Summary
En høy gjennomstrømning protokoll for funksjonell vurdering av HIV effektiv reaktivering og rydding av latente proviruses er beskrevet og ved å teste effekten av intervensjoner på HIV transkripsjon og skjøting. Representant resultatene av effekten av ventetid snu agenter på LTR-drevet transkripsjon og skjøting tilbys.
Abstract
HIV er uhelbredelig på grunn av eksistensen av et reservoar av celler som havner stabil og latent form av viruset, som forblir usynlig for immunsystemet og ikke er målrettet etter gjeldende antiretroviral terapi (handlevogn). Transkripsjon og skjøting har vist å forsterke HIV-1 ventetid hviler CD4 + T celler. Reversering av ventetid ved bruk av ventetid reversering agenter (LRAs) i "sjokk og drepe" tilnærming har vært studert i et forsøk på å tømme dette reservoar, men så langt ikke har vist noen suksess i kliniske forsøk på grunn av mangel på utvikling av tilstrekkelig små molekyler som kan effektivt forurolige dette reservoar. Protokollen presenteres her gir en metode for pålitelig og effektivt vurdere ventetid reversering agenter (LRAs) på HIV transkripsjon og skjøting. Denne tilnærmingen er basert på bruk av en LTR-drevet to farger reporter som samtidig kan måle effekten av en LRA på transkripsjon og skjøting av flowcytometri. Protokollen beskrevet her er tilstrekkelig for tilhenger celler som cellene i suspensjon. Det er nyttig for testing en rekke narkotika i en høy gjennomstrømning system. Metoden er teknisk enkel å implementere og kostnadseffektiv. Dessuten, bruk av flowcytometri kan vurdering av cellen levedyktighet og dermed drug giftighet samtidig.
Introduction
Til tross for effektiv langsiktige antiretroviral terapi vedvarer HIV i en latent tilstand som et integrert provirus i minnet CD4 + T celler1. Chromatin strukturen i HIV-1-5 "lenge terminal gjenta (VTH) arrangøren og epigenetic endringer som histone metylering og deacetylation av DNA methyltransferases (DNMT) og histone deacetylases (HDAC) er viktige mekanismer fører til transcriptional undertrykkelse og dermed post integrasjon ventetid2,3. En rekke ventetid snu agenter (LRAs) har blitt undersøkt for sin virkning å indusere virus produksjon i vitro og i vivo fra infisert latently hvile CD4 + T celler4,5,6,7 ,8. Blant LRAs testet, HDACi (HDAC hemmere) og BET bromodomain hemmere (BETis) indusere chromatin decondensation og utgivelsen av positiv transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) henholdsvis, fører til etterfølgende avlaste av den transcriptional undertrykkelse på den 5' LTR og aktivering av HIV uttrykk9,10,11,12,13. Omfanget av aktivering av disse LRAs ble imidlertid begrenset bare en beskjeden økning i celle-assosiert unspliced HIV mRNA (oss RNA), indikativ viral transkripsjon, ble observert ex vivo14,15. Viktigere, kunne disse LRAs også føre til en reduksjon i frekvensen av latently infiserte celler.
HIV uttrykk, begrenses ytterligere av ineffektiv skjøting16 som mangler i kjernefysiske eksport multiplisere skjøtes HIV RNA (MS RNA)17. Dermed er identifisere nye klasser av LRAs som er sterkere og kan påvirke forskjellige aspekter av viruset produksjon etter integrering nødvendig. I tillegg er utviklingen av romanen analyser som definerer den optimale forbindelser for å effektivt reversere ventetid nødvendig.
