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Chemistry

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58744
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la legatura di T4 e denaturazione pagina purificazione di piccole molecole di DNA circolare, ricottura e nativo pagina analisi circolare piastrelle, montaggio e formazione immagine AFM di nanostrutture di DNA 1D e 2D, nonché dell'agarosi gel purificazione di elettroforesi e centrifugazione di nanostrutture di DNA finiti.

Abstract

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la sintesi di piccole molecole di DNA circolare, ricottura di motivi di DNA circolare e la costruzione di nanostrutture di DNA 1D e 2D. Nel corso di decenni, il rapido sviluppo della nanotecnologia del DNA è attribuito all'uso di DNAs lineare come i materiali di origine. Ad esempio, le mattonelle DAO (double crossover, curve a metà in antiparallelo, dispari) sono ben nota come un blocco di costruzione per la costruzione delle grate del DNA 2D; la struttura di base di DAO è fatto da due oligonucleotidi lineare singolo filamento (ss), come due corde facendo un nodo di nonna di mano destra. Qui, un nuovo tipo di piastrelle di DNA chiamato cDAO (accoppiato DAO) sono costruiti utilizzando un piccolo ss-DNA circolare di c64nt o c84nt (circolare 64 o 84 nucleotidi) come filo del patibolo e diversi ss-DNAs lineare come i fili dei punti metallici. Perfetti nanostrutture 1D e 2D sono assemblati da cDAO piastrelle: nanospirals, nanotubi, nanofili infinito, nanonastri; e nano-rettangoli finiti. Protocolli dettagliati sono descritti: 1) preparazione di ligasi T4 e purificazione denaturando pagina (elettroforesi del gel di poliacrilammide) di piccoli oligonucleotidi circolare, 2) ricottura di piastrelle circolare stabile, seguita dall'analisi di pagina nativo, 3) montaggio di infinito 1D nanofili, nanorings, nanospirals, reticoli 2D infiniti di nanotubi e nanonastri e finiti 2D nano-rettangoli, seguita da formazione immagine AFM (microscopia a forza atomica). Il metodo è semplice, robusto e conveniente per la maggior parte dei laboratori.

Introduction

Molecole di DNA sono stati usati per costruire molti generi di nanostrutture nei decenni. Motivi tipici includono DAE (doppio crossover, antiparallelo, anche metà-giri) e DAO piastrelle1,2,3, piastrelle stelle4,5,6,7, singolo incagliato (ss) piastrelle8,9,10e DNA origami11,12,13. Questi motivi di DNA e le grate sono assemblate da ss-DNAs lineare. Recentemente, gli altri e noi abbiamo segnalato l'uso di circolare ss-oligonucleotidi come scaffold per creare motivi, nanotubi 1D e 2D grate14,15,16,17. Inserendo un Holliday junction (HJ)18,19,20,21 presso il centro di c64nt, una coppia di due accoppiati DAO tessere può essere formata17. Questo nuovo motivo di cDAO e suoi derivati sono stabili e sufficientemente rigida da assemblare 2D DNA grate fino a 3 × 5 µm2. In questa carta, usiamo un termine "piastrella circolare", che è definito come una molecola di complessi del DNA stabile costruita con una impalcatura circolare e le altre graffette lineare di ss-oligonucleotidi, e un altro termine di "piastrella lineare", che è costruito da una serie completa di lineare SS-oligonucleotidi.

