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Chemistry

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58744
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.

Abstract

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento de motivos de DNA circular e construção de nanoestruturas de DNA 1D e 2D. Ao longo de décadas, o rápido desenvolvimento da nanotecnologia de ADN é atribuído à utilização de DNAs lineares como as matérias-primas. Por exemplo, a telha DAO (dupla crossover, antiparalelas, estranhos meia-voltas) é conhecida como um bloco de construção para construção de grades de DNA 2D; a estrutura do núcleo do DAO é feita de dois oligonucleotides linear single-stranded (ss), como duas cordas fazendo um nó de vovó de mão direita. Neste documento, um novo tipo de telhas de DNA chamado cDAO (DAO acoplado) são construídos usando um pequeno ss-DNA circular de c64nt ou c84nt (circulares 64 ou 84 nucleotídeos) como a vertente de andaime e vários ss-DNAs lineares como as fibras descontínuas. Perfeito nanoestruturas 1D e 2D são montadas de telhas cDAO: nanofios infinitos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons; e nano-retângulos finitos. Protocolos detalhados são descritos: 1) preparação por T4 ligase e purificação por desnaturação página (eletroforese em gel de poliacrilamida) dos oligonucleotides circulares pequenas, 2) recozimento de telhas circulares estáveis, seguido de análise de página nativa, 3) montagem de nanofios de 1D infinita, nanorings, nanospirals, grades 2D infinitas de nanotubos e nanoribbons e finitos 2D nano-retângulos, seguido por imagens de AFM (microscopia de força atômica). O método é simples, robusto e acessível para a maioria dos laboratórios.

Introduction

Moléculas de DNA têm sido utilizadas para construir muitos tipos de nanoestruturas durante décadas. Os motivos típicos incluem DAE (cruzamento duplo, antiparalelas, nem meia-voltas) e DAO telhas1,2,3, telhas Estrela4,5,6,7, único encalhado (ss) telhas8,9,10e o ADN origami11,12,13. Estes motivos de DNA e grades são montados de ss-DNAs lineares. Recentemente, nós e os outros relataram o uso de ss-oligonucleotides circulares como andaimes para construir motivos, nanotubos de 1D e 2D grades14,15,16,17. Inserindo um Holliday junção (HJ)18,19,20,21 no centro de c64nt, um par de duas peças DAO acoplados pode ser formado17. Este motivo cDAO novo e seus derivados são estáveis e suficientemente rígidas para montar 2D DNA chafarizes até 3 × 5 µm2. Neste trabalho, usamos um termo de "telha circular", que é definido como uma molécula estável de ADN complexa construída com um andaime circular e outros grampos lineares de ss-oligonucleotides, e outro termo de "telha linear", que é construído a partir de um conjunto completo de linear SS-oligonucleotides.

