Summary
En høj overførselshastighed protokol for funktionel vurdering af HIV effektiv reaktivering og clearance af latent provirus er beskrevet og anvendt af teste effekten af interventioner på HIV transskription og splicing. Repræsentative resultater af effekt latenstid vende agenter på LTR-drevet transskription og splejsning leveres.
Abstract
HIV forbliver uhelbredelig på grund af eksistensen af et reservoir af celler, der havne stabil og latent form for virus, som forbliver usynlige for immunsystemet og er ikke ramt af den aktuelle antiretroviral behandling (vogn). Transskription og splejsning har vist at styrke HIV-1 ventetid i hvile CD4 + T-celler. Tilbageførsel af ventetid ved brug af latency tilbageførsel agenter (lokale) i den "chok og dræbe" tilgang er blevet undersøgt udførligt i et forsøg på at rense dette reservoir men har hidtil ikke vist nogen succes i kliniske forsøg på grund af manglende udvikling af passende små molekyler, der effektivt kan forurolige denne reservoir. Protokollen præsenteres her indeholder en metode til pålideligt og effektivt vurdere latency tilbageførsel agenter (lokale) på HIV transskription og splicing. Denne tilgang er baseret på brugen af en LTR-drevne dobbelt farve reporter, der samtidig kan måle effekten af en LRA på transskription og splejsning ved flowcytometri. Protokollen beskrevet her er tilstrækkelig for vedhængende celler og celler i suspension. Det er nyttige til at teste et stort antal stoffer i en høj overførselshastighed system. Metoden er teknisk simpelt at gennemføre og omkostningseffektive. Desuden brug af flowcytometri giver mulighed for vurdering af cellernes levedygtighed og således narkotika toksicitet på samme tid.
Introduction
Trods effektive langsigtede antiretroviral behandling fortsætter HIV i en latent tilstand som en integreret provirus i memory CD4 + T celler1. Kromatin struktur af HIV-1-5 "lang terminal repeat (LTR) promotor og epigenetiske ændringer såsom Histon methylering og deacetylation af DNA methyltransferases (DNMT) og Histon deacetyltransferase (HDAC) er vigtige mekanismer fører til transkriptionel undertrykkelse og dermed efter integration ventetid2,3. En lang række latency baglænskørsel agenter (lokale) er blevet undersøgt for deres effektivitet til at fremkalde virus produktion in vitro- og in vivo fra inficerede latent hvilende CD4 + T celler4,5,6,7 ,8. Blandt de lokale og regionale testet, dahldorte (HDAC-hæmmere) og BET bromodomain hæmmere (BETis) inducerer kromatin decondensation og udgivelse af positive transskription brudforlængelse factor b (P-TEFb) henholdsvis, fører til efterfølgende lindre af det transkriptionel undertrykkelse på 5' LTR og aktivering af HIV udtryk9,10,11,12,13. Omfanget af reaktivering opnåede af disse lokale og regionale myndigheders var imidlertid begrænset, som kun en beskeden stigning i celle-associerede unspliced HIV mRNA (os RNA), vejledende af viral transskription, blev observeret ex vivo14,15. Vigtigere, at disse lokale og regionale myndigheder heller ikke fremkalde en reduktion i hyppigheden af latent inficerede celler.
HIV udtryk kan være yderligere begrænset af ineffektive splejsning16 samt defekter i nuklear eksport af formere splejset HIV RNA (MS RNA)17. Således, identificere nye klasser af lokale og regionale myndigheder, der er mere potent og kan påvirke forskellige aspekter af virus produktion efter integration er nødvendig. Desuden er udviklingen af roman assays, der hjælpe med at definere de optimale forbindelser for at effektivt vende latency påkrævet.