Her, er en protokoll presentert, som utnytter en høy gjennomstrømming tilnærming for funksjonell vurdering av virkningen av tiltakene på HIV LTR-drevet transkripsjon og skjøting. I korte trekk, en ny LTR-drevet dobbelt farge reporter systemet pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figur 1) brukes til å vurdere HIV reaktivering av flowcytometri. I dette fluorescerende reporter fører uttrykk for unspliced HIV mRNA (4 kb) til forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) uttrykk, mens uttrykk for skjøtes mRNA (2 kb) vil føre til Discosoma sp. rød (DsRed) fluorescerende protein uttrykk. Kort, vi brukte en fluorescerende Env-EGFP fusion protein, gp140unc. EGFP, der koding sekvensen av EGFP ble plassert i rammen med en un cleaved og avkortede form av konvolutten (Env). Endringene ble innført ablate cleavage området hindrer dissosiasjon av konv i gp120 og gp41-EGFP og avkorte gp160 protein før transmembrane domenet oppretter en løselig konv analog, som letter den riktige folding og uttrykk for EGFP. På uttrykket i en celle, Rev regionaliserer til kjernen der det formidler kjernefysiske-cytoplasmatiske eksport av 4 kb konv mRNA via samspill med rev forståelsesfull elementet (RRE). Trunkering av konv kompromiss ikke RRE, som ligger mellom gp120 og gp41, og det A7 3 skjøte området. I dette systemet, skjøting på HIV-1 skjøte donor 4 (SD4) og spleise acceptor 7 (SA7) resulterer i produksjon av en 2 kb mRNA koding en ikke-fungerende Rev protein avkortet på aminosyre 38 smeltet DsRed fluorescerende protein, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed ble satt inn i 2nd ekson av Rev på aminosyre 38 av overlapping forlengelsen18. For å lette kjernefysiske eksport av unspliced mRNA, en pattedyr uttrykk vektor koding Rev (pCMV-RevNL4.3) var co transfekterte med fluorescerende reporter konstruere (figur 2). Denne unike reporter konstruere beskrevet her er nyttig i høy gjennomstrømming vurdering av HIV transkripsjon og skjøting, uten å måtte bruke viral vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Prosedyrer for kloning, transformasjon og sekvensering er nevnt18,19. Protokollene her begynner fra transfection av pattedyr uttrykk vektorer (Figur 3).
1. hva HEK293T celler med to farger Reporter konstruere
- Dyrke HEK293T celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL) i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C. Etter tining, passasje HEK293T celler 2 - 3 ganger før du bruker dem i transfection eksperimenter. Dette vil gi celler tid til å gjenopprette fra tiner prosedyren.
Forsiktig: Mycoplasma forurensning av cellekulturer forblir en alvorlig problem. God laboratoriepraksis og rutinemessig testing av cellekulturer er avgjørende for å redusere risikoen for mycoplasma forurensning og unngå spredning20. - Dele cellene 1:2 en dag før såing og overføre dem til frisk DMEM medium. Dyrke celler for 24 timer i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Dagen før transfection, fjerne mediet fra flasken av aspirasjon og vask cellene med Dulbeccos fosfat bufret (DPBS) saltvann gratis kalsium (Ca2 +) og magnesium (Mg2 +) for å fjerne spor av serum.
- Dispensere 5 mL av trypsin-EDTA løsning (0,05% - 10 mM PBS) til kultur fartøyet og sted den på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 2 til 5 min.
- Når cellene er enebolig, legge 5 mL av DMEM med 10% (v/v) FBS å ytterligere hemme trypsin aktiviteten som kan skade cellene.
- Resuspend forsiktig av pipettering celle suspensjon opp og ned for å bryte opp klumper.
- Fortynne celler 1:10 i trypan blå flekker (0,4%).
- Telle levende celler som ikke tar opp trypan blå med et mikroskop (10 x mål) og en haemocytometer.
- Beregne antall levedyktig celler per milliliter ved å ta gjennomsnittet av celletall og multiplisere det med 10.000 og av fortynningsfaktoren (1:10) fra trypan blå flekken.
- Plate 2 x 104 celler i 100 μL DMEM medium med 10% FBS uten antibiotika i en 96-brønns flat bunn plate for 24 timer.
- For hver brønn, fortynne 400 ng av pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-RevNL4.3 og 100 ng av pCMV-Tat101AD8-flagg DNA i 50 μL av serum fri medium. Bland forsiktig. Eksperimenter uten Tat, bruke en samsvarende tom Tat vektor pcDNA3.1 (-).
Merk: Bruk av endotoxin-gratis DNA anbefales. For at forberede endotoxin-gratis DNA ved hjelp av en midi eller maxiprep nukleinsyre rensing kit. Bestemme DNA renheten ved å måle 260/280 OD forholdet, som bør være mellom 1,7 og 1,9. - Bland lipid reagensen forsiktig før bruk, deretter fortynne 0,65 μL i 50 μL av serum fri medium. Bland forsiktig og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kombiner utvannet DNA med fortynnet lipid reagensen.