Questo protocollo viene illustrato come costruire cinque tipi di nanostrutture di DNA con piccole molecole di DNA circolare come impalcature: 1) infinito nanofili di c64nt e c84nt 1D, 2D cDAO-c64nt-O 2) infinito e cDAO-c64nt-E (-O rappresenta un numero dispari di 5 curve a metà e -E rappresenta un numero pari di 4 metà-giri) reticoli, 3) infinite 2D cDAO-c84nt-O ed cDAO-c84nt-E grate, 4) finiti 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rettangoli, 5) infinito 1 D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals (si prega di fare riferimento a Figura 3-5 per i disegni schematici e le immagini di cui sopra cinque generi di nanostrutture di DNA). I nanofili di 1D c64nt e c84nt vengono assemblati da ogni c64nt e c84nt dell'impalcatura associato rispettivamente due graffette lineare. Ogni piastrella circolare di cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt o cDAO-c84nt è temprata dal suo patibolo corrispondente di c64nt, c74nt o c84nt con quattro graffette lineare rispettivamente. I reticoli 2D infiniti sono assemblati con lo stesso tipo di due piastrelle circolari con sequenze diverse. I due reticoli finiti rettangolo 2D sono assemblati da due set di Sub-tessere circolare 32 rispettivamente. Per risparmiare soldi, c84nt, c74nt e c64nt solo uno-sequenziato viene utilizzato come patibolo rispettivo mentre sporgenze differenti sono usati per temprare il 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt e 20 cDAO-c84nt circolare Sub-piastrelle rispettivamente nel primo passaggio ricottura Sub-tile, quindi mescolare le sub-tessere circolare 32 corrispondenti e applicare il reticolo secondo ricottura passo per assemblare il cDAO finiti 5 × 6-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O le grate, rispettivamente. Sicuramente, diversamente-sequenziato circolare ponteggi possono essere adottati per assemblare una varietà di nanostrutture di dimensioni finite, tuttavia vi costerà più soldi e fatiche. L'infinito 1D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals vengono ricotti da uno-sequenziato asimmetrica acDAO-c64nt piastrelle con connessioni lineare di un numero pari di 4 metà-giri. Esistono due approcci per assemblare le grate 2D infinite da circolare piastrelle di cDAO-c64nt e cDAO-c84nt, che si distinguono per le distanze intertile di un numero pari di 4 e un numero dispari di 5 metà-giri rispettivamente. Il primo richiede tutte le tessere per essere allineati in modo identico; quest'ultimo richiede alternanza delle facce di due tessere adiacenti lungo gli assi elicoidali. Se la piastrella è rigida e piana, ad esempio cDAO-c64nt, entrambi gli approcci genererà nanonastri planare; Se la piastrella è curvo verso una direzione, ad esempio cDAO-c84nt, la intertile connessione di un numero pari di 4 giri mezza genereranno nanotubi, mentre la connessione intertile di un numero dispari di 5 giri mezzo produrrà planare nanonastri dovuto l'eliminazione di curvatura-biased crescita di allineamento alternativo di tegole curve. Il corretto montaggio di nanostrutture di DNA 1D e 2D da piastrelle circolare indica diversi vantaggi di questo nuovo approccio: applicate come stabilità e rigidità della circolare piastrelle sopra le mattonelle lineare, piastrelle chirali per assemblaggio di nanostrutture asimmetrico nanorings e nanonastri, nuove visioni sulla comprensione della meccanica del DNA e strutture molecolari, ecc.