Her præsenteres en protokol, der benytter en høj overførselshastighed tilgang til funktionel vurdering af effekten af interventioner på HIV LTR-drevet transskription og splicing. Kort sagt, en ny LTR-drevne dobbelt farve reporter system pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figur 1) bruges til at vurdere HIV reaktivering ved flowcytometri. I denne fluorescerende reporter fører udtryk for unspliced HIV mRNA (4 kb) til øget grøn fluorescerende proteiner (EGFP) udtryk, mens udtryk for splejset mRNA (2 kb) ville føre til Discosoma sp. rød (DsRed) fluorescerende proteiner udtryk. Kort, vi brugte en fluorescerende Env-EGFP fusion protein, gp140unc. EGFP, hvor den kodende sekvens af EGFP blev placeret i rammen med en un-kløvet og afkortede form af kuvert (Env). Ændringer blev indført til ablate kavalergang websted at undgå dissociation af Env gp120 og gp41-EGFP og afkorte gp160 protein før domænet transmembrane skaber en opløselig Env analog, som letter den korrekte foldning og udtryk for EGFP. Efter udtrykket i en celle, Rev lokaliserer til kernen hvor det medierer den nukleare-cytoplasmatisk eksport af 4 kb env mRNA via interaktion med rev lydhør element (RRE). Afkortning af Env kompromitterer ikke RRE, der ligger mellem gp120 og gp41 og A7 3' splejsning websted. I dette system, splejsning HIV-1 splejse donor 4 (SD4) og splejsning acceptor 7 (SA7) resulterer i produktionen af en 2 kb mRNA kodning en ikke-funktionel Rev protein afkortes efter aminosyre 38 sammenvokset til DsRed fluorescerende proteiner, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed var indsat 2nd exon af Rev på aminosyre 38 af overlapning udvidelse18. For at lette den nukleare eksport af unspliced mRNA, var et pattedyr udtryk vektor kodning Rev (pCMV-RevNL4.3) Co transfekteret med fluorescerende reporter konstruktion (figur 2). Denne unikke reporter konstruktion beskrevet her er nyttige i høj overførselshastighed vurdering af HIV transskription og splejsning, uden at skulle bruge virale vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Procedurer for kloning, transformation og sekventering er diskuteret andetsteds18,19. Protokoller heri begynder fra Transfektion af pattedyr udtryk vektorer (figur 3).
1. Transfektion af HEK293T celler med dobbelt farve journalist konstruere
- Dyrke HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS), (100 U/mL) penicillin og streptomycin (100 μg/mL) i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Efter optøning, passage HEK293T celler 2 - 3 gange før du bruger dem i Transfektion eksperimenter. Dette ville give celler tid til at tilbagesøge den optøningen procedure.
Forsigtighed: Mycoplasma forurening af cellekulturer er fortsat et alvorligt problem. God laboratoriepraksis og rutineundersøgelser af cellekulturer er afgørende for at mindske risikoen for mycoplasma forurening og undgå diffusion20. - Opdel celler 1:2 én dag før såning og overføre dem til friske DMEM medium. Dyrke celler i 24 timer i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Dagen før Transfektion, fjerne medium fra kolben ved aspiration og vaske cellerne med Dulbeccos phosphat bufferet saltvand (DPBS) løsning uden calcium (Ca2 +) og magnesium (Mg2 +) for at fjerne spor af serum.
- Afpipetteres 5 mL trypsin-EDTA-oploesning (0,05% - 10 mM i PBS) i kultur fartøj og placere den på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 2-5 min.
- Når cellerne er frakoblet, tilsættes 5 mL af DMEM suppleret med 10% (v/v) FBS til yderligere hæmme trypsin aktivitet, som kan skade cellerne.
- Resuspend forsigtigt af pipettering cellesuspension op og ned til at bryde op i klumper.
- Fortyndes 1:10 celler i trypan blå plet (0,4%).
- Tælle de levende celler, der ikke tager op trypan blå ved hjælp af et mikroskop (10 x mål) og en hæmocytometer.
