Summary
Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.
Abstract
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.
Introduction
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular1. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica2 que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos3. Se ha propuesto clasificar estas polarizaciones utilizando la llamada dicotomía M1/M2, M1 representa pro-inflamatoria y M2 representa macrófagos antiinflamatorios. Este modelo se ajusta bien en diferentes situaciones patológicas como infecciones agudas, alergias y obesidad4. Sin embargo, en los tejidos crónicamente inflamados y cáncer, se ha demostrado que esta clasificación es incapaz de captar el amplio repertorio fenotípico que los macrófagos presentan en determinados ambientes celulares5,6, 7. el consenso actual es que polarización macrófago se describe mejor usando un modelo multidimensional para integrar señales microambiental específicas8. Esta conclusión ha sido confirmada mediante análisis transcriptómico de macrófagos humanos que muestra que el modelo M1/M2 es ineficiente en la descripción de las polarizaciones obtuvo9.
El estudio presentado tiene como objetivo ofrecer un protocolo para obtener firmas de Proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Describimos cómo diferenciar los macrófagos humanos en entornos de varios niveles de oxígeno y obtener péptidos de proteoma todo macrófagos para llevar a cabo una cuantificación de etiqueta-libre. Esta cuantificación permite la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas. Como investigación en células madre ha puesto de manifiesto la importancia del oxígeno como un parámetro clave ambiental10, buscamos entender cómo este parámetro de tejido puede influir polarización de macrófagos en los seres humanos. La presión parcial de oxígeno se ha encontrado al rango de 3 a 20% (de la presión atmosférica total) en el cuerpo humano, donde el 20% corresponde aproximadamente a lo que comúnmente se utiliza en una incubadora de cultivo celular (el valor exacto es alrededor 18.6% mientras que la presencia de agua en cuenta).
Trabajo previo ha demostrado que difieren alveolar de macrófagos intersticiales de funcional y morfológico punto de vista11 y estas diferencias son probablemente parcialmente debido a los niveles de oxígeno diferentes a los que están expuestos12. Además, macrófagos derivados de médula ósea muestran una mayor capacidad que fagocitan bacterias cuando están expuestos a un bajo nivel de oxígeno medio ambiente12. El efecto contrario se ha encontrado para macrófagos humanos THP1 distinguido13, pero estos resultados apoyan la idea de que el oxígeno es un regulador de la biología del macrófago y que es necesario aclarar esta función a nivel molecular en macrófagos humanos. En un estudio anterior, hemos aplicado un enfoque de la proteómica para tratar estos temas. Al medir los niveles de expresión de miles de proteínas al mismo tiempo, destacó el impacto del oxigeno sobre polarización y proporciona una lista de nuevos marcadores moleculares. También fuimos capaces de relacionar estos resultados para algunas funciones de los macrófagos. En particular, encontramos que la tasa de fagocitosis de células apoptóticas se incrementó en macrófagos IL4/IL13-polarizado, que estuvo vinculado a la regulación al alza de ALOX15 según lo revelado por el análisis proteómico del14. En el presente estudio, describimos cómo realizar tal análisis.
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Protocol
Se obtuvieron muestras de sangre humana (LRSC) de donantes sanos, anónima de EFS (servicio nacional de sangre francesa) como parte de un protocolo autorizado (CODECOH CC-2018-3114). Los donantes dieron consentimiento firmado para el uso de sangre.
1. los medios y preparación del tampón
- Preparar el medio de macrófagos [RPMI glutamax + 10 mM HEPES 1 x aminoácidos no esenciales (AANE)] y caliente a 37 ° C.
- Preparar el medio de macrófagos + 10% de suero humano de plasma AB (SAB), filtrarla (0.22 μm filtro), y luego calentarlo a 37 ° C (conocido como macrófago mediana + 10% SAB en adelante).
- Preparar el búfer de clasificación [1 x de tampón fosfato salino (PBS) + 0,5% albúmina de suero bovino (BSA) + ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA)], filtrarla (0.22 μm filtro) y mantener a 4 ° C.
2. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la cámara de sistema Leukoreduction (LRSC)
- Colocar 15 mL de solución de la separación de densidad gradiente de la célula (véase Tabla de materiales) en 50 mL tubo de centrifugación por lo que puede calentar a la temperatura ambiente (RT) antes de recibir la LRSC.
Nota: La densidad depende de la temperatura. Como este producto se almacena a 4 ° C, este paso debe hacerse por adelantado por lo que puede equilibrar a RT. - Vacíe la LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mL, añadir hasta 50 mL de PBS 1 x y mezclar. Muy lentamente, añadir 25 mL de la mezcla preparada en el paso 2.2 sobre 15 mL de solución de densidad gradiente calentado durante el paso 2.1.
Nota: Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso. La sangre debe agregarse a la solución del gradiente de densidad sin cualquier perturbación de esta fase. - Centrifugar los tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 g de x sin pausas.
Nota: Al final de la centrifugación del gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son: los eritrocitos y los granulocitos formando los pellets, fase de solución gradiente de densidad, capa de PBMCs y plasma. - Con una pipeta, pasar por la fase de plasma sin lo aspiración y recoger la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mL. Añadir a 50 mL de 1 x PBS a las PBMCs como un paso de lavado y centrifugar durante 10 min a 300 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL de medio de macrófagos.
3. etiquetado magnético y aislamiento de CD14 (monocitos) de las células+
- Cuenta las PBMCs en una cámara Malassez. Retirar la cantidad de PBMCs necesarios para llevar a cabo el experimento (típicamente 100 a 300 x 106 células), colóquelos en un tubo de centrifugación y centrifugar durante 10 min a 300 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 80 μl de la solución de clasificación preparada en el paso 1.3 por 107 PBMCs. agregar 20 μl de microesferas de CD14 por 107 PBMCs. Mix bien e incubar por 15 min a 4 ° C en agitación constante.
- Añadir 1 mL de buffer por 107 PBMCs que clasifica como un paso de lavado y centrifugar 10 min a 300 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de buffer por 108 PBMCs de clasificación.
- Colocar una columna en el campo magnético del separador. Preparar la columna de lavado con 3 mL de buffer de ordenación.
- Aplicar la suspensión de células en la columna. La columna depende del número de células para ser aislados (aquí, se utilizan columnas de LS de PBMCs de9 hasta 10). Recoger a través de flujo que contiene células sin etiqueta.
Nota: A partir de este paso, todos los tubos (selecciones negativas y positivas) se mantienen para posterior comprobación de los diferentes pasos por citometría de flujo. - Lavar la columna con 3 x 3 mL de buffer de ordenación. Recoger las células pasando a través del mismo tubo de paso 3.12. Realizar pasos de lavado agregando buffer clasificación, tenga cuidado de no secar la columna. Colocar un tubo de colección en la columna y retire del separador.
- Pipetear 5 mL de buffer de clasificación en la columna. Limpie inmediatamente las células magnéticamente etiquetado empujar firmemente el émbolo en la columna. Para aumentar la pureza de la CD14+ las células, la fracción eluída se ha enriquecido en una segunda columna.
- Repita los pasos 3.4 a 3.7 con una nueva columna.
4. galjanoplastia de monocitos
- Contar los monocitos en una cámara Malassez. Compruebe la pureza de la CD14+ de las células mediante citometría de flujo. Retirar la cantidad de monocitos es necesarios para el experimento y colocar en un tubo de centrifugación.
- Centrifugar 10 min a 300 x g. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de monocitos en medio de los macrófagos. Las células de la placa y dejarlas asentarse por 50 min a 1 h. Aspire el medio y sustituirlo con medio macrófagos + 10% SAB + 25 ng/mL macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) para inducir la diferenciación.