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Protocol

1. preparazione di DNAs circolare

  1. Utilizzare il DNAs lineare tutti forniti da aziende commerciali direttamente senza ulteriore purificazione.
  2. Centrifugare i campioni di DNA a 5.000 × g per 5 min raccogliere tutti i pellet di DNA nella parte inferiore dei tubi. Aggiungere un volume adeguato di buffer di TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) per sciogliere il DNA.
  3. Misurare la concentrazione di "a" ng / µ l per ogni soluzione di ss-DNA utilizzando un micro spettrometro UV a 260 nm. Convertire "a" ng / µ l in "b" µM segue b =3 × 10 (peso molecolare del DNA filo). Regolare la quantità di soluzione di TE per rendere una soluzione stock di 10 µM del DNA.
  4. Utilizzare ligasi del DNA T4 per collegare le estremità 3' e 5' dei 5'-fosforilato lineare DNA template ( Figura 1) di c64nt, c74nt e c84nt forniti da aziende commerciali direttamente.
  5. Mescolare il filo del DNA lineare 5'-fosforilato (3,5 µM) e il suo corrispondente filamento di DNA stecca (4,5 µM) in 80 µ l di tampone di TE in una provetta PCR di 200 µ l15. Incubare la provetta in un flacone aperto thermo riempito con acqua a 95 ° C. Raffreddare l'acqua calda a temperatura ambiente (25 ° C) per circa 2-3 ore sotto l'atmosfera del laboratorio.
  6. Aggiungere 10 µ l di buffer di 10 x T4 (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, ATP di 1 mM) e 10 µ l di T4 ligasi (300 U / µ l) per la miscela ad un volume finale di 100 µ l. Incubare la miscela in un termociclatore per 16 ore a 16 ° C.
    Nota: Quanto sopra concentrazioni nel DNA e volume di reazione di ~ 100 µ l sono ottimizzati per l'efficienza di legatura alta e l'elevato rendimento di ciclizzazione corretta oligo-monomero. Eseguire due o più tubi di reazioni di legatura in stesso tempo secondo il disegno sperimentale. Una procedura alternativa di incubazione per passo sostituendo la legatura 1.6 è di 4 ore a 25 ° C.
  7. Dopo l'incubazione, inattivare la ligasi T4 in acqua a 95 ° C per 5 minminutes. Quindi il tubo di trasferimento di acqua e ghiaccio e incubare per 5 minuti per raffreddare.
  8. Aggiungere 10 µ l di 10 x Exonuclease tampone e 10 µ l di Exonuclease I (5 U / µ l) per la miscela estiguuta e incubare la provetta a 37 ° C in bagnomaria per 30 min a digerire il DNAs lineare restante e lasciare intatto il DNAs circolare in modo selettivo.
  9. Preparare un 10% di denaturare i gel di PAGE.
    1. Indossare occhiali e guanti di gomma quando si prepara il gel di pagina nella cappa. Aggiungere 6,67 mL di soluzione di acrilammide/bisacrylamide del 30% (p/v) (19:1), 2 mL di 10 x TAE· Buffer di mg (40 mM Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g di urea (7 M) e acqua deionizzata ad un volume finale di 20 mL in una provetta da centrifuga 40 mL.
      Attenzione: La soluzione di acrilammide/bisacrylamide soluzione (19:1) 30% (p/v) è tossica.
    2. Aggiungere 20 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 100 µ l di ammonio persolfato (APS, 10% w/v) a 40 mL tubo immediatamente prima del trasferimento la soluzione di gel per il sistema di elettroforesi. Inserire un 1,5 mm di spessore e 10 pozzetti pettine. Attendere almeno 20 min per la soluzione di gel è solidificata.
    3. Impostare una tensione costante di 80 V per un gel di 85 × 80 × 1,5 mm3 (larghezza × altezza × spessore). Aggiungere 1 x TAE· Buffer di mg per il sistema di elettroforesi e prerun il gel per 20 min a 10 V/cm.
  10. Mettere la provetta PCR da passo 1,8 a 95 ° C acqua per 5 min inattivare Exonuclease I. Quindi il tubo di trasferimento di acqua e ghiaccio e incubare per un altro 5 min.
  11. Aggiungere 20 µ l di formamide nel tubo fino ad un volume finale di 140 µ l e miscelare la soluzione. Distribuire la soluzione per 7-9 denaturazione pagina gel pozzi ugualmente con 16-20 µ l per ogni gel bene. Mescolare 2 µ l di colorante (blu di bromofenolo 0,05%, 0,05% xilene cianolo FF, 60% glicerolo, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) con 8 µ l di DNA lineare corrispondente precursore di caricamento (10 µM) e iniettare la miscela ad un pozzo separato per riferimento.
    Nota: L'aggiunta di formammide è quello di aumentare la densità della soluzione di caricamento per andare a fondo del gel pagina bene e anche per dissociare alcuni doppio incagliato residui di DNA.
  12. Esegua il gel per circa 2 h a 10 V/cm e interrompere l'esecuzione quando lo xilene cianolo FF è alla posizione 2/3 della lastra di vetro con l'occhio nudo.
  13. Indossare guanti di gomma e occhiali per proteggere gli occhi e pelli. Prendere il gel fuori la lastra di vetro. Collocare il gel su una piastra fluorescente di TLC (cromatografia su strato sottile). Tagliare le bande di gel di destinazione da una lama di rasoio come esattamente come ombreggiato da irradiazione UV (Figura 2).
    Attenzione: La luce UV è dannosa per gli occhi e pelli.
    Nota: Sotto irradiazione UV a 254 nm, DNA assorbirà la luce e gettare un'ombra sulla piastra di TLC. Il DNA circolare correva leggermente più lento del suo DNA lineare corrispondente di precursore. Alcuni non digerito DNAs lineare e indesiderati DNAs circolare in piccole quantità che circondano la band di destinazione ombreggiato inquinerà il DNA circolare se sono stati raccolti.
  14. Trasferire le bande di gel in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL. Aria secca o colpo secco le bande di gel e poi schiacciare i gel in una pasta di una spatola o una bacchetta di vetro appiattito. Assicurarsi che il gel è stato completamente schiacciato in una pasta, che è fondamentale per l'alta resa di DNA circolare. Aggiungere due volte dell'acqua deionizzata volume gel nella provetta ed agitare il tubo a temperatura ambiente durante la notte.
  15. Filtrare la miscela per raccogliere i surnatanti in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL. Recuperare qualsiasi DNA residua sciacquando con piccolo volume di acqua deionizzata e filtro nuovamente per combinare i surnatanti.
  16. Estrarre l'eluente con uguale volume di n-butanolo. Ripetere questa procedura fino a quando il volume acquoso è ridotto a circa 200 µ l.
  17. Aggiungere 500 µ l di etanolo assoluto (− 20 ° C) e 20 µ l di 3 M NaOAc (pH 5.1) alla miscela per precipitazione del DNA. Conservare la provetta a − 20 ° C per 30 min.
  18. Centrifugare la provetta a 12.000 × g per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante. Il precipitato di DNA rimanente è di circa 100 µ l nella provetta.
  19. Aggiungere 600 µ l di etanolo di 75% (− 20 ° C) al tubo e conservarla a − 20 ° C per 30 min. Poi Centrifugare a 12.000 × g per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante. Il precipitato di DNA rimanente è di circa 100 µ l di soluzione nel tubo nuovo. Ripetere la procedura due volte.
  20. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante per quanto possibile. Asciugare i resti con un concentratore a vuoto.
  21. Conservare il DNA circolare purificato nel tubo a − 20 ° C.
  22. Risospendere il DNA circolare in buffer di TE per fare un 10 µM circolare del DNA stock soluzione secondo punto 1.3 quando necessario.