- Beregne antallet af levedygtige celler pr. milliliter ved at tage gennemsnittet af celletal og multiplikation med 10.000 og af fortyndingsfaktoren (1:10) fra trypan blå plet.
- Plade 2 x 104 celler i 100 μl af DMEM medium suppleret med 10% FBS uden antibiotika i en 96-godt flad bund plade i 24 timer.
- Til hver brønd, fortyndes 400 ng af pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-RevNL4.3 og 100 ng af pCMV-Tat101AD8-Flag DNA i 50 μL serum gratis medium. Bland forsigtigt. Eksperimenter uden Tat, bruge en matchede Tom Tat vektor pcDNA3.1 (-).
Bemærk: Brugen af endotoxin-gratis DNA er stærkt anbefales. For at forberede endotoxin-gratis DNA ved hjælp af en midi- eller maxiprep-nukleinsyre rensning kit. Bestemme DNA renhed ved at måle 260/280 OD forhold, som bør være mellem 1,7 og 1.9. - Bland lipid reagens forsigtigt før brug, så Fortynd 0,65 μL i 50 μL serum gratis medium. Bland forsigtigt og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
- Kombiner den fortyndede DNA med fortyndet lipid reagens.
- Bland forsigtigt, og der inkuberes i 20 min. ved stuetemperatur. Løsningen kan forekomme uklar.
Bemærk: Fortsæt til trin 1,15. indenfor 30 min. - Der afpipetteres 100 μl pr. brønd af lipid reagens-DNA komplekser Dråbevist oven på cellerne.
- Bland forsigtigt af vuggende plade frem og tilbage.
-
Inkuber plade for 5 h i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Hver mastermix er tilstrækkelig for et enkelt godt (96-brønd) Transfektion. Justere mængden og omfanget af komponenter afhænger af antallet af narkotika og kombination, der ville være testet og tegner sig for pipettering variationer. Alle betingelser er normalt testet i tre.
- Transfect ekstra brønde med 100 ng af CMV-drevet EGFP og DsRed-Express DNA plasmid til kompensation formål.
2. behandling af transfekteret HEK293T celler med ventetid vende agenter
Bemærk: Forud for hver analyse, bestemme hver LRA fysiologiske tilstand ved at måle levedygtigheden af cellerne efter eksponering for høj og lav dosis af lægemidlet med celle spredning assay.
- Fortynd hver LRA til den relevante arbejdsgruppe koncentration med vækstmediet (f.eks., 1 μM for JQ1(+)).
Forsigtighed: Rekonstruere de frysetørrede narkotika med passende opløsningsmiddel til en koncentration på 10 mM. Gemme alle stock lokale og regionale myndigheder ved-80 ° C i en enkelt brug delprøve (5 μl) for at undgå gentagne frysning-optøning cyklusser. - Omhyggeligt Aspirér Transfektion medium med en multikanal og erstatte med 100 μL medium indeholdende relevante LRA (tabel 1). Tilføje medium meget forsigtigt sammen med mur af godt at undgå afmonterer de transfected HEK293T celler, som er kendt for at nemt løsne fra kultur plade overflade.
- Inkuber plade for 48 h i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
3. farvning af transfekteret celler med Fixable levedygtighed farvestof til Flow flowcytometri analyse
Forsigtighed: Fjerner døde celler og snavs er afgørende at eliminere falske positiver og at opnå resultater af højeste kvalitet.
- Frigør cellerne i medierne bruger 100 μL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) pr. brønd og forsigtigt pipettering up-and-down (~ 5 gange) med en multikanal, samtidig undgå skumdannelse i medierne. Hvis det er nødvendigt, frigøre celler fra pladen ved hjælp af 35 µL pr. brønd trypsin-EDTA-oploesning (0,05% - 10 mM i PBS) og inkubere 5 min ved 37 ° C, før neutralisere med medium indeholdende serum.
- Overfør celler til V-bundplade med 96 brønde.