- Bland forsiktig og ruge for 20 min ved romtemperatur. Det kan hende at løsningen skyet.
Merk: Fortsett til trinn 1.15. innen 30 minutter. - Dispensere 100 μL per brønn av lipid reagens-DNA komplekser drop-wise øverst i celler.
- Bland forsiktig av rocking platen frem og tilbake.
-
Inkuber platen i 5 h i en 5% CO2 fuktet inkubator på 37 ° C.
- Hver reaksjonen blanding er tilstrekkelig for en enkelt brønn (96-brønnen) hva. Justere mengden og antall komponenter av antall narkotika og kombinasjoner som skal testes og kontoer for pipettering variasjoner. Alle betingelser er vanligvis testet i triplicates.
- Transfect flere brønner med 100 ng av CMV-drevet EGFP og DsRed-Express DNA plasmider for kompensasjon formål.
2. behandling av transfekterte HEK293T celler med ventetid reversere agenter
Merk: Før hver analysen, bestemme fysiologiske tilstanden til hver LRA ved å måle levedyktigheten til cellene etter eksponering for høy og lav dose av stoffet med celle spredning analysen.
- Fortynn hver LRA til riktig arbeider konsentrasjonen med vekst medium (f.eks, 1 μM for JQ1(+)).
Forsiktig: Rekonstituer lyofilisert narkotika med den aktuelle løsningsmiddel til en konsentrasjon av 10 mM. Lagre alle lager LRAs ved-80 ° C i en voksen aliquot (5 μL hver) for å unngå gjentatt frysing-tining sykluser. - Nøye Sug opp hva medium med en og erstatte med 100 μL medium som inneholder riktige LRA (tabell 1). Legge til middels svært forsiktig langs veggen av godt for å unngå koble transfekterte HEK293T cellene, som er kjent for å enkelt koble fra kultur plate overflaten.
- Inkuber platen i 48 timer i en 5% CO2 fuktet inkubator på 37 ° C.
3. farging av transfekterte celler med Fixable levedyktighet fargestoff for flyt cytometri analyse
Forsiktig: Fjerner døde celler og rusk er viktig å eliminere falske positiver og få resultater av høyeste kvalitet.
- Koble cellene i media bruker 100 μL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) per brønn og forsiktig pipettering opp (~ 5 ganger) med en flerkanals, mens du unngår skumming av media. Hvis nødvendig, koble cellene fra platen med 35 µL per godt trypsin-EDTA løsning (0,05% - 10 mM PBS) og rugende 5 min på 37 ° C, før nøytralisere med medium som inneholder serum.
- Overføre cellene til en 96-brønns V-bunnplaten.
- Spin celler for 5 min på 500 x g på 4 ° C, så nøye Sug opp medium/PBS uten å berøre cellene.
- Vask cellene minst 1 time med 200 μL av protein/serum gratis PBS.
- Sentrifuge på 500 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting av vippe plate og fjerner vaskebuffer uten å berøre cellene.
- Forberede en fungerende løsning fixable levedyktighet fargestoff fortynne levedyktighet fargestoff 1:1000 i protein/serum gratis PBS. Forberede 50 µL utvannet flekken per brønn.
Merk: Levedyktighet fargestoffer er tilgjengelige i en rekke farger som er egnet for bruk med blått, rødt og fiolett lasere. Forbered en lagerløsning fixable levedyktighet fargestoff ved resuspending en flaske av lyofilisert fargestoffet (komponent A) med 50 μL vannfri DMSO (komponent B). Butikken på 20 ° C i en enkelt bruk aliquot (1 μL hver), beskyttet mot lyset. - Legg 50 μL av utvannet levedyktighet fargestoffet hver brønn og bland cellene av pipettering opp og ned med en flerkanals.
- Flekk i 10-15 minutter på 4 ° C, beskyttet mot lyset.
- Vask 1 - 2 ganger med 150 μL av vaskebuffer (PBS med 1% bovin serum albumin og 2 mM EDTA).
- Sentrifuger på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Fastsette cellene med 100 μL nylagde 1% formaldehyd i vaskebuffer for 10-15 minutter til 4 ° C i mørket.
Forsiktig: Formaldehyd er svært giftig. Forberede 1% formaldehyd løsning i avtrekksvifte å unngå innånding mens iført vernehansker og vernebriller for beskyttelse. - Vask cellene 1 - 2 ganger med 100 μL vaskebuffer.