5. polarización de los macrófagos en el día 6
- Aspire el medio. Sustituirla por medio de macrófagos + 10% SAB con varios estímulos. Por ejemplo, agregar 10 ng/mL interferón gamma (INFγ) + 1 lipopolysaccharide ng/mL (LPS) para obtener polarización M1, o 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleucina 13 (IL13) polarización M2.
Nota: La estimulación se puede realizar entre 24 y 48 h antes de proceder a otras pruebas. - Cosecha de células con una solución de desprendimiento o un raspador celular.
6. célula cultura en condiciones de poco oxígeno
- A partir de paso 4, mantener los monocitos y macrófagos en un entorno controlado de oxígeno para realizar el análisis de la condición hipóxica. Utilizar una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células debajo de la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento.
Nota: Cuando se trabaja bajo la presión de oxígeno baja, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado bajo la estación y esperar lo suficiente para obtener la correcta presión parcial en el líquido. Por ejemplo, 10 mL de PBS en una caja Petri de 60 mm requiere aproximadamente 2 horas para llegar a 25 mmHg para la presión de O2 parciales a partir de la presión atmosférica (como hemos medido con un sensor de oxígeno óptico de fibra). En muchas estaciones hipóxicas o incubadoras, la presión del oxígeno se establece como un porcentaje de la presión atmosférica. Si las medidas exactas son necesarias, es mejor utilizar una estación que autoriza establecer directamente la presión de oxígeno en mmHg.
7. lisis y digestión en Gel (protocolo 1)
Nota: En esta y las siguientes secciones, se describen dos protocolos utilizados para obtener péptidos y realizar el análisis por LC-MS/MS. Protocolo 1 describe lisis celular y fraccionamiento en gel y digestión, y en el protocolo 2 describe lisis celular en solución seguido por digestión en solución y fraccionamiento utilizando un método de enfoque isoeléctrico.
- Realizar la lisis celular en Tampón Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS, 37% de glicerol, 33.3% (v/v) β-mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,2% p/v]. El equivalente de proteína de 300.000 células para cada muestra en geles de acrilamida bis-Tris 4-12% de la carga.
- Controlar la duración de la migración electroforética a cada muestra de proteínas se divida en gel 6 bandas como se ejemplifica en la figura 3.
- Fije el gel con una solución fijadora (30% de etanol + ácido acético al 7.5% por 20 min), luego la solución de tinción (R-250 Coomassie blue por 45 min). La solución de extracción (etanol 30% + 7,5% acético hasta que aparecen bandas) antes de suprimir las bandas de proteínas con un bisturí limpio.
- Trocear cada banda suprimida antes de la introducción de 500 tubos μl. Una superficie de vidrio limpio es garantía para evitar la contaminación con las queratinas (solución de SDS 5% en agua desionizada se puede utilizar para limpiar las superficies).
- Lavar las rodajas de gel 3 veces en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio por 20 min a 37 ° C, seguido de un lavado en 25 mM bicarbonato de amonio y acetonitrilo (50% v/v). Deshidratar los pedazos de gel con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.
- Incubar cada pieza de gel con 10 mM DTT (Ditiotreitol) de bicarbonato de amonio 25 mM por 45 min a 56 ° C (200 μL), seguida de Yodoacetamida 55 mM en 25 mM bicarbonato de amonio (200 μL) durante 35 min en la oscuridad a TA.
- Dejar de alquilación, incubar cada pieza de gel con 200 μL de 10 mM TDT de bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 minutos a RT. Wash las piezas gel en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio, luego deshidratar con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.
- Digerir las proteínas durante la noche a 37 ° C con mezcla de tripsina/Lys-C según las instrucciones del fabricante.
- Extracto de los péptidos resultantes de pedazos de gel mediante la adición de 50 μL de 50% acetonitrilo para 15 minutos, luego 50 μL de ácido fórmico al 5% durante 15 min y finalmente, 50 μL del 100% de acetonitrilo para piscina a 15 minutos y secar cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y pérdida de muestra. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su análisis posterior.