- Spin celler i 5 min på 500 x g ved 4 ° C, så omhyggeligt Aspirér medium/PBS uden at røre cellerne.
- Cellerne vaskes mindst 1 gang med 200 μl af protein/serum gratis PBS.
- Centrifugeres 500 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten ved at vippe pladen og fjerne wash buffer uden at røre cellerne.
- Forberede en brugsopløsning fixable levedygtighed farvestof ved fortynding levedygtighed dye 1:1000 i protein/serum gratis PBS. Forberede 50 µL af de fortyndede pletten pr. brønd.
Bemærk: Levedygtighed farvestoffer findes i en række farver egnet til brug med blå, rød og violet lasere. Forbered en stamopløsning af fixable levedygtighed farvestof ved resuspending et hætteglas med frysetørret farvestoffet (komponent A) med 50 μL vandfri DMSO (del B). Opbevares ved-20 ° C i en enkelt brug alikvot (1 μL hver), beskyttet mod lys. - Tilsæt 50 μl af de fortyndede levedygtighed farvestof til hver brønd og bland cellerne af pipettering op og ned med en multikanal.
- Pletten for 10-15 min. ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Vask 1 - 2 gange med 150 μl af vaskebuffer (PBS med 1% bovint serumalbumin og 2 mM EDTA).
- Der centrifugeres 500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Fix cellerne med 100 μL af frisklavede 1% formaldehyd i wash buffer for 10-15 min. ved 4 ° C i mørke.
Forsigtighed: Formaldehyd er meget giftige. Forberede 1% formaldehyd løsning i et stinkskab at undgå indånding mens iført handsker og sikkerhedsbriller til beskyttelse. - Vaske cellerne 1 - 2 gange med 100 μL af wash buffer.
- Der centrifugeres 500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Resuspenderes celle i 70 μL af wash buffer.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her. Fast celler kunne opbevares ved 4 ° C i mørke for analyse den næste dag på flow-Flowcytometret.
4. EGFP og DsRed målinger ved flowcytometri og dataanalyse
Bemærk: Analysere HIV transskription (% EGFP) og splejsning (% DsRed) på et flow Flowcytometret. Filtrer prøve før løbetur med en 70 μm celle-si eller 100 μm nylon mesh til at undgå tilstopning af dysen.
- Opstart af Flowcytometret og computer mindst 10 min. inden brug at sikre lasere varme op.
- Før kører prøver og begyndende dataopsamling, fylde kappe tank med 0,9% saltvand løsning og sikre, at en natriumhypochlorit tablet er føjet til den affald tank.
- Kontrollere cellen flow for luftbobler.
- Kontroller, at detektorer og filtre er passende for eksperimentet.
Bemærk: For EGFP, brug af blå laser (488 nm) og 530/30 bandpass, mens DsRed Express er optimalt påvises ved hjælp af den gule laser (561 nm) og 610/20 bandpass. En blå laser (488 nm) og 610/20 bandpass kan også bruges til at registrere DsRed udtryk. - Kontrollere de forskellige ydeevne og følsomhed på tværs af detektorer ved at køre kalibrering perler.
- Justere Videresend (FSC-A) og side (SSC-A) scatter spændinger med unstained prøve, således at de vigtigste befolkning er på skærmen og tydeligt mærkbare.
Bemærk: FSC (Forward-spredt lys) er en måling af lyset diffraction i en flad vinkel, som afhænger af omfanget af cellen (celle areal eller størrelse), mens SSC (side-spredt lys) er en måling af lyset diffraction i en ret vinkel, som er proportional med Granulariteten for celle og interne kompleksitet. - Udføre manuel eller automatisk erstatning ved hjælp af single-farvede prøver at sikre minimal spillover af EGFP + befolkning til DsRed detektor og vice-versa.
