Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولات لتقييم تأثير البروتينات الفلورية في تجميع والسمية لتوسيع polyglutamine تجمعات للتقييم السريع لبروتين فلوري أونتشاراكتيريزيد حديثا في السياق الصحفيين الفلورسنت.
Abstract
للتحقيق في التعريب البروتين والاتجار باستخدام imaging خلية حية، الباحثين غالباً ما تعتمد على الصمامات على بروتين الفائدة لمراسل فلورسنت. المتطورة باستمرار قائمة البروتينات الفلورية المشفرة جينياً (FPs) يوفر للمستخدمين مع عدة بدائل عندما يتعلق الأمر بتصميم الفلورسنت الانصهار. وقد كل FP الخصائص البصرية والفيزيائية الحيوية التي يمكن أن تؤثر في الخصائص البيوكيميائية والخلوية، والوظيفية للانشطار الفلورسنت الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تميل FPs عدة شكل غير محدد ليغومرات التي عرضه لإعاقة وظيفة الشريك الانصهار. لسوء الحظ، توجد سوى عدد قليل من الطرق لاختبار تأثير FPs على سلوك المراسل الفلورسنت. هنا، يمكننا وصف أسلوب بسيط يتيح للتقييم السريع لتأثير إطارا في الثانية باستخدام فحوصات السمية بوليجلوتاميني (polyQ) في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. البروتينات هونتينجتين PolyQ--الموسع ترتبط بظهور مرض هنتنغتون (HD)، حيث تجمع هونتينجتين الموسعة ليغومرات السامة وإدراج الهيئات. التجميع وسمية polyQ التوسعات في الخميرة تعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسلات المرافقة منطقة polyQ، بما في ذلك وجود العلامات الفلورسنت، مما يوفر منصة تجريبية مثالية لدراسة تأثير FPs على السلوك بهم شريك الانصهار.
Introduction
حيث تم وضع توصيف الأولية من البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) من فيكتوريا أيقووريا1، لوحة واسعة من FPs وراثيا المرمزة، يسمح علماء الأحياء الخلية تعريب وتتبع في الوقت نفسه متعددة الأحداث/البروتينات الخلوية في معيشة الخلايا2،3. FPs مشتقة من كائنات متعددة، من قنديل البحر للمرجان، ومن ثم عرض الخصائص الفيزيائية الحيوية محددة تحول على نطاق واسع خارج الطيف الفلورسنت كل منها على. وتشمل هذه الخصائص السطوع، فوتوستابيليتي، وميل إلى أوليجوميريزي بين الآخرين2،4. تحديد أحادي FPs جانبا مهما في اختيار علامة مناسبة عند تصميم مراسل فلورسنت، بغية تقليل التفاعلات غير مناسب وتعديلات مهمة الشريك الانصهار وتعظيم كفاءة مراسل ونظرا لحجرة الخلوية4،،من56. في حين قد تطور التجارة والنقل، على مر الزمن، لتقليل تأثير إضافة علامة مضيئة للانصهار شريك5،،من78، كيفية أداء المتغيرات FP الجديدة بالمقارنة مع التجارة والنقل لا يزال من الصعب تقييم.
توجد أساليب عدة لوصف سلوك FPs. معظمها تتضمن اختبار الخصائص الفيزيائية الأحيائية إطارا في الثانية باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية، مثل تنبيذ فائق وهلام الترشيح البروتوكولات9،10،،من1112. مثل هذه الأساليب والتحذير من استخدام FPs المنقاة في الحل، توفر القليل من التبصر في سلوكهم في خلايا سليمة. تطوير عروض المقايسة هيولى السلس المنظم (عسر) بتقييم قابلة للقياس الكمي للميل في الثانية إلى أوليجوميريزي في المعيشة الخلايا13 عن طريق اختبار قدرة overexpressed في الثانية لإعادة تنظيم الأنابيب هيولى في عسر جدلات14. هذا الأسلوب بنجاح الكشف عن التغييرات بين المتغيرات موحودي وأوليجوميريك للتجارة والنقل وغيرها في الثانية. ومع ذلك، يعتمد معظمها على أوفيريكسبريسيون في خلايا transfected عابر، وكوانتيتاتيون، وتحليل الصور يمكن أن يستغرق وقتاً طويلاً ما لم يتم اعتماد التقنية كجمع البيانات آليا وتحليل سير العمل.