- Sentrifuger på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 70 μL vaskebuffer.
Merk: Protokollen kan pauses her. Fast celler kan lagres på 4 ° C i mørket analyse neste dag på flyt-cytometer.
4. EGFP og DsRed målinger av flowcytometri og dataanalyse
Merk: Analysere HIV transkripsjon (% EGFP) og skjøting (% DsRed) på en flyt cytometer. Filtrere prøven før flukt med en 70 μm celle-sil eller 100 μm nylon maske å unngå tilstopping munnstykket.
- Starte opp cytometer og maskinen minst 10 min før bruk å sikre lasere varme opp.
- Før du kjører prøver og begynner datainnsamling, fyll på slire med 0,9% saltvann og sikre at en natriumhypokloritt tavle legges til avfall tanken.
- Kontrollere flyt cellen for luftbobler.
- Kontroller at detektorer og filtre er passende for eksperimentet.
Merk: For EGFP, bruk av blå laser (488 nm) og 530/30 båndpassfilter, mens DsRed Express oppdages optimalt ved hjelp av den gule laseren (561 nm) og 610/20 båndpassfilter. En blå laser (488 nm) og 610/20 Båndpassdesign kan også brukes til å oppdage DsRed uttrykk. - Kontroller cytometer ytelse og følsomhet over detektorer ved å kjøre kalibrering perler.
- Justere Videresend (FSC-A) og siden (SSC-A) XY spenninger med unstained kvinne eksempel slik at den største befolkningen er på skjermen og klart synlig.
Merk: FSC (fremover-spredt lys) er en måling av lys Diffraksjon i en flat vinkel, som avhenger av cellen (celle areal eller størrelse), mens SSC (side-spredt lys) er en måling av lys Diffraksjon i rett vinkel, som er proporsjonal med cellen detaljnivå og interne kompleksitet. - Utføre manuell eller automatisk erstatning ved hjelp av single-farget prøvene sikrer minimal ekstra EGFP + befolkningen i DsRed detektor og omvendt.
Forsiktig: Kompensasjon formål, bruke celler uttrykke hver enkelt farge fluorescerende protein samt celler enkeltvis beiset med fixable levedyktighet fargestoff. Ikke bruk FITC og PE kompensasjon perler for EGFP og DsRed fluorescerende proteiner kompensasjoner på grunn av ulike spektrale egenskapene. Kompensasjon kontroller skal være lys nok til å løse positive og negative befolkningen. - Opprett tomter og angi porter med fluorescens minus én (FMO)-kontroller.
- Kjøpe og registrere minst 10.000 levedyktig celle hendelser per prøve. Kjøre prøver på middels eller lav hastighet for å unngå doublets passerer gjennom laser skjæringspunktet. Bruke puls geometri gating som SSC-A versus SSC-H å fjerne doublets. Sjekke stabiliteten av kjøringen ved å plotte tid versus SSC-A for å se hvordan flyten er under kjøringen.
- På slutten av kjøringen, ren flyt cytometri fluidics med konsentrert rengjøringsmidler og vann for 5 min.
- Slå av systemet, kaste avfall og fylle tanken skjede etter oppkjøpet.
- Analysere dataene ved å bruke en flyt cytometri dataanalyse programvare. Utelate celle rusk og klumpen (doublets) basert på fremover og side scatter, så fjerne de døde cellene med levedyktighet fargestoff flekken (negativ befolkningen = lever celler). Identifisere celler som uttrykker EGFP og DsRed (Figur 4), samt prosenten av skjøtes produkt DsRed /(DsRed + EGFP) (figur 5).
- Fastslå effekten av LRA på HIV transkripsjon og skjøting ved å sammenligne ubehandlet celler og celler som er utsatt for enkeltpersoner eller en kombinasjon av LRAs (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultater er vist i figur 5 for uttrykket av HIV-1 unspliced (EGFP) og skjøtes (DsRed) produktene etter behandling med bromodomain hemmer JQ1. Både JQ1(+) og Tat betydelig økt andelen celler uttrykke EGFP (2,18 og 4.13 FC over DMSO henholdsvis; n = 3) om unspliced utskrifter. Videre JQ1(+) betydelig økt andelen celler uttrykke DsRed (46,6 FC over DMSO) og andelen skjøtes produktet (7.37 FC over DMSO) nivå som Tat (59.6 og 5.83 FC over DMSO henholdsvis) bekrefter muligheten for JQ1(+) aktivere HIV transkripsjon og skjøting. På den annen side, opphever behandling med kontrollen stereoisomer JQ1(-) JQ1(+) effekt på HIV transkripsjon og skjøting bekrefter suksessen av protokollen.