2. ricottura di soluzioni di assemblaggio

  1. Preparare ogni soluzione di montaggio delle mattonelle o nanostrutturale di c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, Yoshua-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt e acDAO-c64nt-E con un insieme progettato di DNAs lineare e circolare per uno-pentola ricottura.
    1. Per ogni soluzione di montaggio, mescolare 2 µ l di 10 x TAE· Buffer di mg, 1 µ l di ogni soluzione di riserva di DNA di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali e ulteriori buffer di TE in una provetta PCR 200 µ l per una concentrazione finale di ogni filo 0,5 µM e un volume finale di 20 µ l. Tempri la soluzione di montaggio in un termo bottiglia da 95 ° C a 25 ° C oltre 48 h.
  2. Preparare ogni soluzione di montaggio delle grate infinite 2D di cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E e cDAO-c84nt-O con un insieme progettato di DNAs lineare e circolare per ricottura in due fasi.
    1. Preparare ogni soluzione di montaggio Sub-piastrelle precursore mescolando 2 µ l di 10 x TAE· Buffer di mg, 1 µ l di ogni soluzione di riserva di DNA di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali e ulteriori buffer di TE in una provetta PCR 200 µ l per una concentrazione finale di 0,5 µM per ogni filo e un volume finale di 20 µ l. Nella prima fase di ricottura Sub-tile, tempri ogni soluzione sub-tile precursore in un termociclatore PCR utilizzando un metodo di raffreddamento veloce-lineare da 95 ° C a 25 ° C oltre 2,5 h.
    2. Preparare ogni soluzione di montaggio delle grate infinite quattro sopra con 10 µ l di ciascuna delle due soluzioni sub-tegola corrispondente insieme ad una concentrazione finale di 0.25 µM per ogni filo. Nel reticolo secondo passo di ricottura, tempra la miscela di 20 µ l in un termociclatore PCR utilizzando un metodo di raffreddamento lento del soggiornare a 50 ° C per 2 h e raffreddamento a una velocità di 0,1 ° C per 5 minuti a 20 ° C, circa 24 h in totale.
      Nota: Due esperimenti paralleli possono essere eseguiti contemporaneamente o successivamente al secondo punto di ricottura per ogni reticolo infinito 2D.
  3. Preparare soluzioni di assemblaggio delle due assemblee finiti rettangolo 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O per ricottura in due fasi.
    1. Preparare ogni soluzione di montaggio Sub-piastrelle precursore mescolando 1 µ l di 10 x TAE· Buffer di mg, 0,5 µ l di ogni soluzione di riserva di DNA di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali e ulteriori buffer di TE in una provetta PCR 200 µ l per una concentrazione finale di 0,5 µM per ogni filo e un volume finale di 10 µ l. Nella prima fase di ricottura, tempra ogni soluzione sub-tile precursore in un termociclatore PCR utilizzando un metodo di raffreddamento veloce-lineare da 95 ° C a 25 ° C oltre 2,5 h.
    2. Preparare ogni soluzione di montaggio della grata finiti rettangolo mescolando 32x (2 µ l di ciascuna soluzione sub-tile) insieme in una provetta PCR 200 µ l ad una concentrazione finale di ~ 15 nM per ogni sub-mattonelle e un volume finale di 64 µ l. Nella seconda fase di ricottura, tempra la miscela di 64 µ l in un termociclatore PCR utilizzando un metodo di raffreddamento lento del soggiornare a 50 ° C per 2 h e raffreddamento a una velocità di 0,1 ° C per 5 min a 20 ° C, circa 24 ore in totale.
      Nota: Cinque esperimenti paralleli possono essere eseguiti contemporaneamente o successivamente nella seconda fase di ricottura per ogni assembly rettangolo finiti.