من أجل استكمال هذه النهج، أنشأنا فحص أن يستفيد من تأثير العلامات الفلورية في سمية والتجميع للتوسعات polyQ في الخميرة15،16. ويكرر التوسع في امتداد polyQ مع أكثر من 36 داخل إكسون أول من ترميز الجينات البروتين هونتينجتين (Htt) يرتبط بمرض هنتنغتون17،18. التعبير عن توسيع Httex1 في نتائج الخميرة في تجميعاً قوية من البروتين Htt تجمعات بالإضافة إلى خلل نمو حاد. من المثير للاهتمام، تتأثر بشدة هذه تعمل تسلسل المرافقة على امتداد polyQ، بما في ذلك15،في الثانية16. أنه تم ترشيد أن خصائص مختلفة من FPs خلطات يمكن أن تؤثر على polyQ سمية في الخميرة. وفي الواقع، بالمقارنة مع قوة حماية المنشآت مثل التجارة والنقل، بروتينات الفلورسنت الأحمر وأشكالها تطورت أظهرت انخفاض السمية والتراكم16. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة لتقييم الأثر للجيل القادم من قوة حماية المنشآت في polyQ السمية والتراكم في الخميرة. يسمح هذا الفحص لتحليل السريع ويحتمل أن تكون عالية المحتوى FP المتغيرات التي يمكن استخدامها بالتوازي مع سبق تتميز تقنيات لتوصيف الأمثل من جديد في الثانية ويمكن تقييم كيف تؤدي مقارنة بالتجارة والنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الجيل الجديد فلوريسسينتلي معلم Httex1 الصحفيين لتعبير في الخميرة
ملاحظة: هذا المقطع تم تعديل من البروتوكول بواسطة جيانغ et al. 16 والبكري وآخرون 19.
- تصميم كبسولة تفجير لتضخيم تسلسل ترميز البروتينات الفلورية أو الاهتمام ببكر. التمهيدي إلى الأمام ينبغي أن تتضمن تسلسل زعيم مساعدة إنزيم التقييد خلال الهضم (جتك)، يليه موقع تقييد سبيي (أكتاجت) وأسس 20 المصب ATG (باستثناء ATG) الجينات البروتينات الفلورية ذات الاهتمام. ينبغي أن تشمل التمهيدي عكس التسلسل الزعيم (جتك)، يليه موقع تقييد سالي (جتكجاك) وعكس تكمل 20 أسس المنبع كودون التوقف من تسلسل وتنظيم الأسرة (بما في ذلك إيقاف).
- استخدام كبسولة تفجير تصميم في الخطوة 1، 1، القيام برد فعل PCR باستخدام ثيرموسيكلير مع الإعدادات التالية: الحرارة إلى 95 درجة مئوية 1 دقيقة ودورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة كل كيلو بايت لمنتج PCR. إجراء دورات 18 وافرة.
- تشغيل رد فعل [بكر] على [اغروس] هلام (0.5 في المائة في تريس-خلات-يدتا). وينبغي أن هناك عصابة واحدة المقابلة لحجم الناتج المتوقع. عزل جزء على استخدام مجموعة أدوات تنقية هلام.
- يستخدم البروتوكول متجهex1 Htt تحمل 25 (نونتوكسيك) و 72 (HD-المرتبطة، عرض تجميع قوي) يكرر polyQ. هضم الشظايا بكر وناقلات مع إنزيمات التقييد سبيي وسالي عن ح 3 في 37 درجة مئوية.
- تنقية الموجه هضمها بتشغيله على [اغروس] هلام كما في الخطوة 1، 3.
- تطهير الجزء PCR هضمها باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
- سد جزء بكر هضمها الناتجة و p415-GAL1-العلم-25/72QpolyQ والبلازميدات1 استخدام T4 ليجاسى (ح 1 في درجة حرارة الغرفة). استخدام فعل 10 ميليلتر (1 ميليلتر من إنزيم T4، 1 ميليلتر من 10 X العازلة وميليلتر 6 من [بكر] جزء و 2 ميليلتر من ناقلات الأمراض).