8. proteína extracción y digestión en solución (protocolo 2)
- Con 150 μL del tampón de lisis siguiente de realizar la lisis celular (2 x 106 células):
- Urea de 7 M, tiourea de 2 M, 40 mM Tris y grietas del 4%, suplidas con los inhibidores de proteasa (mini completa, libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel).
- Homogeneizar las soluciones por 30 min a temperatura ambiente con un termoagitador. Centrifugue a 13.800 x g por 20 min RT y conservar el sobrenadante.
- Eliminar contaminantes con un kit de limpieza 2D:
- El kit contiene solución precipitante, solución precipitado Co, tampón de lavado y lavado aditivo.
- Añadir 300 μL de solución precipitante y mezclar bien. Incubar en hielo por 15 minutos añadir 300 μL de solución de co precipitado. Centrifugar los tubos (al menos) a 12.000 x g durante 5 minutos. Una pequeña pelotilla debe ser visible. Proceder rápidamente al siguiente paso para evitar resuspensión o dispersión de la pelotilla. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Centrifugar los tubos otra vez con la bisagra de la tapa y pellets hacia fuera para traer el líquido sobrante en la parte inferior del tubo. Un pulso breve es suficiente. No debería haber queda líquido visible en los tubos.
- Sin perturbar el pellet, agregar 40 μl de solución de co precipitado. Dejar que el tubo se sientan en hielo por 5 min, centrifugar durante 5 minutos, luego retire y deseche el lavado. Añada 25 μl de agua desionizada. Vortex cada tubo para s 5-10. El diábolo debe dispersar pero se disuelve en el agua.
- Añadir 1 mL de tampón de lavado (previamente enfriado durante al menos 1 h a-20 ° C) y 5 μl de aditivo de lavado. Vortex hasta que el pellet se dispersa completamente. Incubar los tubos a-20 ° C durante al menos 30 min vórtex por 20-30 s cada 10 minutos
Nota: Los tubos pueden almacenarse a-20 ° C hasta 1 semana con degradación proteica mínima o modificación. - Centrifugar los tubos (al menos) en 12.000 × g por 5 min con cuidado retire y descarte el sobrenadante. Una pelotilla blanca debe ser visible. Permiten la pelotilla a seca al aire durante no más de 5 minutos (si es demasiado seco, va a ser difícil que vuelva a suspender los pellets).
- Resuspender el precipitado de proteína en 300 μL 8 M urea y 0.1 M de bicarbonato de amonio. Vortex fuertemente durante 1 minuto determinar la concentración de proteína usando un análisis colorimétrico.
9. en la solución digestión (protocolo 2)
- Reducir los puentes disulfuro añadiendo 5.1 μl de una solución acuosa de 700 mM TDT (concentración final 12.5 mM) a las proteínas resuspendidas de paso 8.4 e incubar a 37 ° C por 30 min con un termoagitador. Alquilato residuos de cisteína mediante la adición de 20,3 μl de una solución acuosa de 700 mM Yodoacetamida (concentración final 40 mM) y se incuba a 25° C por 30 min en la oscuridad con un termoagitador.
- Añadir 990 μl de bicarbonato de amonio de 0.1 M a la muestra. Añadir un volumen correspondiente de tripsina/Lys-C mix (enzima: sustrato proporción 1: 100 w/w). Incubar a 37° C durante la noche con un termoagitador.
10. limpiar el cartucho (protocolo 2)
- Moje un cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de metanol. Limpie el cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de agua al 80% acetonitrilo HPLC-grado y descartar el flujo a través. Equilibre el cartucho con 4 columnas-volúmenes (4 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado y descartar el flujo a través.
- Acidificar las muestras con 90 μl de ácido fórmico al 10% o agua a pH 2-3 (Compruebe el pH con un indicador de pH). Cargar las muestras acidificadas y recoger el flujo a través. Vuelva a cargar el paso (contiene los péptidos no conservado). Lavar el cartucho con columna-volumen 6 (6 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado.