I en fersk publikasjon, har vi vist av RNA analyse en opphopning av HIV skjøtes transkripsjoner etter JQ1(+) behandling21. Faktisk viser våre data konsekvent endringer i nivåer av unspliced og skjøtes utskrifter som var motsatt av den EGFP og DsRed protein uttrykket i denne modellen etter behandling med JQ1(+). Disse resultatene indikerer at EGFP og DsRed uttrykke celler gjenspeiler den bromodomain inhibitor JQ1(+) evnen til å indusere HIV transkripsjon og skjøting.
Oppsummert validert vi bruk av pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reporter i en høy gjennomstrømming oppsett for vurdering av effekten av LRAs på HIV-1 transkripsjon og skjøting. Sub-optimale mengden LRA eller økt toksisitet kan føre til scud resultater. Optimalisere mengden av stoffet som brukes samtidig bevare celle levedyktighet kan forbedre nøyaktigheten av resultatene.
Figur 1: skjematisk av modellen brukes til å fastslå effekten av ventetid snu agenter på LTR-drevet transkripsjon og skjøting. LTR konstruere uttrykker enten unspliced konvolutt (Env) protein del forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) eller skjøtes Δ38rev protein med DsRed. Dette tallet har blitt reprinted fra Khoury et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: konstruksjoner design. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed skjøting reporter gir uttrykk for konvolutten smeltet EGFP (gp140-EGFP) og ikke-fungerende Rev protein avkortet på aminosyre 38 smeltet DsRed fluorescerende protein (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 gir uttrykk for Rev protein. (C) pCMV-Tat101AD8-flagget kan uttrykket Tat101(AD8) protein med en C-terminalen flagg-tag. Uttrykket plasmider er konstruert bruker PCR overlappinger og begrensning digest. Alle vektor-kart ble opprettet med SnapGene software, versjon 4.1.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analysen design for rask vurdering av HIV ventetid reversere agenter. Det aktuelle metoden for vurdering av effekten av LRAs på HIV-1 transkripsjon og skjøting inkluderer i) såing av HEK293T celler én dag før ii) hva med uttrykk vektorer etterfulgt av iii) LRA behandling. IV) celler analyseres av flyt cytometri 48 timer etter behandling. Bruker denne protokollen, kan 32 (i tre eksemplarer) 96 forhold testes per plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: representativt eksempel på plate oppsett og kontroller nødvendig. Kolonner 1 til 3 tilsvarer negative (-) kontroller med ingen narkotika og løsemiddel bare (DMSO 1:5000) samt positive (+)-kontroller som Tat (100 ng), PMA/PHA = phorbol myristate acetate/phytohaemagglutinin (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 μM), VOR = vorinostat ( 0,5 μM), og = panobinostat (30 nM). Ukjent LRAs testes i tre eksemplarer over en rekke konsentrasjoner (15.625 til 1000 nM). For kompensasjon formål, celler som uttrykker hver av én farge fluorescerende protein (EGFP + og DsRed +) og cellene beiset med levedyktighet fargestoff og unstained kvinne celler er inkludert i hver kjøring. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur 4: Gating strategi som brukes i flyt cytometri analysen. Det første trinnet i gating strategien er basert på fremover og side scatter, som lar æren av cellene på rente basert på størrelse og detaljnivå egenskapene til disse cellene. Det anbefales at denne gating være så generøs som mulig å inkludere alle hendelser samtidig fjerne mobilnettet rusk og døde celler, som finnes nederst i venstre hjørne av tetthet tomten. Så fjerne doublets fra datasett med puls geometrien gating SSC-A versus SSC-H og flere smale på live cellene med levedyktighet fargestoff. Endelig brukes en dump kanal (fiolett) og EGFP eller DsRed til å definere celler av interesse. Bruk av fluorescens minus én (FMO) kontroller er kritiske definere