- تحويل 2 ميليلتر من رد فعل ربط إلى 50 ميليلتر من الإشريكيّة القولونية-الخلايا المختصة واحتضانها لهم على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم الحرارة صدمة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 30 س. أضف 1 مل من شركة نفط الجنوب ثمرة وسائط الإعلام، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1 في شاكر. لوحة 200 ميليلتر من رد فعل على صفيحة رطل-أجار تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- حدد ثلاثة المستعمرات البكتيرية الفردية وينمو عليها بين عشية وضحاها في 3 مل من رطل-مرق تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية في شاكر واستخراج بلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد.
- التحقق من بلازميد بهضم 500 نانوغرام من الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد سبيي وسالي عن ح 1 في 37 درجة مئوية وتشغيل رد فعل على [اغروس] هلام (0.5 في المائة في تريس-خلات-يدتا). وينبغي أن يكون هناك شريطين في أحجام الصحيح لمكافحة ناقلات (~ 7 كيلو بايت) والإدراج (الحجم يختلف وفقا للجينات للفائدة). ثم، تحقق من بلازميد بالتسلسل.
- تحويل p415-GAL1-البلازميدات-polyQ-FPالعلمإلى سلالة الخميرة W303 عقب تحول خميرة قياسية بروتوكول2.
2-اكتشاف الإنزيم
- الانتصارات الخميرة استنساخ تحمل 25Q/72Q المفتاحية FP للفائدة على صفيحة أجار تحتوي على الخميرة اختيار وسائل الإعلام (الاصطناعية إكمال-اتفاقية استكهولم دون لوسين) مع السكر كمصدر للكربون. في الوقت نفسه، أيضا خط 25Q/72Q-يمسفجفب ليكون بمثابة عنصر إيجابي.
ملاحظة: بني 25Q/72Q التي لا تحتوي على علامة نيون ليست سامة ويمكن أن تكون بمثابة مراقبة سلبية. - احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمد 2-3.
- حدد المستعمرات واحدة يصل إلى ثلاثة من اللوحة.
- تلقيح 5 مل من اتفاقية استكهولم وتستكمل مع الجلوكوز 2% كمصدر للكربون.
- بيليه 200 ميليلتر من كل ثقافة بين عشية وضحاها وغسله الماء المقطر x 3 مع العقيمة.
- ريسوسبيند الخلايا في اتفاقية استكهولم الوسائط التي تحتوي على اللبن 2% كمصدر للكربون للحث على التعبير عن اندماج polyQ. احتضان اللبن في وسائل الإعلام بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في دوار أنبوب. كعنصر تحكم، كرر هذه الخطوة باستخدام الوسائط التي تحتوي على السكر.
- في صباح اليوم التالي، مساواة كثافة الخلية للكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) من 0.2 في 100 ميليلتر وسائط اتفاقية استكهولم في لوحة 96-جيدا عقيمة.
- إعداد أربعة تخفيف خمسة إضعاف لكل عينة بالماء المعقم قبل بيبيتينج ميليلتر 20 عينة من السابق إلى 80 ميليلتر لوسائل الإعلام في البئر القادم.
- استخدام خميرة تثبيت الأداة على الفور الخلايا على لوحات الانتقائي (التي تحتوي على السكر أو اللبن) واحتضان عند 30 درجة مئوية لمد 2.
- صورة اللوحات مع جهاز توثيق صورة.
3-التحديد الكمي لنمو الخلايا في ثقافة السائل
- إعداد الثقافات الخلية، الخطوات التالية 2.1-2.5 من هذا البروتوكول.
- قياس OD600 باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- تمييع الخلايا OD600 من 0.1 في 300 ميليلتر لوسائل الإعلام في صفيحة 96-جيدا.
- قم بتشغيل كل عينة في ثلاث نسخ.
- احتضان اللوحة في لوحة قارئ/حاضنة مع قدرات تهتز. تعيين العدد من العينات، درجة حرارة 30 درجة مئوية، وامتصاص 600 نيوتن متر، وطول هذه التجارب إلى 24 ساعة، وفترات القياس لمدة 15 دقيقة، وحدد أسلوب الهز المستمر.