Forsigtighed: Henblik på kompensation, bruge en stikprøve af celler, der udtrykker hver enkelt farve fluorescerende proteiner samt celler enkeltvis farves med fixable levedygtighed farvestof. Brug ikke FITC og PE kompensation perler til EGFP og DsRed fluorescerende proteiner kompensationer på grund af forskellige spectral karakteristik. Kompensation kontrol bør være lys nok til at løse positive og negative befolkning. - Oprette plots og indstille porte ved hjælp af fluorescens minus én (FMO) kontrol.
- Erhverve og optage mindst 10.000 levedygtige celle begivenheder pr. prøve. Køre prøver på middel eller lav hastighed for at undgå dubletter passerer gennem laser skæringspunkt. Bruge pulse geometri gating såsom SSC-A versus SSC-Hansen til at fjerne dubletter. Stabiliteten af drives af plotte tid versus SSC-A for at se, hvordan selv strømmen er under flugt.
- For enden af opstille ren flow flowcytometri fluidics med koncentrerede rengøringsmidler så vand i 5 min.
- Lukning af systemet, skille sig af med affaldet og genopfylde kappe tank efter erhvervelsen.
- Analysere data ved hjælp af en flow flowcytometri data analyse software. Udelukke celle debris og klump (dubletter) baseret på frem og side scatter, så fjerne de døde celler ved hjælp af levedygtighed farvestof pletter (negativ befolkning = levende celler). Identificere de celler, der udtrykker EGFP og DsRed (figur 4), samt procentdelen af splejset produkt DsRed /(DsRed + EGFP) (figur 5).
- Fastlægge effekten af LRA på HIV transskription og splejsning sammenligner ubehandlede celler og celler udsat for individet eller en kombination af lokale og regionale myndigheder (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater er vist i figur 5 for udtryk af HIV-1 unspliced (EGFP) og splejset (DsRed) produkterne efter behandling med bromodomain hæmmer JQ1. Både JQ1(+) og Tat betydeligt øget andelen af celler, der udtrykker EGFP (2.18 og 4.13 FC over DMSO henholdsvis; n = 3) vejledende af unspliced udskrifter. Desuden JQ1(+) markant øget andelen af celler, der udtrykker DsRed (46,6 FC over DMSO) samt andelen af splejset produkt (7.37 FC over DMSO) til et tilsvarende niveau som Tat (59.6 og 5.83 FC over DMSO, henholdsvis) bekræfter muligheden for JQ1(+) for at tænde HIV transskription og splicing. På den anden side afskaffer behandling med kontrolelementet stereoisomer JQ1(-) JQ1(+) effekt på HIV transskription og splejsning bekræfter succes i protokollen.
I en nylig publikation, har vi vist af RNA analyse en ophobning af HIV splejset afskrifter efter JQ1(+) behandling21. I virkeligheden, viste vores data konsekvente ændringer i niveauet af unspliced og splejset afskrifter, som blev spejlet ved EGFP og DsRed protein ekspression i denne model efter behandling med JQ1(+). Disse resultater viser, at EGFP og DsRed at udtrykke celler afspejler bromodomain hæmmer JQ1(+) evne til at fremkalde HIV transskription og splicing.
Sammenfattende er valideret vi brugen af pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reporter i en høj overførselshastighed set-up for vurdering af effekten af lokale og regionale myndigheder på HIV-1 transskription og splicing. Optimal mængde af LRA eller øget toksicitet kan føre til scud resultater. Optimere mængden af stof anvendes samtidig bevare cellernes levedygtighed kan forbedre nøjagtigheden af resultaterne.