3. nativo pagina analisi

  1. Preparare un nativo di 10% pagina seguente passaggio 1,9 ad eccezione del componente di urea.
  2. Per campioni di controllo di c64bp e c84bp, aggiungere 2 µ l di ogni soluzione di montaggio e 1 µ l di colorante a 3 µ l di buffer di TE di caricamento come controlli separatamente. Per ognuno degli altri assembly elencati nella Figura 3, aggiungere 1 µ l di ogni soluzione di montaggio e 1 µ l di caricamento tintura a 4 µ l di buffer di TE.
  3. Ognuna delle soluzioni sopra ad un gel iniettare bene. Aggiungere 5 µ l di DNA marker (25-500 bp) in un pozzetto separato per riferimento.
  4. Esegua il gel per circa 4 ore a 10 V/cm in acqua e ghiaccio. Il xilene cianolo FF esaurirà la lastra di vetro.
  5. Indossare guanti di gomma e occhiali per proteggere gli occhi e pelli. Prendere il gel fuori la lastra di vetro e immergetelo in 100 mL di acqua deionizzata con 10 µ l di una macchia di gel di acido nucleico per 30 min.
    Attenzione: La soluzione di macchia del gel di acido nucleico è tossica.
  6. Osservare il gel sotto un UV sistema di imaging e scattare una foto del gel colorato (Figura 3).