Este protocolo demonstra como construir cinco tipos de nanoestruturas de DNA com pequenas moléculas de DNA circulares como andaimes: 1) infinitos nanofios de c64nt e c84nt 1D, 2D 2) infinito cDAO-c64nt-O e cDAO-c64nt-E (-O representa um número ímpar de 5 meias-voltas e -E representa um número par de 4 meias-voltas) grades, 3) infinitas 2D cDAO-c84nt-O e cDAO-c84nt-E grades, 4) finitos 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O retângulos, 5) infinita 1 D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals (consulte Figura 3-5 para os desenhos esquemáticos e as imagens dos cinco tipos acima de nanoestruturas de DNA). As 1D c64nt e c84nt os nanofios são montados de cada andaime c64nt e c84nt associado com dois grampos lineares, respectivamente. Cada telha circular de cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt ou c84nt-cDAO é recozida de seu andaime correspondente de c64nt, c74nt ou c84nt com quatro grampos lineares, respectivamente. Os infinitos grades 2D são montados do mesmo tipo de duas peças circulares com diferentes sequências. Os dois se entrecruzam finitos 2D retângulo é montados de dois conjuntos de 32 peças sub circulares respectivamente. Para economizar dinheiro, c84nt, c74nt e c64nt apenas um-sequenciado é usado como o andaime respectivo enquanto saliências diferentes são usadas para recoze a 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt e 20 cDAO-c84nt circular sub telhas respectivamente na primeira etapa recozimento sub telha, então Misture as correspondentes 32 telhas de sub circulares e aplicar o retículo segundo recozimento passo para montar o finito 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O que se entrecruzam, respectivamente. Definitivamente, diferente-sequenciado andaimes circulares podem ser adoptadas para montar uma variedade de nanoestruturas de tamanho finito, porém vai custar mais dinheiro e trabalhos. O infinito 1D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals são recozidos das telhas um-sequenciado assimétrica acDAO-c64nt com conexões lineares de um número par de 4 meias-voltas. Há duas abordagens para montar grades 2D infinitas das telhas circulares de cDAO-c64nt e cDAO-c84nt, que são distinguidas pelas distâncias intertile de um mesmo número de 4 e um número ímpar de 5 meias-voltas, respectivamente. O primeiro exige todas as telhas a serem alinhados de forma idêntica; Este último requer alternância dos rostos de duas peças vizinhas ao longo dos eixos helicoidais. Se a telha é rígida e planar, como cDAO-c64nt, ambas as abordagens irão gerar nanoribbons planar; se a telha é curvada em direção uma direção, como cDAO-c84nt, o intertile conexão de um número par de 4 voltas metade irão gerar nanotubos, Considerando que a conexão intertile de um número ímpar de 5 voltas metade produzirá nanoribbons planar devido à eliminação de crescimento de curvatura-tendencioso por alinhamento alternativo de telhas curvas. A bem sucedida montagem de 1D e 2D nanoestruturas de DNA das telhas circulares indica várias vantagens desta nova abordagem: aplicada a estabilidade e rigidez de telhas circulares sobre lineares telhas, telhas quirais para a montagem de nanoestruturas assimétricas tais como nanorings e nanoribbons, novas visões na compreensão da mecânica do DNA e estruturas moleculares, etc.