- إنشاء منحنى النمو وتحديد المنطقة الواقعة تحت المنحنى باستخدام برامج الرسوم البيانية العلمية. ويوصي 7 المنشور جرافباد. لصق البيانات إلى جدول تخطيط س وص مع ثلاث قيم نسخ متماثل. سيظهر منحنى النمو ضمن المجلد الرسوم البيانية في الجانب الأيسر. لتحديد مقدار المساحة تحت المنحنى، حدد تحليل في أعلى يسار وانقر فوق المساحة تحت المنحنى في تحليلات س وص.
4-الفلورسنت مجهرية
- إعداد الثقافات الخلية، الخطوات التالية 2.1-2.5 من هذا البروتوكول.
- تمييع الخلايا 10 x في نمو وسائل الإعلام ونقل ميليلتر 200 لكل عينة للدوائر التصوير 8-جيدا.
- صورة الخلايا باستخدام مجهر [كنفوكل] مجهزة بهدف أبروتشروموات خطة X 63 (1.4 غ) في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: استخدام مجهر [كنفوكل] اختياري. يمكن أيضا استخدام مجهر فلوري واسع المجال قياسية. - ضبط السلطة الثقب والليزر للحصول على الصورة المثلى. منذ المجاميع 72Q أكثر إشراقا بكثير من الإشارات 25Q منتشر، غالباً ما يلزم استخدام إعداد اقتناء مختلف بين والبلازميدات مختلفة بغية تجنب تشبع إشارة الفلورسنت.
- معالجة الصور باستخدام إيماجيج20 أو آخر من برامج معالجة الصور. في هذه الخطوة، المطلوب هو النسبة المئوية للخلايا يمكن أن يحسب إجمالي العرض يدوياً.
5-دوت وصمة عار
ملاحظة: يستخدم دوت وصمة عار في هذا البروتوكول، لفحص مستويات البروتين التعبير. إعداد الثقافات الخلية، الخطوات التالية 2.1-2.5 من هذا البروتوكول.
- توليد ليساتيس البروتين باستخدام الخرز الزجاج في المخزن المؤقت لتحلل (100 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ 200 ملم كلوريد الصوديوم؛ يدتا 1 مم؛ والغليسيرول 5%، 1 مم ديثيوثريتول [DTT]). إضافة مثبطات البروتياز، وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل 4 ملم (بسمف)، ومثبط البروتياز كوكتيل، مباشرة قبل الاستخدام. بيليه 5 مل ثقافة بين عشية وضحاها، وريسوسبيند أنه في 200 ميليلتر من الزجاج الخرز و 200 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. دوامة 30 ثانية ل 12 طلقة. الطرد المركزي في 12,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وجمع المادة طافية.
- بقعة مبلغ مساو لمجموع البروتينات في غشاء النيتروسليلوز تستخدم جهاز الترشيح الدقيق. برويت الغشاء مع برنامج تلفزيوني وتجميع الجهاز. الاتصال بمصدر فراغ وتأكد من أن يتم تشديد الخناق. بدوره على الفراغ وترك عينة عامل تصفية من خلال الغشاء بالجاذبية.
- كتلة الغشاء في برنامج تلفزيوني-0.05% Tween/5% الحليب الخالي من الدهون.
- احتضان الغشاء مع الأضداد المضادة العلم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. علم مكافحة [مونوكلونل] يوصي M1.
- يغسل الغشاء 3 x ل 10 دقيقة مع توين PSB-0.05%.
- احتضان الغشاء مع جسم ثانوي مسمى فلوريسسينتلي (الماوس المضادة IgG) ح 1 في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني-0.05% Tween/5% الحليب الخالي من الدهون.
- يغسل الغشاء 3 × 10 دقيقة مع توين PSB-0.05%.