4. purificazione di reticoli finiti

  1. Preparare un gel di agarosio al 2% nativi per la purificazione di elettroforesi di reticoli finiti.
    1. Mescolare 1 g di polvere di agarosio, 5 mL di 10 x TBE· Buffer di mg (89 mM Tris, 89 mM acido borico, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µ l di acido nucleico gel macchia e 47,5 mL di acqua deionizzata in un flacone di triangolo da 250 mL. Far bollire il composto fino a quando le bolle diventano piccole e dense. Aggiungere acqua calda in bottiglia per un volume totale di 50 mL e una concentrazione di agarosio al 2%.
    2. Indossare guanti spessi. Versare la soluzione di gel in una scatola di plastica gel di 7 x 10 x 1 cm3 (larghezza × lunghezza × spessore). Inserire un pettine di gel denso e 12-pozzetti di 1,5 mm. Attendere che il gel si raffreddi a temperatura ambiente. Se necessario, mettere il gel in frigorifero a 4 ° C.
      Attenzione: Essere consapevoli di scottature perché la soluzione è molto calda.
    3. Aggiungere 0,5 x TBE· Buffer di mg nel sistema di elettroforesi. Prerun il gel a 5 V/cm per 20 min in un bagno di acqua ghiacciata a una tensione costante di 50 V.
    4. Iniettare 20 µ l della soluzione della grata finiti ben preparata nel passaggio 2.3 in ogni gel di agarosio e aggiungere 5 µ l di un marcatore di DNA (100-3.000 bp) ben separato. Esegua il gel per 2 h a 5 V/cm in acqua e ghiaccio.
    5. Indossare guanti di gomma e occhiali per proteggere gli occhi e pelli. Taglio il bersaglio gel bande con una posizione simile al marcatore bp 1.000 sotto luce UV e fetta in raffinati pezzi e mettere il gel schiacciato in un filtro colonna8.
    6. Centrifugare la colonna a 2.000 x g per 5 min a 4 ° C. Estrarre la soluzione campione attraverso la colonna. Raccogliere la soluzione per l'imaging AFM.
  2. Purificare le grate finite dalla precipitazione di PEG.
    1. Mix 50 µ l di soluzione della grata finiti preparata nel passaggio 2.3 con un volume uguale di 15% PEG8000 (w/v) del buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl)22. Centrifughi la soluzione a 18.000 × g a 4 ° C per 30 min.
    2. Rimuovere il supernatante e aggiungere 100 µ l di tampone di PEG. Ripetere la centrifugazione.
    3. Dopo aver rimosso il supernatante, sciogliere il pellet in 1 x TAE· Buffer di mg per l'imaging AFM.
      Nota: La purificazione è necessaria per i reticoli finiti di 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O per formazione immagine AFM e altre applicazioni. Se il rendimento è troppo basso, aumentare la velocità di centrifugazione. Se il prodotto non è abbastanza puro, ripetere il punto 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. Per c64nt nanofilo, c84nt nanofilo, acDAO-c64nt-E, reticoli 2D infiniti di cDAO-c64nt-E(O) e cDAO-c84nt-E(O), depositano 2 μL di campione ricotto su una superficie di appena fenduti mica. Lasciare per 2 min per adsorbimento delle grate del DNA alla superficie di mica. Lavare due volte la superficie con 100 µ l di acqua deionizzata e asciugare con aria compressa.
  2. Ottenere immagini AFM di infinito grate del DNA in aria analizzando la superficie di mica con le sonde AFM triangolare sotto modalità a intermittenza. Impostare i seguenti parametri per la scansione: scansione dimensione di 0,5 ~ 5 µm, risoluzione di 512 linee di scansione e acquisizione di 3,5 Hz (Figura 4).
  3. Per reticoli finiti di DNA di 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, deposito 80 µ l di 1 x TAE· Buffer di mg su una superficie di appena fenduti mica. Quindi aggiungere 5 µ l di campioni finiti nel buffer. Lasciare per 2 min per adsorbimento delle grate del DNA alla superficie di mica. Aggiungere un altro 50 µ l di 1 x TAE· Buffer di mg sulla sonda AFM.
  4. Ottenere immagini AFM di finiti grate del DNA nel liquido analizzando la superficie di mica con le sonde AFM triangolare sotto modalità a intermittenza. Impostare i seguenti parametri per la scansione: scansione dimensione di 0,5-1 µm, risoluzione di 256 linee di scansione e acquisizione di 1,5 Hz (Figura 5).

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Representative Results

Il DNA circolare si muove leggermente più lento del suo DNA lineare precursore nel denaturare pagina (Figura 2) perché è penetrato il poro dentro il DNA circolare e ritardato di gel fibre23,24,25. L'efficienza di reazione di legatura corretta per ciclizzazione oligo-monomero dipende dalla sequenza di substrato e concentrazione, temperatura di reazione, tempo, ecc. Come la concentrazione di un precursore DNA lineare è abbastanza alta a circa 3,5 µM, i prodotti di ciclizzazione di c64nt (o c84nt) e il riferimento di precursore in questo protocollo può essere offuscato direttamente come bande nella piastra di TLC sotto luce UV senza morire. Se le bande di DNA circolare sono vaghe o invisibile, che indica un errore di reazione di legatura o una resa molto bassa prodotto. A volte ci sono due bande sopra la banda lineare precursore, riferendosi un anello supplementare oligo-dimero tranne l'anello corretta oligo-monomero. Basta lasciare solo le bande alte e raccogliere quelle inferiori. I prodotti di DNA circolari purificati possono essere visto come polvere bianca nel tubo dopo essiccazione sotto vuoto. Ad eccezione della pagina di denaturazione, la purezza del DNA può anche essere misurata dallo spettrometro UV. Il picco di assorbimento di DNA è a 260 nm. Due criteri standard per la purezza del DNA sono il rapporto di assorbimento di 280 nm/260 nm a 1.8 e quella di 280 nm/230 nm comunemente nella gamma di 2.0-2.2. Se i due rapporti sopra si discostano dai valori standard, i resti dovrebbero essere estratti nuovamente da seguenti passaggi 1.18-1.20. I rendimenti di c64nt e c84nt per la ciclizzazione corretta oligo-monomero sono misurati nell'intervallo di 30-60% secondo questo protocollo.