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Protocol

1. preparação de DNAs circulares

  1. Use todos os DNAs lineares fornecidos por empresas comerciais diretamente sem mais purificação.
  2. Centrifugar as amostras de DNA em 5.000 × g por 5 min coletar todos os chumbos de DNA na parte inferior dos tubos. Adicione um volume adequado de tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) para dissolver o DNA.
  3. Medir a concentração de "a" ng / µ l de cada solução de ss-DNA usando um micro espectrômetro UV a 260 nm. Converter "uma" ng / µ l a "b" µM após b =3 × 10 / (vertente de peso molecular do DNA). Ajuste a quantidade de solução de TE tornar uma solução-mãe de DNA 10 µM.
  4. Use o T4 DNA ligase para conectar as extremidades 3' e 5' de 5'-fosforilada linear DNA modelos ( Figura 1) de c64nt, c74nt e c84nt fornecidos diretamente de empresas comerciais.
  5. Misture strand DNA linear 5'-fosforilada (3,5 µM) e seu correspondente tala uma cadeia de DNA (4,5 µM) em tampão de TE 80 µ l em um de tubo de ensaio PCR de 200 µ l15. Incube o tubo em uma garrafa de thermo aberto cheio de água de 95 ° C. Arrefecer a água quente à temperatura ambiente (25 ° C) por cerca de 2-3 horas sob a atmosfera do laboratório.
  6. Adicionar 10 µ l de buffer de x T4 10 (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, ATP de 1 mM) e 10 µ l de T4 ligase (300 U / µ l) para a mistura para um volume final de 100 µ l. Incubar a mistura em um thermocycler 16 horas a 16 ° C.
    Nota: O acima as concentrações de DNA e volume de reação de ~ 100 µ l são otimizados para a eficiência elevada da ligadura e o alto rendimento de ciclização oligo-monômero correto. Execute dois ou mais tubos de reações da ligadura, ao mesmo tempo, de acordo com o projeto experimental. Um procedimento alternativo de incubação para etapa de substituição de ligadura 1.6 é 4 horas a 25 ° C.
  7. Após a incubação, inativar o T4 ligase em água de 95 ° C por 5 minminutes. Em seguida, transferir o tubo para um banho de água gelada e incubar durante 5 minutos para esfriar.
  8. Adicionar 10 µ l de 10 x Exonuclease eu do buffer e 10 µ l de Exonuclease eu (5 U / µ l) para a mistura temperada e incubar o tubo a 37 ° C em banho-maria por 30 min para seletivamente digerir os DNAs lineares restantes e deixar os DNAs circular intacta.
  9. Prepare um 10% gel PAGE de desnaturação.
    1. Use óculos e luvas de borracha ao preparar o gel de página na coifa. Adicionar 6,67 mL de solução de acrilamida/bisacrylamide de 30% (p/v) (19:1), 2 mL de 10 x TAE· Buffer de mg (40 mM Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g de ureia (7m) e água desionizada até um volume final de 20 mL em um tubo de centrífuga de 40 mL.
      Atenção: A solução de solução de acrilamida/bisacrylamide (19:1) 30% (p/v) é tóxica.
    2. Adicionar 20 µ l de tempted (TEMED) e 100 µ l de persulfato de amónio (APS, 10% p/v) para os 40 mL do tubo antes da transferência da solução de gel para a eletroforese imediatamente. Inserir um 1,5 mm de espessura e pente 10-bem. Espere pelo menos 20 min até a solução de gel é solidificada.
    3. Definir uma constante tensão de 80 V para um gel de 85 × 80 × 1,5 mm3 (largura × altura × espessura). Adicionar 1 x TAE· Buffer de mg para o sistema de eletroforese e prerun o gel por 20 min a 10 V/cm.
  10. Colocar o tubo de ensaio PCR do passo 1.8 de 95 ° C de água por 5 min inactivar Exonuclease eu. Em seguida, transferir o tubo para um banho de água gelada e incubar durante mais 5 minutos.