- Eluir péptidos del cartucho con volúmenes de columna 1 (1 mL) de agua de acetonitrilo HPLC-grado de acid/50% fórmico 0,1%. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Concentrar la muestra utilizando un concentrador de vacío (150 x g, vacío a 160 mBar).
11. fraccionamiento de la concentración isoeléctrica (protocolo 2)
Nota: Los péptidos son separados según sus puntos isoeléctricos usando un fraccionador de gel en una tira de 13 cm cubriendo un rango de pH de 3 a 10. Se utilizó el siguiente protocolo suministrado por el proveedor (resumido a continuación):
- Preparar las siguientes soluciones: solución (600 μl de solución de glicerol, 60 μL de tampón de OFFGEL, 4,34 mL de agua ultrapura) y B (1,776 mL de solución) y 444 μl de agua ultrapura.
- Armar las tiras IPG, marcos y electrodos según las instrucciones del fabricante.
- Resuspender la muestra con 1,8 mL de solución B. agregar 40 μl de la solución B a cada pocillo. Carga 150 μL de muestra a cada pocillo.
- Seleccionar el método por defecto para péptidos: OG12PE00 (método OFFGEL predeterminado para péptidos para uso con 3100 OFFGEL baja Res Kit marcos de pH 3-10, 12-bien. Espere a que este método ha sido completado (20 h). Recoger las fracciones en tubos debidamente etiquetados.
12. limpiar Harvard aparato columna C18 reversa Post-IEF (protocolo 2)
- Añadir progresivamente unos μL en un tiempo de 1% TFA en agua desionizada a cada fracción para acidificar la muestra. Verifique con papel pH el pH es de 3 o menos.
- Preparar las siguientes soluciones: solución 1 (5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 4,99 mL de agua ultrapura) y 2 (0, 5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 9,49 mL de agua ultrapura).
- Humedezca previamente la columna spin con 150 μL de solución 1. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar la columna de vuelta con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.
- Pasar la fracción a través de la columna. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.
- Eluir la fracción con 50 μL de solución 1. Centrífuga de 90 s a 750 x g. Repita estos pasos una vez más.
- Seco-fracción utilizando un concentrador de vacío (150 g de x, vacío 160 mBar) y almacenar a-80 ° C
13. Análisis de datos de proteómica y bioinformática18
- Analizar los datos obtenidos por un nano-LC MS/MS masa espectrómetro usando software de cuantificación como MaxQuant (versión 1.5.2.8) y el motor de búsqueda de Andrómeda.
- Establece tarifa falsa del descubrimiento (FDR) al 1% para proteínas y péptidos y un largo mínimo de 7 aminoácidos. Establecer la especificidad de la enzima como C-terminal Arg y Lys. Permite 2 divisiones perdidas en bonos de prolina. Seleccione carbamidomethylation de la cisteína como modificación fija y oxidación de la acetilación y la metionina de la proteína N-terminal como modificaciones variables.
- Analizar los datos con el software de análisis estadístico. Realizar un análisis de enriquecimiento funcional usando el software FunRich (www.funrich.org/). Realizar un análisis de enriquecimiento ontología génica utilizando el software de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).
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Representative Results
A partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por centrifugación diferencial, el protocolo permite la obtención de una población de CD14+ monocitos con una pureza cuota de más del 98% mediante citometría de flujo (figura 1). Estos monocitos se diferencian secundariamente hacia polarizaciones diferentes (figura 2). Cuando se elige un fraccionamiento en gel, la migración en geles de SDS-page se adapta para obtener el número de bandas deseadas y las bandas son suprimidas (figura 3). Secundario se realiza la digestión en las bandas suprimidas del gel, y luego se extraen los péptidos. Los péptidos son analizados mediante una nano-LC (cromatografía líquida)-MS/MS en espectrómetro de masa. Espectros de MS/MS darán la identidad de diversas proteínas según la anotación de los espectros obtenidos para péptidos conocidos (Figura 4A). La cuantificación de la abundancia de una proteína se calcula entonces con respecto a la cantidad de péptidos identificados procedentes de la proteína usando software publicado y bases de datos de15,16. Este protocolo con gel-digestión da aproximadamente 4000 proteínas identificadas, y el rango dinámico se ha encontrado para cubrir 5 unidades de la escala logarítmica (Figura 4B). Análisis de la expresión diferencial de estas proteínas identificadas pueden utilizarse para determinar el agrupamiento de diferentes polarizaciones en ambientes de oxígeno diferente.