Nativo pagina analisi fornisce un sacco di informazioni sulla stabilità di motivo, purezza, rigidità, modalità di assemblaggio di monomero o polimero, ecc (Figura 3). Le famiglie di montaggio c64nt di c64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt e acDAO-c64nt hanno solamente una banda chiara e pulita per ogni Assemblea, che rappresenta sono motivi di monomero stabile. Mentre le famiglie di montaggio c84nt di piastrelle HJ-c84nt, Yoshua-c84nt e cDAO-c84nt avere sbavature intorno loro band principale, che indica minori sottoprodotti tranne che per i motivi di monomero di destinazione. Indipendentemente dal fatto i minori sottoprodotti dei soci non corretti, possono essere assemblate eccellente grate di cDAO-c84nt-O (E) con alti rendimenti. Per ottenere un'immagine chiara e pulita di elettroforesi, il volume di carico dovrebbe essere non più di 10 µ l e la quantità di DNA dovrebbe essere 0.01 ~ 0,02 µ g/mL.

Il successo degli esperimenti è infine valutato di nanostrutture di DNA 1D e 2D, ripreso da AFM (Figura 4 e Figura 5). Ogni assembly ha le proprie caratteristiche morfologiche in scala micrometrica ad esempio nanofili, nanotubi, nanospirals, nanonastri, ecc. Inoltre, la texture dettagliate delle assemblee del DNA in scala nanometrica correlato alla loro teorica circolare formati e modalità di organizzazione molto ben rispettivamente sono la chiave per la verifica del montaggio corretto e di successo. Di conseguenza, devono essere ottenute sia panoramiche e ad alta definizione immagini AFM in scala micrometrica e nanometrica. Scelte di metodi AFM e sonde sono cruciali per le immagini AFM di alta qualità. La forza di scansione dovrebbe essere regolata piccolo come 50 pN26. Se la forza di scansione è troppo grande, danneggerebbe i modelli nanostrutturale DNA. La pulizia dell'ambiente è un altro parametro fondamentale per ottenere una pulito e bella immagine AFM ad alta risoluzione nel liquido. Tutti i buffer devono essere filtrati da 0,22 µm filtro; il portasonda e pinzette devono essere lavate con detergente e risciacquate con acqua deionizzata. Se l'ambiente è inquinato da residui di particolato, la punta della sonda sarebbe danneggiata o si aggrappò dalle particelle nel buffer, influenzando così la qualità delle immagini AFM.