  11. Adicionar 20 µ l de formamida no tubo até um volume final de 140 µ l e misturar a solução. A solução para desnaturação 7-9 página gel de poços, igualmente com 16-20 µ l de cada gel para distribuir bem. Misture 2 µ l de tintura (bromofenol 0,05%, 0,05% de xileno cianol FF, 60% de glicerol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) com 8 µ l do DNA linear correspondente precursor de carregamento (10 µM) e injetar a mistura para um poço separado para referência.
    Nota: A adição de formamida é aumentar a densidade da solução de carregamento para afundar até o fundo do gel página bem e também desassociar um duplo preso resíduos de DNA.
  12. Funcione o gel para cerca de 2 h a 10 V/cm e parar de correr quando o xileno cianol FF está na posição 2/3 da placa de vidro com a olho nu.
  13. Use luvas de borracha e óculos de proteção para proteger a pele e olhos. Pegue o gel fora a placa de vidro. Coloque o gel em uma placa de TLC (cromatografia em camada fina) fluorescente. Cortar as bandas de gel de destino por uma lâmina de barbear como exatamente como sombreado por irradiação UV (Figura 2).
    Atenção: A luz UV é prejudicial aos olhos e peles.
    Nota: Sob irradiação UV para 254 nm, DNA irá absorver a luz e uma sombra sobre a placa de TLC. O DNA circular correu ligeiramente mais lento do que o seu DNA linear de precursor correspondente. Alguns DNAs lineares não digeridos e indesejados DNAs circulares em pequenas quantidades que cercam a banda alvo sombreado poluirá o DNA circular, se eles são coletados.
  14. Transferi as gel de bandas em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL. Ar seco ou sopro secar as gel de bandas e depois amasse o gel em uma pasta por uma espátula ou uma vareta de vidro plana. Certifique-se que o gel tem sido completamente esmagado em uma pasta, que é fundamental para o alto rendimento de DNA circular. Adicione duas vezes da gel de água desionizada para o tubo e agitar o tubo à temperatura ambiente durante a noite.
  15. Filtre a mistura para coletar os sobrenadantes em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL. Recupere qualquer DNA residual enxaguando com pequeno volume de água desionizada e filtro novamente para combinar os sobrenadantes.
  16. Extraia o eluente com igual volume de n-butanol. Repita este procedimento até que o volume aquoso é reduzido para cerca de 200 µ l.
  17. Adicionar 500 µ l de etanol absoluto (−20 ° C) e 20 µ l de NaOAc de 3 M (pH 5.1) para a mistura para precipitação do DNA. Armazene o tubo −20 ° C por 30 min.
  18. Centrifugar o tubo a 12.000 × g por 10 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante. O precipitado de DNA restante é cerca de 100 µ l do tubo.
  19. Adicione 600 µ l de etanol a 75% (−20 ° C) ao tubo e armazená-lo no −20 ° C por 30 min. Em seguida centrifugar a 12.000 × g por 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante. O precipitado de DNA restante é solução de cerca de 100 µ l do tubo de novo. Repita o procedimento duas vezes.
  20. Após a última centrifugação, desprezar o sobrenadante, tanto quanto possível. Seque os restos com um concentrador a vácuo.
  21. Armazenar o DNA circular purificado no tubo de −20 ° C.
  22. Ressuspender o DNA circular no buffer de TE tornar um 10 µM circular DNA solução-mãe de acordo com a etapa 1.3 quando necessário.