- الصورة-وصمة باستخدام نظام توثيق إيمونوبلوت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد fPs مختلفة الخصائص الفيزيائية، بما في ذلك ميلها إلى أوليجوميريزي، التي يمكن أن تؤثر على سلوك شركائها الانصهار في سياق الصحفيين الفلورسنت. ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة حيث FPs متعددة يمكن أن تنصهر فيها للتوسعات polyQ السامة. نظراً لسمية polyQ تعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسلات المرافقة polyQ تمتد15، يسمح هذا التحليل مقارنة السريع والمباشر للصحفيين الانصهار polyQ نيون (الشكل 1). طول عالية الدقة غير المرتبطة polyQ (25Q) يستخدم كعنصر سلبي وليس عرض سمية كبيرة أو تجميع15،16،،من2122. ويستخدم 72Q للحصول على تعمل مثل عالية الدقة، بما في ذلك تجميع polyQ وتثبيط النمو القوى. الأهم من ذلك، توظيف Httex1 الترميز تسلسل الافتقار إلى المجال الغنية برولين الذي يتبع امتداد polyQ. حضور المجال برولين الغنية، ليست سامة في الخميرة15Httex1 . في هذا التحليل، Httex1 تنصهر فيها متغير أحادي محسن للخميرة سوبيرفولدير التجارة والنقل (يمسفجفب) من12 16 عنصر تحكم إيجابية كما هو موضح سابقا16. بنيات تحتوي أيضا على علامة حانمه علم في ن-المحطة من Httex1. يسمح هذا الكشف عن اندماج مختلف مع جسم نفس (المضادة العلم) لتحليل الكيمياء الحيوية. كإثبات لمبدأ، 72Q Httex1 تنصهر فيها محسن للخميرة TagBFP2 (yomTagBFP2)23 لا يؤدي بطء النمو التي تقاس أما فحوصات موضعية على ألواح أجار أو النمو في وسائل الإعلام السائلة (الشكل 2)، مما يدل على أن الطبيعة علامة نيون يمكن أن تعيق في الواقع السلوك التوسع polyQ في الخلايا.
ويمكن تقييم تجميع اندماج polyQ نيون استخدام مجهر فلوري. 72Q-يمسفجفب عرض التجميع كبيرة مقارنة مع 25Q. بيد أن إشارة الفلورسنت 72-يومتاجبفب لا تزال منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم (الشكل 3). في معظم الحالات، لا ينصح باستخدام نفس إعدادات اقتناء الصورة (الليزر السلطة، وقت التعرض) الحصول على صور 25Q و 72Q على حد سواء. المجاميع في الخلايا معربا عن 72Q أكثر إشراقا بكثير من الإشارات 25Q وتنتشر. ولذلك، تحت ظروف التصوير المستخدمة للحصول على صور 72Q، إشارة 25Q تنتشر قد تبدو ضعيفة جداً أو لا تكون مرئية على الإطلاق. ينبغي أيضا تطبيق إعدادات اقتناء المناسب لتقليل تشبع الخلايا معربا عن 72Q أثناء التصوير.
يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير من اندماج polyQ مختلف سمية. أميلويدس المنظفات تستعصي على الحل، مثل المجاميع polyQ، يصعب دراسة المتحلل وليست مناسبة لتحليل standerd الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. لذلك، يمكن إجراء البقع دوت لتقييم مستويات البروتين. إدراج العلامة العلم في نهاية تيرمينوس الأمينية Httex1 يسمح الكشف عن جميع الأنشطار الفلورسنت في وقت واحد، على الرغم من وجود قوة حماية المنشآت (الشكل 4). وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد (SDD-العمر) لتقييم تشكيل polyQ ليغومرات16. البروتوكول مفصلاً والفيديو متوفرة في هالفمان ولندكست24.