Figur 1: skematisk model bruges til at fastslå virkningerne af latency vende agenter på LTR-drevet transskription og splicing. LTR konstruere udtrykker enten unspliced kuvert (Env) protein smeltet til forbedret grøn fluorescerende proteiner (EGFP) eller splejset Δ38rev protein med DsRed. Dette tal er blevet genoptrykt fra Khoury et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: konstruerer design. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed splejsning reporter giver udtryk for konvolut sammenvokset til EGFP (gp140-EGFP) og ikke-funktionelle Rev protein afkortes efter aminosyre 38 sammenvokset til DsRed fluorescerende proteiner (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 giver udtryk for Rev protein. (C) pCMV-Tat101AD8-Flag giver udtryk af Tat101(AD8) protein med en C-terminale flag-tag. Udtrykket plasmider er konstrueret ved hjælp af PCR overlapninger og begrænsning digest. Alle vektor kort blev oprettet ved hjælp af SnapGene software, version 4.1.9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Assay design for hurtig vurdering af HIV latency vende agenter. Den nuværende metode til vurdering af effekten af lokale og regionale myndigheder på HIV-1 transskription og splejsning omfatter i) såning af HEK293T celler en dag før ii) Transfektion med udtryk vektorer efterfulgt af iii) LRA behandling. IV) celler er analyseret af flow flowcytometri 48 timer efter behandling. Ved hjælp af denne protokol, kunne 32 (i tre eksemplarer) 96 betingelser testes pr. plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: repræsentativt eksempel på plade set-up og kontrol nødvendig. Kolonner 1 til 3 svarer til negative (-) kontrol med ingen narkotika og solvens kun (DMSO 1:5000) samt positive (+) styrer som Tat (100 ng), PMA/PHA = phorbol myristate acetat/phytohaemagglutinin (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 μM), VOR = () vorinostat 0,5 μM), og PAN = panobinostat (30 nM). Ukendt samarbejdstemaer er testet i tre eksemplarer over en række koncentrationer (15.625 til 1000 nM). Henblik på kompensation, celler, der udtrykker hver af ensfarvet fluorescerende proteiner (EGFP + og DsRed +) og celler farves med levedygtighed farvestof og unstained celler er inkluderet i hver analyseserie. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur 4: Gating strategi, der anvendes i analysen af handelsstrømmen flowcytometri. Det første skridt i strategiens gating er baseret på den frem og side scatter, som giver mulighed for at skelne mellem celler af interesse baseret på egenskaberne størrelse og granulering af disse celler. Det anbefales, at denne gating være så generøse som muligt at medtage alle begivenheder, mens du fjerner celleaffald og døde celler, der findes i nederste venstre hjørne af tæthed plot. Derefter fjerne dubletter fra datasættet ved hjælp af pulse geometri gating, SSC-A versus SSC-H, og yderligere smalle på levende celler ved hjælp af levedygtighed farvestof. Endelig bruges en dump kanal (violet) og EGFP eller DsRed til at definere celler af interesse. Brugen af fluorescens minus én (FMO) kontrolelementer er kritisk i definere befolkningens interesse og behandles spørgsmålet om afsmitning fra en anden fluorokrom i kanal af interesse. Efter erhvervelsen analyseres data ved hjælp af flow flowcytometri data analyse software. Dette tal er blevet genoptrykt i tilpasset form Khoury et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater af bromodomain hæmmere effekt på HIV transskription og splicing. (A) eksempler på to-parameter dobbelt farve fluorescens EGFP versus DsRed tæthed parceller fra untransfected celler (-Tat), celler transfekteret med 100 ng af pCMV-Tat101AD8-Flag (+ Tat) og celler behandles med DMSO, JQ1 (+) eller JQ1 (-). (B) gennemsnitlige procentdel (%) af celler, der udtrykker EGFP, DsRed eller splejset produkt (DsRed / DsRed + EGFP) fra 3 uafhængige forsøg er vist. Sammenligninger af hver tilstand til DMSO blev foretaget ved hjælp af 2-vejs ANOVA test. Kun er statistisk signifikant sammenligninger vist. p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001. De sorte linjer repræsenterer den mean±SEM. DMSO (1:5000), JQ1 (+) og JQ1(-) (1 μM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da er vanskeligheden at måle virus reaktivering ex vivo, inficerede en bred vifte af in vitro-modeller blev udviklet over tid for at studere HIV latency herunder latent T-celle-linjer (J-Lats, ACH2, U1), primære modeller af latent infektion i hvile) O'Doherty, Lewin, Greene og Spina modeller) eller pre-aktiveret CD4 + T-celler (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Kjeld modeller) med enkelt runde eller replikering kompetente reporter virus22. Til model de fysiologiske tilstande af HIV ventetid i hvile CD4 + T-celler, fulgte dobbelt fluorescerende reporter systemer som RGH (rød-grøn-HIV) reporter udviklet af Ivan Sadowski gruppe med en LTR-drevet Gag-eGFP markør og en CMV-drevet mCherry på plads Nef23. En lignende dobbelt farve reporter virus, Duo-Fluo, blev udviklet af E. Verdin laboratorium med LTR-drevet EGFP udtryk og en mCherry fluorescerende markør drevet af en EF1α promoter24. I dette system, blev EGFP indsat i 3'-slutningen af provirus i stedet for Nef. Sletning i kuvert i begge disse systemer forhindrer flere runder af infektioner. Derudover kombination af de to fluorescerende proteiner tillader detektering af produktivt (eGFP + mCherry +) og latent (eGFP - mCherry +) inficerede celler. Men flere mangler af dobbelt farve reporter virus var mærkbar i CD4 + T-celler som direkte infektion af latent inficerede celler er i høj grad afhængig af den cellulære aktiveringstilstand for T-celler23,24. I virkeligheden, meget lave udnyttelsesgrad af infektion blev observeret ved hjælp af disse to reporter vira i hvile CD4 + T-celler: 0,1% for RGH23 og 0,2% for DuoFluo25. Derudover som CMV promotor har vist sig at være udtrykt på lavere niveauer i ingen-aktiveret celler26,27,28, en inaktiv CMV eller EF1α promotor ville føre til undervurdering af den latent inficerede populationer.
Vi har genereret og karakteriseret en ny HIV reporter vektor for at studere etableringen af ventetid og virus reaktivering i en høj overførselshastighed assay. Flere fordele til vores screeningsmetode omfatter i) omkostningseffektivitet med evnen til at vurdere transskription og splejsning samtidigt, ii) mulighed for at teste et stort antal stoffer eller kombinationer i en enkelt eksperiment, iii) hurtig vurdering af den effekten af lokale og regionale myndigheder ved flowcytometri (30-45 min typiske Læs tid til 96 godt plade uafhængig af antallet af fluorescerende parametre), iv) højt dynamikområde, v) egnet til automatiseret høj overførselshastighed Transfektion og flowcytometri ved hjælp af robotarme og HTS platform, Vi) hurtig hærdning af data ved hjælp af en flow flowcytometri arbejdsområdeskabelonen, vii) optimal for suspension og vedhængende celler, viii) enkelhed af model og tilpasningsevne til luminescence og plade læser målinger (dual luciferase Firefly og Renilla) og ix) skalerbarhed (96 - og 384-godt pate formater).
En LRA eller en kombination af lokale og regionale myndigheders tilbøjelighed til at aktivere HIV LTR-drevet transskription og splejsning således EGFP og DsRed fluorescerende proteiner udtryk kunne undersøges ved flowcytometri ved hjælp af vores HIV splejsning reporter. Men før testning synergien af roman lokale og regionale myndigheder, er det stærkt anbefales at fastlægge de fysiologiske betingelser for hver LRA ved at måle levedygtigheden af cellerne efter udsættelse for en række koncentrationer af enkelt drug. Derfor, herunder en markør for levende og døde celler er vigtigt at eliminere falske positiver og at opnå resultater af højeste kvalitet. Et andet vigtigt aspekt af analysen af handelsstrømmen flowcytometri er erstatning kontrolelementer eller FMO. Det anbefales at bruge enkeltvis farves prøver at sikre minimal spillover af EGFP + befolkning ind i DsRed og omvendt. Derudover er det vigtigt at hensyn til autofluorescence af celler af herunder unstained celler. Endelig, en regelmæssig kontrol af forskellige ydelse og følsomhed på tværs af detektorerne, der er kritiske for det meste når måling af prøver til en undersøgelse, der spænder over en lang periode.