2. recozimento de soluções de montagem

  1. Prepare cada telha ou nanoestrutural solução de montagem de c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt e acDAO-c64nt-E com um conjunto projetado de DNAs circulares e lineares para um pot-recozimento.
    1. Para cada solução de montagem, misture 2 µ l de 10 x TAE· Buffer de mg, 1 µ l de cada solução-mãe de DNA de um conjunto de cadeias lineares e circulares em iguais proporções molares e buffer TE adicionais em um tubo de ensaio PCR de 200 µ l para uma concentração final de cada fio em 0,5 µM e um volume final de 20 µ l. recozer a solução de montagem em um garrafa de Thermo de 95 ° C e 25 ° C mais de 48 h.
  2. Prepare-se para duas etapas de recozimento cada solução de montagem de grades infinitas 2D de cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E e cDAO-c84nt-O com um conjunto projetado de DNAs lineares e circulares.
    1. Prepare cada solução de montagem de sub telha precursor misturando 2 µ l de 10 x TAE· Buffer de mg, 1 µ l de cada solução-mãe de DNA de um conjunto de cadeias lineares e circulares em iguais proporções molares e buffer TE adicionais em um tubo de ensaio PCR de 200 µ l para uma concentração final de 0,5 µM para cada vertente e um volume final de 20 µ l. Na primeira etapa recozimento sub telha, recoze a cada solução de sub telha precursor em um thermocycler PCR usando um método de resfriamento rápido-linear de 95 ° C e 25 ° C mais 2,5 h.
    2. Prepare cada solução de montagem dos acima quatro grades infinitas misturando-se 10 µ l de cada uma das duas soluções correspondentes sub telha juntos para uma concentração final de 0,25 µM para cada vertente. Na estrutura de segunda etapa de recozimento, recoza a mistura de 20 µ l em um thermocycler PCR usando um método de resfriamento lento de ficar a 50 ° C por 2 h e refrigerar para baixo a uma taxa de 0,1 ° C por 5 minutos a 20 ° C, cerca de 24 horas no total.
      Nota: Dois experimentos paralelos podem ser executados simultaneamente ou posteriormente na segunda etapa recozimento para cada malha infinita 2D.
  3. Prepare soluções de montagem de dois conjuntos finitos retângulo de 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O por duas etapas de recozimento.
    1. Prepare cada solução de montagem de sub telha precursor misturando 1 µ l de 10 x TAE· Buffer de mg, 0,5 µ l de cada solução-mãe de DNA de um conjunto de cadeias lineares e circulares em iguais proporções molares e buffer TE adicionais em um tubo de ensaio PCR de 200 µ l para uma concentração final de 0,5 µM para cada vertente e um volume final de 10 µ l. Na primeira etapa recozimento, recoze a cada solução de sub telha precursor em um thermocycler PCR usando um método de resfriamento rápido-linear de 95 ° C e 25 ° C mais 2,5 h.
    2. Prepare cada solução de montagem de treliça retângulo finito misturando 32 x (2 µ l de cada solução de sub telha) juntos em um tubo de ensaio PCR de 200 µ l para uma concentração final de ~ 15 nM para cada sub telha e um volume final de 64 µ l. A segunda etapa de recozimento, recoza a mistura de 64 µ l em um thermocycler PCR usando um método de resfriamento lento de ficar a 50 ° C por 2 h e refrigerar para baixo a uma taxa de 0,1 ° C por 5 min a 20 ° C, cerca de 24 horas no total.
      Nota: Cinco experimentos paralelos podem ser executados simultaneamente ou posteriormente na segunda etapa recozimento para cada assembly retângulo finito.

