori possono anche scegliere di misurare la fluorescenza delle cellule in un periodo di tempo. Le informazioni ottenute sono utili per determinare il numero di celle che vengono internalizzate in un punto temporale e seguendo come cambia l'importo nel periodo. Allo stesso modo, le immagini possono anche essere scattate nei momenti corrispondenti.
Questo studio mostra il potere di combinare una serie di metodi per giungere a una conclusione ragionata. L'approccio di combinare più approcci per monitorare la fagocitosi per confrontare o integrare una tecnica iniziale non è nuovo. Ad esempio, Meindl e i collaboratori33 hanno confrontato tre tecniche (analisi delle immagini, fluorescenza e letture di citometria di flusso) per studiare in che modo le dimensioni delle particelle etichettate con fluorescenza influiscono sulla fagocitosi macrofacitosi. Lo studio ha dimostrato che delle tre tecniche, la lettura delle piastre può essere l'opzione migliore per monitorare la fagocitosi33.
TEM è particolarmente uno strumento potente, in quanto fornisce una vista a volo d'uccello nel lume del vacuole alimentare. Spesso, questo livello di dettaglio è spesso mancato dalla microscopia confocale sotto forma di immagini fisse, compresi i video time-lapse. A questo punto del TEM, è stato interessante visualizzare le protuberanze sulle superfici della capsula criptococcale. In precedenza è stato ipotizzato che queste strutture superficiali cellulari sono utilizzate come canale per rilasciare 3-idrossici acidi grassi nell'ambiente circostante per promuovere eventualmente la sopravvivenza cellulare9,10,15, 31. Il dettaglio del micrografo TEM rivela inoltre che le protuberanze sulla cellula interiorizzata non sono distorte e ne hanno mantenuto l'integrità. Così (data l'integrità delle protuberanze), è possibile che possano fornire 3 acidi grassi idrossici nell'ambiente vacuole alimentare e alterare le condizioni interne, portando alla sopravvivenza delle cellule come riportato da Madu et al.15,31. Una delle principali limitazioni dell'uso del microscopio elettronico è che la preparazione del campione è molto laboriosa. Inoltre, per evitare di distruggere i campioni come si vede nella Figura 4, lo sperimentatore dovrebbe essere ben addestrato per operare manualmente l'ultramicrotome e il microscopio.
In conclusione, si prevede che i ricercatori saranno incoraggiati dalla prospettiva di studiare la fagocitosi semplicemente combinando immagini ancora fluorescenti con dati quantitativi. Si stima che i ricercatori possono ottenere informazioni sufficienti da questo protocollo e ottimizzarlo nei propri studi. Ciò può includere lo sviluppo di anticorpi contro i metaboliti mirati e l'applicazione di questo agli studi di immunofluorescenza, compresa l'etichettatura immuno-oro durante l'esame TEM.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Research Foundation of South Africa (numero di sovvenzione: UID 87903) e dell'Università dello Stato Libero. Siamo anche grati ai servizi e all'assistenza offerti da Pieter van Wyk e Hanlie Grobler durante i nostri studi di microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
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