Selv om ikke diskuteret i afsnittet protokol, er der flere begrænsninger i vores splejsning reporter system. For en mere grundig diskussion, se venligst vores tidligere publikation (Khoury et al., 2018). Eksport af den delvist eller unspliced varianter af HIV mRNA er lettet af den virale proteiner Rev og sin forening med Rev lydhør Element (RRE) i disse mRNA arter29,30,31,32. Overekspression af Rev i vores system, tilladt os at omgå den store blok af nukleare fastholdelse af formere splejset og unspliced mRNAs observeret i latent inficerede T celler17 og fokus på forståelse af hvordan de lokale og regionale fremkalde transskription og splejsning dermed virus reaktivering. Hertil kommer, at vores system kræver Transfektion af 3 plasmider, valgte vi HEK293T celler fordi høje Transfektion effektiviteten af disse celler. På grund af de forskellige tidsmæssige og rumlige tilgængeligheden af cellulære faktorer i T-celler i forhold til en cancer cellelinie, er det vigtigt at validere resultaterne af splejsning reporter erhvervet i HEK293T celler i T-celle linier og primærelementer, som kan give store tekniske udfordringer på grund af deres begrænsede transfectability. Derfor brugen af alternative DNA levering reagenser til Transfektion som DMRIE-C, som har vist sig at være særdeles effektiv for Transfektion af suspension celler (f.eks. Jurkat) eller nucleofection metoder såsom Amaxa nucleofector eller Neon Transfektion system, der har vist sig for at fremme effektiv og pålidelig levering af én eller flere plasmider til svært at transfect celler herunder primære CD4 + T-celler. Alternativt, det ville være interessant at afprøve denne reporter system i forbindelse med fuld længde virus i en primær celle model af ventetid ved hjælp af de førnævnte Transfektion metoder. I virkeligheden, kan forskellene i udbuddet af vært transskription, strækforlængelse og splejsning faktorer i et rCD4 + T celle påvirke en LRA kapacitet til at genaktivere den latente provirus. Vores model behandler endelig ikke om LRA kan påvirke transskription og splejsning af tilskuer celler, og om det kan fremkalde replikering kompetente virus. Dog ville vi formoder, at ved at måle en stigning i celle-associerede HIV U.S. og MS RNA, dette ville føre til produktion af replikering kompetente virus i cellekultur supernatant. Dette kan bekræftes ved at gennemføre gold standard kvantitative virus udvækst assay (QVOA)33.
På grund af den komplekse karakter af ventetid og sikre effektiv virus reaktivering, kan en mangefacetteret kombinatorisk strategi være påkrævet34. Potentielle behandling skal stimulere flere veje herunder transskription og splejsning, som har tidligere vist sig at spille afgørende rolle i etableringen af latency16,35,36, 37. vores LTR-drevet splejsning reporter ville tillade en high throughput screening af lægemidler, der optimalt kan målrette både trin, transskription og splejsning, øge chancen for at finde molekyler, der kan synergieffekter effektivt, hvilket ville føre til en lavere dosisniveauer og dermed giftigheden af hver enkelt drug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af project grant APP1129320 og programmet grant APP1052979 fra NHMRC i Australien. Vi takke Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson og Michelle Y. Lee for at give væsentlige konstruktioner og rådgivning til den vellykkede afslutning af dette arbejde. Vi takker også DMI Flow facilitet personale for deres rådgivning og generøse assistance opretholde strømmen Flowcytometret anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