Con este método, también podemos reconocer grupos de proteínas que son para arriba-regulados cuando se expone a una concentración de oxígeno baja de 3% (figura 5, tabla 1). Para evaluar la eficiencia de la digestión, que no es posible cuando se utiliza un protocolo en gel, hemos propuesto un método de digestión en solución que se ha adaptado a los macrófagos humanos (figura 6A). Con este método, podemos obtener fácilmente (después de la solución en digestión) identificación de 3600 proteínas sin fraccionamiento, lo que significa ese fraccionamiento con voluntad IEF con sensatez aumentar este número (Figura 6B).
Figura 1: flujo cytometry análisis de expresión de CD14 de PBMC antes de la clasificación (panel izquierdo) y después de su clasificación (panel derecho) Mostrar la pureza obtenida después de la selección de granos magnéticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados que muestra la heterogeneidad de las morfologías obtenidas para dos polarizaciones diferentes. Representa la barra de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: proyección de imagen de Coomassie azul manchado gel mostrando las bandas que serán suprimidas [aquí, 6 bandas en macrófagos M(Ø)] para 5 polarizaciones de macrófagos expuestos a un ambiente de poco oxígeno. IC = complejos inmunes, DXM = dexametasona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: espectro MS/MS y cuantificación. (A) un ejemplo de un espectro MS/MS. Se muestra aquí es el espectro de CID (disociación colisión-inducida) de un péptido encontrado en m/z 597.29 en el espectro de MS con una carga eléctrica de + 2. Se determinó la secuencia correspondiente de este espectro como Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg de la proteína CD58. (B) rango ordenado libre de etiqueta de cuantificación para cada una de las proteínas identificadas (sesión10 LFQ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: mapa que representa la agrupación jerárquica de toda polarización Estados usando diferencialmente expresado proteínas. El análisis revela un conjunto de proteínas que se sobreexpresa en polarizaciones todos en 3% O la condición2 (rectángulo rojo). La escala de color representa puntuaciones z (intensidad de log2). Cada fila es una proteína y cada columna es una muestra. Esta cifra que se originó de una anterior publicación14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: SDS-PAGE y cromatograma. (A) plata-manchados geles de SDS-PAGE con proteína de lisis celular y después de la digestión de la solución en que la ausencia de degradación durante la lisis y la eficiencia de la digestión. (B) cromatograma obtenido después de la solución en digestión sin fraccionamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cluster | proteinID | Nombres de proteína | Nombres de gene | Péptidos | Maquinilla de afeitar + péptidos únicos | Péptidos únicos | Identificación de proteínas | ||
| Rojo | P0DMV9 | Shock de calor 70 kDa proteína 1B | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1 | ||
| Rojo | P54709 | Sodio/potasio-transporte ATPasa subunidad beta-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18 | ||
| Rojo | O00462 | Beta-mannosidase | MANBA | 14 | 13 | 13 | O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5 | ||
| Rojo | Q8NAS7 | Proteína de hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 7, mitocondrial | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38 | ||
| Rojo | Q8WWQ0 | Proteína de interacción con PH | PHIP | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0; Q9NWP3 | ||
| Rojo | E5RHK8 | Dinamina-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2 | ||
| Rojo | A0A024QZ64 | Fructosa bifosfato aldolasa C | ALDOC | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6 | ||
| Rojo | O75489 | Proteína de hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 3, mitocondrial | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194 | ||
| Rojo | P21912 | Subunidad de sulfuro de hierro Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] mitocondrial | SDHB | 11 | 11 | 11 | P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1 | ||