3. nativo página análise

  1. Prepare-se 10% nativo página seguinte passo 1.9, exceto para o componente de ureia.
  2. Para amostras de controlo de c64bp e c84bp, adicione 2 µ l de cada solução de montagem e 1 µ l de carregamento tintura de 3 µ l de tampão TE como controles separadamente. Para cada um dos outros assemblies listados na Figura 3, adicione 1 µ l de cada solução de montagem e 1 µ l de carregamento de tinta a 4 µ l de tampão TE.
  3. Injete cada uma das soluções acima de um gel bem. Adicione 5 µ l de marcador de DNA (25-500 bp) para um bem separado por referência.
  4. Funcione o gel para cerca de 4 horas a 10 V/cm em um banho de água gelada. O xileno cianol FF vai ficar sem a placa de vidro.
  5. Use luvas de borracha e óculos de proteção para proteger a pele e olhos. Pegue o gel fora a placa de vidro e mergulhá-lo em 100 mL de água desionizada com 10 µ l de uma mancha de gel de ácido nucleico por 30 min.
    Atenção: A solução de mancha de gel de ácido nucleico é tóxica.
  6. Observar o gel sob um sistema de imagem de UV e tirar uma foto do gel manchado (Figura 3).

4. purificação de grades finitos

  1. Prepare um gel de agarose 2% nativo para a purificação de electroforese de grades finitos.
    1. Misturar 1 g de agarose em pó, 5 mL de 10 x TBE· Buffer de mg (89 mM Tris, 89 mM, ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µ l de ácido nucleico gel mancha e 47,5 mL de água deionizada em um frasco de triângulo de 250 mL. Ferva a mistura até que as bolhas se tornam pequenos e densos. Adicione água quente na garrafa para um volume total de 50 mL e uma concentração de agarose 2%.
    2. Use luvas grossas. Despeje a solução de gel em uma caixa de plástico gel de 7 x 10 x 1 cm3 (largura × comprimento × de espessura). Inserir um pente de gel grossas e 12-poços de 1,5 mm. Espere o gel arrefecer à temperatura ambiente. Se necessário, colocar o gel na geladeira a 4 ° C.
      Cuidado: Esteja ciente de queimaduras porque a solução é muito quente.
    3. Adicionar 0,5 x TBE· Buffer de mg no sistema de electroforese. Prerun o gel a 5 V/cm por 20 min em um banho de água gelada com uma tensão constante de 50 V.
    4. Injetar 20 µ l da solução de treliça finita preparou bem na etapa 2.3 em cada gel de agarose e adicionar 5 µ l de um marcador de DNA (3.000-100 bp) para um separado bem. Funcione o gel para h 2 a 5 V/cm em um banho de água gelada.
    5. Use luvas de borracha e óculos de proteção para proteger a pele e olhos. Corte o alvo gel bandas com uma posição semelhante para o marcador de 1.000 bp sob luz UV e fatia-las em peças de multa e coloque o gel esmagado em um filtro de coluna8.
    6. Centrifugue a coluna a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C. Extrair a solução da amostra através da coluna. Recolha a solução para a imagem latente de AFM.
  2. Purifica o finitos grades por precipitação de PEG.
    1. Mix 50 µ l de solução finita da estrutura preparada na etapa 2.3 com igual volume de 15% PEG8000 (w/v) de buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl)22. Centrifugue a solução a 18.000 × g a 4 ° C por 30 min.
    2. Remover o sobrenadante e adicionar 100 µ l de tampão de PEG. Repeti a centrifugação.
    3. Depois de retirar o sobrenadante, dissolva a pelota em 1 x TAE· Buffer de mg para a imagem latente de AFM.
      Nota: A purificação é necessária para o finito se entrecruzam de 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O para imagens de AFM e outras aplicações. Se o rendimento é muito baixo, aumente a velocidade de centrifugação. Se o produto não é puro o suficiente, repita a etapa 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. Para c64nt nanofio, nanofios de c84nt, acDAO-c64nt-E, grades 2D infinitos de cDAO-c64nt-E(O) e cDAO-c84nt-E(O), depositam 2 μL da amostra recozida sobre uma superfície de mica clivada recentemente. Deixe por 2 min para a adsorção de grades de DNA para a superfície de mica. Lavar a superfície com 100 µ l de água destilada duas vezes e seque-o por ar comprimido.
  2. Obter imagens AFM de grades de DNA infinitas no ar fazendo a varredura da superfície de mica com sondas AFM triangulares sob o modo de bater. Definir os seguintes parâmetros para digitalização: digitalização tamanho de 0,5 ~ 5 µm, resolução de 512 linhas de varredura e varredura taxa de 3,5 Hz (Figura 4).
  3. Para grades de DNA finitos de 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, depósito de 80 µ l de 1 x TAE· Buffer de mg sobre uma superfície de mica clivada recentemente. Em seguida, adicione 5 µ l de amostras finitas para o buffer. Deixe por 2 min para a adsorção de grades de DNA para a superfície de mica. Adicionar outro 50 µ l de 1 x TAE· Buffer de mg a sonda de AFM.
  4. Obter imagens AFM de grades de DNA finitos no fluido escaneando a superfície de mica com sondas AFM triangulares sob o modo de bater. Definir os seguintes parâmetros para digitalização: digitalização tamanho de 0,5-1 µm, resolução de 256 linhas de varredura e varredura taxa de 1,5 Hz (Figura 5).

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Representative Results

O DNA circular move-se ligeiramente mais lento do que seu DNA linear precursor na desnaturação página (Figura 2), porque os poros dentro o DNA circular é penetrado e retardado por gel de fibras23,24,25. A eficiência de reação correta da ligadura para ciclização oligo-monômero depende da sequência de substrato e concentração, temperatura de reação, tempo, etc. Como a concentração de um precursor DNA linear é alta o suficiente para cerca de 3,5 µM, os produtos de ciclização de c64nt (ou c84nt) e a referência de precursor neste protocolo pode ser diretamente sombreado como bandas na placa de TLC sob luz UV sem morrer. Se as bandas de DNA circular são vagos ou invisível, indicando uma falha da reação da ligadura ou um rendimento de produto baixa muito. Às vezes, existem duas bandas acima da faixa linear precursor, referindo-se um anel de oligo-dímero adicionais, exceto o anel correto oligo-monômero. Só deixe as bandas superiores e coletar inferiores. Os produtos de DNA purificados circulares podem ser vistos como pó branco no tubo após secagem a vácuo. Exceto para a página de desnaturação, a pureza do DNA também pode ser medida pelo espectrómetro de UV. O pico de absorção de DNA é em 260 nm. Dois critérios padrão para a pureza do DNA são a relação de absorção de 280 nm/260 nm em 1.8 e de 280 nm/230 nm, geralmente na faixa de 2.0-2.2. Se os rácios acima dois desviam-se os valores padrão, os restos devem ser extraídos novamente pelos seguintes passos 1.18-1,20. Os rendimentos de c64nt e c84nt para a ciclização correto oligo-monômero são medidos no intervalo de 30-60% de acordo com este protocolo.