Figure 1
Figura 1 . Sintesi di DNA circolare. Il diagramma di flusso rappresenta come un oligonucleotide lineare lungo 5'-fosforilato in blu si evolve ad una molecola di DNA circolare. I due filamenti corti rossi rappresentano i oligonucleotides di stecca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Fotografia pagina denaturazione dei prodotti di ciclizzazione di DNA sotto UV luce senza morire. Una banda di DNA lineare 64nt precursore è nella corsia di sinistra e i suoi prodotti di ciclizzazione di circolare 64nt DNA (c64nt) vengono visualizzati come 9 bande in orizzontale stesso livello in altre 9 corsie. 9 bande di c64nt saranno tagliate fuori per astrarre DNAs circolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Fotografie di PAGE nativo dopo modelli doppia elica morente e schematiche di piastrelle circolari. Entrambi polimeri di nanowire c64nt ed c84nt nanowire sono rappresentati dalle loro cellule di unità pieghevole più semplice, in cui i due allineati punti sopra e sotto ogni cella unità indicano l'allineamento infinito delle celle unitarie verticalmente fino e giù, con distanze uguali tra appartamenti su due piani a forma di nanofili. Monomero circolare piastrelle di c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt e Yoshua-c84nt in A) non hanno sporgenze sporgenti fuori i loro anelli, mentre cDAO-c64nt, acDAO-c64nt e cDAO-c84nt in B) hanno entrambi smussato-conclusa 10 bp sporgenze rispettivamente. Per le sequenze, consultare la tabella delle sequenze di DNA. Questa figura è stata modificata da una figura precedentemente pubblicati17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Nella figura 4. Immagini AFM di e assembly DNA tipico infinito, 1D e 2D scansionati in aria. C64nt nanofilo di A), B) infinito acDAO-c64nt-E, C) infinito cDAO-c64nt-E, D) infinite cDAO-c64nt-O, E) infinito cDAO-c84nt-E e F) infinite cDAO-c84nt-O vengono ricotti di coesione brutta fine. Tutti i dati di consistenza in queste immagini AFM sono in linea con le mattonelle di dimensioni e modalità di organizzazione molto bene. Per le sequenze, consultare la tabella delle sequenze di DNA. Questa figura è stata modificata da una figura precedentemente pubblicati17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Immagini AFM di assembly finiti rettangolo scansionati in liquido. L'Assemblea di rettangolo finiti di A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O è composto da 32 cDAO-c64nt Sub-piastrelle e B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O è composto da 12 cDAO-c74nt e 20 cDAO-c84nt Sub-piastrelle. Per le sequenze, consultare la tabella delle sequenze di DNA. Questa figura è stata modificata da una figura precedentemente pubblicati17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella delle sequenze di DNA. Per favore clicca qui per scaricare questo file. 

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Discussion

I protocolli presentati in questo focus articolo sulla sintesi di piccole molecole di DNA circolare e l'assemblaggio di nanostrutture di DNA. La maggior parte dei disegni di DNA sequenziati in modo casuale può essere utilizzata in questo protocollo. La purezza di DNAs circolare è critica per il successo delle assemblee del DNA. Il rendimento di produzione di ciclizzazione può essere migliorato abbassando la concentrazione di DNA lineare 5'-fosforilato; Tuttavia, questo aumenterà il carico di lavoro per produrre la stessa quantità di DNAs circolare. La lunghezza dei filamenti di DNA di stecca colpisce anche la reazione di legatura corretta, è ottimizzato per essere circa 20 nucleotidi lungo per entrambi c64nt e c84nt.

Una concentrazione appropriata dei cationi di magnesio (ad es., 12,5 mM) nella soluzione durante e dopo il montaggio è molto importante per la formazione e la manutenzione di nanostrutture di DNA. Così, una concentrazione di catione magnesio di 12,5 mM è sempre tenuta durante i processi di ricottura, nativo pagina, elettroforesi su gel di agarosio e PEG buffer purificazioni di centrifugazione, AFM imaging, ecc.

Per assemblaggi finiti rettangolo di 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, la purificazione del gel dell'agarosi non influisce i dettagli di texture, mentre la purificazione di centrifugazione PEG buffer danneggia i dettagli di texture di nanostrutture di DNA nella immagini ad alta risoluzione di AFM.

In particolare la stabilità e rigidità di piastrelle circolare, è molto più facile produrre ben organizzata e grate del 2D cristallino singola di grandi dimensioni da moduli circolari rispetto da piastrelle lineari e origami messo9,11, anche se lavoro supplementare è necessario per sintetizzare e purificare le molecole di DNA circolare. Con un solo DNA circolare come la stessa struttura di base, molti moduli circolari possono essere generati con diverse sporgenze; per mezzo di coesione specifico fine appiccicoso di sporgenze nanostrutture finiti può essere costruito; Questa strategia riduce il carico di lavoro e il costo delle nanostrutture finiti. Un vantaggio significativo di nanostrutture di DNA circolare è la risoluzione delle strutture secondarie e terziarie delle molecole del DNA e loro elementi chiave come giunzione di Holliday dai dettagli trama del singoli reticoli cristallini. La 1D, 2D e 3D nanostrutture costruito da moduli circolari e loro potenziali applicazioni in biologia, medicina e nano-ingegneria diventerà in futuro un nuovo membro della famiglia della nanotecnologia del DNA.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Siamo grati per il sostegno finanziario da NSFC (sovvenzioni n. 91753134 e 21571100) e lo stato chiave laboratorio di Bioelettronica di Southeast University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

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References

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