| Rojo | A0A024R1Y7 | Proteína que contiene el dominio GH3 | LGP1; GHDC | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54 | ||
| Rojo | E5KRK5 | NADH-ubiquinona oxidorreductasa 75 kDa la subunidad, mitocondrial | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5 | ||
| Rojo | A0A024QZ30 | Subunidad de flavoproteína Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] mitocondrial | SDHA | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5 | ||
| Rojo | A0A024R2F9 | Proteína transmembrana 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05 | ||
| Rojo | A0A024R5K3 | Proteína de hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 8, mitocondrial | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17 | ||
| Rojo | O76003 | Reductasas-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| Rojo | Q1HBJ4 | Quinasa activada por mitógenos; Kinase de proteína mitogen-activados 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659 | ||
| Rojo | Q13151 | Ribonucleoproteína nuclear heterogéneo A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| Rojo | V9HWN7 | Fructosa bifosfato aldolasa A | ALDOA | 36 | 36 | 14 | V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0 | ||
| Rojo | B4DVJ0 | Glucosa-6-fosfato isomerasa | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85 | ||
| Rojo | V9HWB9 | L-lactato deshidrogenasa; Una cadena de L-lactato deshidrogenasa | LDHA | 36 | 36 | 34 | V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3 | ||
| Rojo | P13674 | Prolil 4-hidroxilasa la subunidad alfa-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674; Q5VSQ6 | ||
| Rojo | Q6FHV6 | Gamma-enolasa; Enolasa | ENO2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4 | ||
| Rojo | Q99798 | Aconitate hydratase, mitocondrial | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944 | ||
| Rojo | P17858 | Dependiente de ATP 6-Fosfofructoquinasa Tipo hepático | PFKL | 32 | 29 | 28 | P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4 | ||
| Rojo | A0A024R872 | Niban-como la proteína 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6 | ||
| Rojo | A0A024RC61 | Aminopeptidasa N | ANPEP | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7 | ||
| Rojo | V9HWF4 | Fosfoglicerato quinasa; Fosfoglicerato quinasa 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444 | ||
| Rojo | Q12882 | Deshidrogenasa de Dihydropyrimidine [NADP(+)] | INCLUYE | 44 | 44 | 44 | Q12882; B4DML1 | ||
| Rojo | B4DEQ0 | Electron transfer flavoproteína-óxidorreductasa de la ubiquinona, mitocondrial | ETFDH | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5 | ||
| Rojo | D9UAX9 | Antígeno MHC de clase I | HLA-B | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| Rojo | V9HWK1 | Trioso isomerasa | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5 | ||
| Rojo | Q96HE7 | Alfa ERO1-como la proteína | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8 | ||
| Rojo | P14868 | Aspartato - Arnt Ligasa, citoplásmico | DARS | 29 | 29 | 2 | P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278 | ||
| Rojo | P36871 | Fosfoglucomutasa-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871; B4DFP1; Q9H1D2 | ||
Tabla 1: Lista de proteínas sobreexpresadas por macrófagos humanos comunes a cada polarización bajo tensión de oxígeno baja.
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Discussion
Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)17, digestión en solución18 y asistido por el filtro muestra preparación19. Este último método, al principio que se describe como universal, se ha divulgado para exhibir baja reproducibilidad y la posible pérdida de proteínas sobre el filtro20. Digestión en gel es un método robusto que puede ser desperdiciador de tiempo y desventajosa en que evaluación de la eficiencia de la digestión no es fácil, si es posible. Digestión en solución ofrece esta posibilidad, pero requiere la limpieza de las muestras después de la digestión y el IEF. Comparados estos dos métodos entre la misma muestra en solución digestión con protocolo de fraccionamiento IEF rinde un mayor número de proteínas identificadas (con el mismo número de fracciones) de digestión21en gel.