Análise de página nativa fornece um monte de informações sobre a estabilidade do motivo, pureza, rigidez, modo de assembly de monômero ou polímero, etc (Figura 3). As famílias de montagem de c64nt de c64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt e acDAO-c64nt tem somente uma faixa clara e limpa de cada conjunto, representando são motivos de monômero estável. Enquanto as famílias de montagem c84nt de HJ-c84nt, tHJ-c84nt e c84nt-cDAO telhas têm manchas ao redor de suas bandas principais, indicando subprodutos menores, exceto os motivos de monômero de alvo. Independentemente dos subprodutos menores de associados incorretos, podem ser montados excelentes cDAO-c84nt-O (E) grades de proteção com rendimentos elevados. Para obter uma imagem clara e limpa de electroforese, o volume de carga deve ser não mais do que 10 µ l e a quantidade de DNA deve ser 0,01 ~ 0,02 µ g/mL.

O sucesso das experiências finalmente é avaliado por 1D e 2D nanoestruturas de DNA pelo AFM (Figura 4 e Figura 5). Cada assembly tem suas próprias características morfológicas na escala micrômetro como nanofios, nanotubos, nanospirals, nanoribbons, etc. Além disso, as texturas detalhadas dos assemblies de DNA na escala do nanômetro correlacionaram com seus tamanhos de telha circular teórica e modos de organização muito bem respectivamente são a chave para a verificação da montagem correta e bem sucedida. Portanto, devem ser obtidas panorâmicas e de alta resolução de imagens AFM em escalas do micrômetro e do nanômetro. Escolhas de métodos AFM e sondas são cruciais para as imagens AFM de alta qualidade. A força de verificação deve ser ajustada tão pequena quanto 50 pN26. Se a força de varredura é muito grande, prejudicaria os padrões de DNA nanoestrutural. A limpeza ambiental é outro parâmetro de chave de uma imagem de alta resolução de AFM limpa e bonita no fluido. Todos os buffers devem ser filtrados pelo filtro de 0,22 µm; o porta-sonda e pinças devem ser lavadas por detergente e enxaguadas com água desionizada. Se o ambiente está poluído por detritos de partículas, a ponta da sonda seria danificada ou agarrada por partículas no buffer, afetando a qualidade das imagens AFM.