رقم 1: رسم تخطيطي لسير العمل لتحليل تأثير العلامة بروتين فلوري في تجميع وسمية polyQ التوسع البروتينات في الخميرة. أولاً، يتم استنساخ FPs في ناقلات التعبير الخميرة ترميز صيغة اللبن إيندوسيبلي لمعلم العلم Httex1 إيواء أما 25Q (نونتوكسيك) أو 72Q (المرتبطة بهد وتجميع والسامة) يكرر. الحيوانات المستنسخة هي تحديد والتحقق من تسلسل، ومن تحول فيما بعد، في الخميرة. عقب إدخال تعبير الانصهار polyQ بالحضانة في الوسائط التي تحتوي على اللبن، أما فحوصات بقع دم على ألواح أجار أو سائل وسائط النمو يمكن تقييم سمية polyQ. ويتم تحليل التجميع PolyQ بالفحص المجهري نيون. يتم تقييم تعبير نسبي من بنيات مختلفة باستخدام دوت وصمة عار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: النمو الممثل مقايسة النتائج بعد التعبير عن Httex1 نيون الأنشطار في الخميرة. الخميرة معربا عن 25Q أو 72Q Httex1 تنصهر فيها يمسفجفب أو يومتاجبفب كان مثقف في الجلوكوز (تحكم) أو اللبن وسائل الإعلام (التي يسببها polyQ) بين عشية وضحاها وأما (أ) رصدت على لوحات أجار أو (ب) المحتضنة زيادة في السائل وسائل الإعلام لتقييم النمو تحت ظروف مختلفة. في حين يدفع يمسفجفب 72Q خلل نمو كبير، يعرض 72Q-يومتاجبفب النمط الظاهري نمو مماثلة لنظرائهم نونتوكسيك 25Q. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صور الفلورسنت الممثل Httex1 نيون الأنشطار في الخميرة. الخميرة معربا عن 25Q أو 72Q Httex1 تنصهر فيها يمسفجفب أو يومتاجبفب كان مثقف في الجلوكوز (تحكم) أو اللبن وسائل الإعلام (التي يسببها polyQ) بين عشية وضحاها وتصويرها مجهر [كنفوكل]. بينما ينتج التعبير 72Q-يمسفجفب تجميع بروتين polyQ قوية، 72Q-يومتاجبفب يعرض إشارة هيولى تنتشر مماثلة لنظرائهم نونتوكسيك 25Q. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: دوت الممثل لطخة تحليل التعبير الانصهار الفلورسنتex1 Htt في الخميرة. الخميرة وإذ تعرب عن 25Q "أو" 46Q "أو" 72Q "أو" 103Q Httex1 تنصهر فيها الحراجية المعتمدة مثقف في وسائل الإعلام اللبن (التي يسببها polyQ) بين عشية وضحاها وتجهيزها لتحليل لطخة دوت. يتم إظهار تخفيف خمسة إضعاف من ليساتيس الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، كانوا يعملون فحوصات مختلفة لقياس تجميع Httex1 polyQ التوسعات وأثرها على نمو الخميرة كنموذج لدراسة الفلورسنت كيف مختلف البروتينات تغيير شركائها الانصهار في سياق الصحفيين نيون . استخدام متغير التجارة والنقل (يمسفجفب) كعنصر إيجابي، واظهرنا أن هذا الكشف عن تغييرات كبيرة في polyQ السمية والتراكم بين مختلف العلامات الفلورية ويسمح بمقارنة أداء الانصهار polyQ-FP ضد المباشر والسريع بروتينات فلورية خضراء الموسومة بنيات16،19.