befolkningen rundt og ta opp spørsmål om smitteeffekter fra en annen fluorochrome i kanalen rundt. Etter oppkjøpet analyseres data med strømmen cytometri dataanalyse programvare. Dette tallet har blitt gjengitt i tilpasset form Khoury et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant resultatene av effekten av bromodomain hemmere på HIV transkripsjon og skjøting. (A) eksempler på to-parameteren dual farge fluorescens EGFP versus DsRed tetthet tomter fra untransfected celler (-Tat), celler transfekterte med 100 ng av pCMV-Tat101AD8-flagget (+ Tat) og cellene behandlet med DMSO, JQ1 (+) eller JQ1 (-). (B) gjennomsnittet prosent (%) av celler som uttrykker EGFP, DsRed eller skjøtes produkt (DsRed / DsRed + EGFP) fra 3 uavhengige eksperimenter vises. Sammenligninger av hver tilstand å DMSO ble gjort ved hjelp av 2-veis VARIANSANALYSE testen. Bare vises statistisk signifikant sammenligninger. p < 0,05; p < 0.01; p < 0,001. Den svarte linjen representerer de mean±SEM. DMSO (1:5000), JQ1 (+) og JQ1(-) (1 μM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitt vanskeligheten i å måle virus reaktivering ex vivo, infisert en lang rekke i vitro modeller ble utviklet over tid for å studere HIV ventetid inkludert latently T celle-linjer (J Lats, ACH2, U1), primære modeller av latent infeksjon av hvile) O'Doherty, Lewin, Greene og Spina modeller) eller pre-aktivert CD4 + T celler (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modeller) med enkelt kompetent reporter virus22-med runde eller replikering. For å modellere fysiologiske betingelsene for HIV ventetid hviler CD4 + T celler, fulgte to fluorescerende reporter systemer som RGH (rød-grønn-HIV) reporteren utviklet av Ivan Sadowski gruppe med en LTR-drevet Gag-eGFP markør og en CMV-drevet mCherry på plass Nef23. En lignende to farger reporter virus, Duo-Fluo, ble utviklet av E. Verdin laboratorium med uttrykk LTR-drevet EGFP og en mCherry fluorescerende markør drevet av en EF1α selskapet24. I dette systemet, EGFP ble satt inn etter 3 provirus i stedet for Nef. Sletting i konvolutten i begge disse systemene hindrer flere runder av infeksjoner. Videre er kombinasjonen av to fluorescerende proteiner gjør påvisning av produktivt (eGFP + mCherry +) og latently (eGFP - mCherry +) infiserte celler. Men var flere svakhetene i to farger reporter virus merkbar i CD4 + T celler som direkte infeksjon av latently infiserte celler er i stor grad avhengig av mobilnettet aktiveringsstatusen for T-celler23,24. Faktisk svært lav rente infeksjon ble observert med disse to reporter virus i hvile CD4 + T celler: 0,1% for RGH23 og 0,2% for DuoFluo25. I tillegg som CMV arrangøren har vist seg å bli uttrykt på lavere nivåer i ingen-aktivert celler26,27,28, en inaktiv CMV eller EF1α selskapet ville føre til undervurdering av den latently infiserte bestander.
Vi har generert og preget en ny HIV reporter vektor for å studere etableringen av ventetid og virus reaktivering i en høy gjennomstrømning analysen. Flere fordeler til våre screening metode inkluderer i) kostnadseffektivitet muligheten til å vurdere transkripsjon og skjøting samtidig ii) muligheten til å teste en rekke stoffer eller kombinasjoner i et enkelt eksperiment, iii) rask vurdering av den effekten av LRAs av flowcytometri (30-45 min typiske Les tid for 96 godt plate uavhengig av antall fluorescerende parametere), iv) høy dynamisk område, v) egnet for automatisert høy gjennomstrømning transfection og flowcytometri med roboten armene og HTS-plattformen, Vi) rask herding av data ved hjelp av en flyt cytometri arbeidsområdemal, vii) optimale for suspensjon og tilhenger celler, viii) enkelhet av modellen og tilpasning til luminescence og plate leser målinger (dual luciferase Firefly og Renilla) og ix) skalerbarhet (96 - og 384-godt hode formater).