Figure 1
Figura 1 . Síntese de DNA circular. O diagrama representa como um oligonucleotide linear longo 5'-fosforilada em azul evolui para uma molécula de DNA circular. As duas vertentes de curtas vermelhas representam os oligonucleotides tala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Fotografia de página de desnaturação dos produtos de ciclização de DNA sob UV luz sem morrer. Uma banda de DNA linear 64nt precursor é na faixa da extrema-esquerda e seus produtos de ciclização de circular 64nt DNA (c64nt) aparecem como 9 bandas na horizontal mesmo nível em outras 9 pistas. 9 bandas do c64nt serão cortadas para abstrair o DNAs circulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Fotografias nativo página após morrer e esquemáticos modelos dupla-hélice de telhas circulares. Ambos os polímeros de nanofios de c64nt e c84nt nanofios são representados por suas células de dobramento unidade mais simples, em que os dois alinhados pontos acima e abaixo de cada célula unidade indicam o alinhamento infinito de células unidade verticalmente até e para baixo, com distâncias iguais entre duplex de nanofios de formulário. Telhas circulares de monômero de c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt e tHJ-c84nt em A) têm sem saliências protuberantes fora de seus anéis, enquanto cDAO-c64nt, acDAO-c64nt e cDAO-c84nt em B) têm ambos sem corte-terminado 10 bp saliências respectivamente. Para sequências, por favor consulte a tabela de sequências de DNA. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Imagens AFM de típico 1D e 2D infinitas assemblies de DNA digitalizados no ar. A) c64nt nanofio, B) infinita acDAO-c64nt-E, C) infinita cDAO-c64nt-E, D) infinito cDAO-c64nt-O, E) infinita cDAO-c84nt-E e F) infinito cDAO-c84nt-O são recozidos pela coesão final pegajoso. Todos os detalhes de textura nestas imagens de AFM são compatíveis com os tamanhos de telha e modos de organização muito bem. Para sequências, por favor consulte a tabela de sequências de DNA. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Imagens AFM de conjuntos finitos retângulo digitalizados no fluido. Assembleia da) 5 × 6 cDAO-c64nt-O é composto por 32 telhas de sub cDAO-c64nt e B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O retângulo finito é composta por cDAO-c74nt 12 e 20 cDAO-c84nt sub telhas. Para sequências, por favor consulte a tabela de sequências de DNA. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela de sequências de DNA. Clique aqui para baixar este arquivo. 

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Discussion

Os protocolos apresentados neste artigo enfocam a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares e a montagem de nanoestruturas de DNA. A maioria dos projetos de DNA sequenciado aleatoriamente pode ser usada no presente protocolo. A pureza de DNAs circulares é crítica para o sucesso dos assemblies de DNA. O rendimento de produção de ciclização pode ser melhorado, diminuindo a concentração de DNA linear 5'-fosforilada; no entanto, isto irá aumentar a carga de trabalho para produzir as mesmas quantidades de DNAs circulares. O comprimento das cadeias de ADN tala também afeta a reação da ligadura correto, ele é otimizado para ser em torno de 20 nucleotídeos tempo para c64nt e c84nt.

Uma concentração adequada de cátions de magnésio (EG., 12,5 mM) na solução durante e após montagem é muito importante para a formação e a manutenção de nanoestruturas de DNA. Assim, uma concentração de cátion magnésio de 12,5 mM é sempre mantida durante os processos de recozimento, o nativo página, eletroforese em gel de agarose e PEG do buffer purificações de centrifugação, imagens de AFM, etc.

Para conjuntos finitos retângulo de 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, a purificação do gel de agarose não afeta os detalhes de textura, enquanto a purificação de centrifugação de tampão PEG prejudica os detalhes de textura do DNA nanoestruturas na imagens AFM de alta resolução.

Beneficiar a estabilidade e rigidez de telhas circulares, é mais fácil de produzir bem organizada e grande-tamanho único 2D cristalino chafarizes de módulos circulares do que de telhas lineares e origami scaffolded9,11, embora trabalho extra é necessária para sintetizar e purificar as moléculas de DNA circulares. Com apenas um DNA circular como a mesma estrutura do núcleo, muitos módulos circulares podem ser gerados com diferentes saliências; por meio de coesà específico final pegajosa de saliências nanoestruturas finitas podem ser construídas; Esta estratégia reduz a carga de trabalho e o custo de nanoestruturas finitos. Uma vantagem significativa de nanoestruturas de DNA circulares é a resolução das estruturas secundárias e terciárias de moléculas de DNA e seus elementos-chave como a junção de Holliday, desde os detalhes de textura do único reticulados cristalinos. 1D, 2D e 3D nanoestruturas construídas a partir de módulos circulares e suas potenciais aplicações em biologia, medicina, nano-engenharia e se tornará um novo membro da família de nanotecnologia de ADN no futuro.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos apoio financeiro da NSFC (bolsas de n. º 91753134 e 21571100) e a Universidade Estatal de chave laboratório de bioelectrónica do sudeste.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

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References

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Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

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