A pesar de esta ventaja, es necesario considerar la degradación de proteína posible en solución en lisis por proteasas intracelulares (especialmente en las células mieloides). También es importante tener en cuenta que estas técnicas se basan en la digestión de proteínas y sólo capaz de analizar las proteínas que presenta tripsina sitios específicos escote. Es posible utilizar un enfoque proteómico de arriba hacia abajo que alivia esta restricción de digestión pero agrega pasos de análisis de datos y bioinformática recursos22. La solubilización de proteínas de diferentes compartimentos celulares también puede ser difícil de obtener, especialmente de las membranas del plasma, conduciendo a un muestreo incontrolado de proteoma celular. Para proceder a un análisis de espectrómetro de masas de nano-LC-MS/MS de las muestras, es importante obtener una cantidad suficiente de péptidos, que puede confiar en el espectrómetro de masas utilizado (generalmente, a partir de proteína total debe ser al menos 1 μg para una condición, y se supone para aumentar esta cantidad según el número de fracción que se usa con IEF). Esta restricción puede ser un inconveniente si la población de la célula en estudio es escasa, que distingue proteómicos de técnicas genómicas en las que es posible amplificación de materia prima.
Incluso después de las obras seminales de Richer y colegas23 y Packer y Fuehr24, la importancia del oxígeno en los cultivos celulares ha sido insuficientemente reconocida. Ahora sabemos que cultivo las células con bajas concentraciones de oxígeno favorece la adherencia, duración y división. Se reconoce que esto es de suma importancia en la célula de vástago investigación25. El principal problema técnico para cultivos celulares bajo condiciones controladas de oxígeno está relacionado con el mantenimiento de la concentración de oxígeno deseado durante todo el experimento. Esto requiere la incubación de todos los medios evitar la liberación de oxígeno disuelto y uso de hipóxico-estaciones de trabajo para permitir la manipulación de células con poco oxígeno (proceso de cámara con guantera) y evitar la exposición transitoria a condiciones de altas concentraciones de oxígeno .
El protocolo descrito se utilizó para obtener las firmas moleculares de diferentes polarizaciones de los macrófagos derivados de monocitos humanos y estudiar los efectos de modulación de oxígeno en estas firmas. Este estudio ha dado información sobre la descripción de las polarizaciones y ha revelado algunas consecuencias funcionales. Por ejemplo, encontramos que muchas proteínas implicadas en efferocytosis fueron moduladas por un ambiente de poco oxígeno. Este enfoque proteómico, basado en el protocolo descrito, presenta la oportunidad de explorar cómo parámetros ambientales modificar funciones de macrófagos y cómo estas señales se pueden utilizar para diseñar nuevos enfoques terapéuticos14.
El enfoque de la proteómica se describe en este trabajo es complementario a enfoques genómicos que han utilizado durante los últimos años en el campo de los estudios de polarización macrófago humano. Proteómica ofrece la ventaja de cuantificación de la proteína, que puede presentar una expresión diferente de los mRNAs correspondientes debido a las modificaciones poste-de translación y llevar al descubrimiento de nuevos biomarcadores. A pesar de esta ventaja, los datos proteómicos están generalmente difíciles de interpretar, en parte debido a la alta sensibilidad de la espectrometría de masas, llevando a espectros muy complejos de MS y detecciones positivas falsas de péptidos. Software de análisis ha ganado recientemente, eficacia para prevenir esto. Aunque es una situación cambiante, proteómica también enfrenta la baja reproducibilidad de genómica26 y se asocia con los pasos de validación mediante otras técnicas (citometría de flujo, immunoblotting) para confirmar la modificación cuantitativa de la proteína niveles de expresión.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
AM es financiado por el programa de líder del grupo de jóvenes (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le cáncer y la Fundación arco pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo de la espectrometría de masas para plataforma de Biología (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, París). Agradecemos a Lauren Anderson por su lectura del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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