Tilbøyelighet til en LRA eller en kombinasjon av LRAs å aktivere HIV LTR-drevet transkripsjon og skjøting dermed EGFP og DsRed fluorescerende proteiner uttrykk kan undersøkes av flowcytometri ved hjelp av vår HIV skjøting reporter. Men før testing synergien av Roman LRAs, anbefales det å avgjøre de fysiologiske forholdene av hver LRA ved å måle levedyktigheten til cellene etter eksponering for en rekke konsentrasjoner av enkelt stoffet. Inkludert en markør av levende og døde celler er derfor viktig å eliminere falske positiver og få resultater av høyeste kvalitet. En annen viktig del av flyt cytometri analyse er kompensasjon kontroller eller FMO. Det anbefales å bruke enkeltvis farget eksempler sikrer minimal ekstra EGFP + befolkningen i DsRed og omvendt. Videre er det viktig å konto for autofluorescence i cellene ved å inkludere unstained kvinne celler. Endelig, en vanlig kontroll av cytometer ytelse og følsomhet over detektorer er kritisk hovedsakelig ved måling prøver for en studie som spenner over en lang periode.
Selv om ikke diskutert i delen protokollen, finnes det flere begrensninger for skjøting reporter systemet. For en mer grundig diskusjon, vennligst se vår tidligere publikasjon (Khoury et al., 2018). Eksport av den delvis eller unspliced varianter av HIV mRNA er tilrettelagt av viral protein Rev og dens forbindelse med Rev Responsive Element (RRE) i disse mRNA arter29,30,31,32. Overuttrykte Rev i systemet tillot oss å omgå store blokken av kjernefysiske oppbevaring av Multipliser skjøtes og unspliced mRNAs observert i latently infiserte T celler17 og fokus på å forstå hvordan LRAs indusere transkripsjon og skjøting dermed virus reaktivering. I tillegg, gitt at systemet krever transfection av 3 plasmider, vi valgte HEK293T celler fordi høy transfection effektiviteten av disse cellene. Noe annet timelige og romlig tilgjengeligheten av cellulære faktorer i T-celler sammenlignet en kreft cellen linje, er det viktig å validere resultatene av skjøting reporteren i HEK293T celler i T-celle linjer og primære celler, som kan gi store tekniske utfordringer på grunn av deres begrensede transfectability. Derfor bruk av alternativ DNA levering reagenser for hva DMRIE-c, som har vist seg å være spesielt effektive for transfection suspensjon celler (f.eks Jurkat) eller nucleofection metoder som Amaxa nucleofector eller Neon Hva system som har vist seg til rette for effektiv og pålitelig levering av én eller flere plasmider vanskelig å transfect celler inkludert primære CD4 + T celler. Alternativt, det ville være interessant å teste denne reporteren systemet i forbindelse med full lengde virus i en primær celle modell av ventetid ved hjelp av nevnte transfection metoder. Faktisk kan forskjeller i tilgjengeligheten av verten transkripsjon, forlengelse og skjøting faktorer i en rCD4 + T celle påvirke kapasiteten til en LRA å reaktivere den latente provirus. Endelig, vår modell ikke adressen om LRA kan påvirke transkripsjon og skjøting av tilskuer celler, og om den kan indusere replikering kompetent virus. Imidlertid vil vi tror at ved å måle en økning i celle-assosiert HIV U.S. og MS RNA, dette ville føre til produksjon av replikering kompetent virus i kultur nedbryting. Dette kan bekreftes ved å gjennomføre gullstandarden kvantitative virus utvekst analysen (QVOA)33.
Den komplekse naturen latency og for å sikre effektiv virus reaktivering, kanskje en mangefasettert kombinasjon strategi er nødvendig34. Potensielle behandling må stimulere flere stier inkludert transkripsjon og skjøting, som tidligere har vist å spille viktige roller i etableringen av ventetid16,35,36, 37. våre LTR-drevet skjøting reporter ville tillate en høy gjennomstrømning screening av stoffer som kan optimalt målrette både skritt, transkripsjon og skjøting, øke sjansen for å finne molekyler som kan synergize effektivt, som ville føre til en lavere dose nivåer og dermed toksisitet av hvert legemiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av prosjekt stipend APP1129320 og programmet grant APP1052979 fra NHMRC i Australia. Vi takker Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson og Michelle Y. Lee for å gi viktig konstruksjoner og råd for en vellykket gjennomføring av dette arbeidet. Vi takker også DMI flyt anlegget ansatte for deres råd og hjelp i å opprettholde flyten cytometer brukt i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