بينما يركز هذا البروتوكول على البروتينات الفلورية، يمكن أن تكون أجزاء مختلفة من البروتوكول يسهل تكييفها لاختبار آثار أخرى علامات البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم هذا البروتوكول ناقلات سينتروميريك نسخة منخفضة الخميرة التي يمكن أن تختلف من حيث عدد النسخ (عموما نسخة واحدة وسنتين) موجودة في الخلايا25. استخدام ناقلات التكاملية لضمان تعبير موحد عبر الظروف التجريبية يمكن التحايل على هذه المشكلة. في حين قد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام في الخلفية W303، يمكن أن تستخدم سلالات S. cerevisiae الأخرى. ومع ذلك، ينبغي تحديد القابلية لسمية polyQ استخدام ناقلات معلم يمسفجفب قبل تصميم بنيات جديدة. وفي بعض الحالات، قد يكون من المناسب استخدام ناقلات عالية-نسخة (2µ) لتوليد خلل نمو كبير. ويقترح أيضا لاختبار يعزل متعددة بعد تحول الخميرة مع ناقلات polyQ تجنب اختيار المكثفات عفوية تظهر سمية polyQ مخفضة. من المذكرة، W303 عادة ما تستخدم الخميرة السلالة26 كما أكثر حساسية للسمية polyQ من مشتقات S288C أخرى، مثل BY4741/BY474227، مما يسمح لمجموعة أوسع نطاقا من النمو تعمل. الأهم من ذلك، السلالات المستخدمة لهذا التحليل بحاجة إلى تحمل بروتين بريون Rnq1 نظراً لعدم عرض الخلايا Δ rnq1polyQ السمية والتراكم28. كما أن من المهم استخدام ثوابتex1 Htt تحمل العلامة العلم الأمينية الطرفية والتي تفتقر إلى المجال برولين الغنية. قد يغير اختلافات أخرى من تصميم الانصهار تعمل السامة15. أخيرا، تحريض تعبير الانصهار polyQ في اللبن التي تحتوي على وسائط الإعلام خطوة حاسمة ل البروتوكول21. عند نقل الخلايا من السكر إلى اللبن-التي تحتوي على وسائط الإعلام، من المهم أن تغسل الخلايا على الأقل ثلاث مرات بالماء المعقم للقضاء على كل أثر للسكر التي يمكن أن تسهم في قمع استحثاث مروج Gal129. استزراع الخلايا بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام اللبن للحث على التعبير عن الانصهار يمكن أن تفاقم النمط الظاهري السامة من الانصهار 72Q عند إجراء فحوصات اكتشاف، وتساعد على تمييز التغييرات في النمو عبر اندماج مختلف16.
الحصر، ولم تلاحظ الدراسات السابقة الآثار التفاضلية بين إصدار نونمونوميريك الحراجية المعتمدة (مشتق التجارة والنقل) ويمسفجفب16. وهكذا، على الأقل لمتغيرات التجارة والنقل، هذا الفحص قد لا تكون حساسة بما يكفي للتمييز بين المتغيرات أحادي وأوليجوميريك، وتسليط الضوء على الحاجة إلى استكمال polyQ فحوصات السمية مع غيرها من الأساليب القياسية، مثل الاعتداء عسر13 و تحليل الكيمياء الحيوية9،10،،من1112 التي يمكن تقييم مباشرة أوليجوميريزيشن. كما تجدر الإشارة إلى أن قوة حماية المنشآت يمكن أن تتصرف بشكل مختلف في الخميرة مقارنة بفحوصات في المختبر أو التعبير عنها في سائر الكائنات الحية23.
مجتمعة، هذه الأساليب تسمح للباحثين تميز الجديدة إطارا في الثانية بسرعة وقياس أثرها على شريكهم الانصهار. في المستقبل، سيتم تمكين هذا البروتوكول الفحص السريع لمشتقات جديدة من FPs سابقا يتسم تحديد طفرات التي تتصرف بشكل مشابه إلى متغيرات التجارة والنقل، التي لا تزال قياس معيار الذهب للصحفيين وتنظيم الأسرة. وبينما يركز هذا البروتوكول على البروتينات الفلورية، بسهولة يمكن تكييفها للشاشة لآثار أخرى بطاقات مرمزة وراثيا، مثل علامة مبكرة30 و31من سونتاج.
وفي الختام، يوفر هذا البروتوكول مقايسة سريعة وقابلة بسهولة لتمكين توصيف المزيد من الجيل الجديد في الثانية وأخرى علامات ترميز وراثيا لتوجيه البحوث في تصميم البروتين الانصهار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة يدعمه منحة تشغيلية من "المعاهد الكندية" "البحوث الصحية" M.L.D. ول الأعمال المعروضة هنا معتمد من قبل على جائزة "جون ر. إيفانز رئيس الصندوق" من "المؤسسة الكندية" للابتكار ومعتمد كتمويل من "صندوق البحوث أونتاريو" إلى Y.J. بدرجة ماجستير لمنحه الدكتوراه نقل من عميد كلية Schulich ل M اديسيني وطب الأسنان في جامعة أونتاريو الغربية. S.D.G. تدعمه "منحة الدكتوراه" من كندا المرض.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K.
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F.
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
