Summary
Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM) türetilmiş mühendislik iskele kapanması ve şifa yara hızlandırdığını onların potansiyel için ilaç tahrik önemli ilgim yok. Hücre dışı matriks çekme--dan fibrogenic hücre kültürleri vitro ECM üretimi klinik engel xenogeneic epitopları varlığı en aza indirme insan - ve potansiyel olarak hasta özel hücre satırlarından için potansiyeli Bazı varolan ECM ürünler başarısı. ECM implantasyon için uygun vitro üretiminde önemli bir meydan okuma ECM üretim hücre kültürü tarafından genellikle nispeten düşük verim olmasıdır. Bu çalışmada, hücreleri kurban hollow fiber membran iskele içinde kültürlü tarafından ECM üretimi için iletişim kuralları anlatılmaktadır. Hollow fiber membranlar geleneksel cep orta fibroblast hücre hatları ile kültürlü ve ECM sürekli konuları vermeye hücre kültürü sonra çözünmüş. Bu yöntemle üretilen elde edilen ECM elyaf decellularized ve liyofilize, depolama ve implantasyon için uygun işleme.
Introduction
İmplante edilebilir cerrahi iskele bir fikstür yara onarım, dünya çapında her yıl karın duvarı tamir yalnız1için implante bir milyonu aşkın sentetik Polimer kafesler ile vardır. Ancak, sentetik malzemeler polimerler, geleneksel olarak bu iskele imalatı kullanılan implantasyon ardından implant işlevi için zararlı iltihap sonucu ve skar dokusu2 bir yabancı cisim tepki uyandirmak eğilimindedir . Baskın sentetik kafes malzemeleri (Yani, Polipropilen) kayda değer vücut tarafından yenilenmiş değil gibi daha fazla, onlar nerede skarlasma tolere, dokulara genellikle tabidir klinik kullanışlılığı tedavisinde doğru sınırlama kas gibi üst düzey işlev kurcalayarak. Klinik başarı ile uygulanan birçok cerrahi mesh ürün olmakla birlikte, son üretici kafesler ve türler arası doku implantları komplikasyonlar implant en üst düzeye çıkarma önemini vurgulamak sentetik cerrahi hatırlıyor biyouyumluluk, cerrahi düzenlemelerini sıkılaştırmak için FDA isteyen Üreticiler3,4kafes. Hastaların kendi dokulardan türetilmiş iskele implantasyonu bu bağışıklık yanıtı azaltır, ancak önemli donör-site morbidite5' te neden olabilir. Hücre dışı matriks (ECM) üretilen iskele vitro decellularized ECM iskele mükemmel biyouyumluluk, sergilemek gibi mümkün olan bir alternatif, özellikle otolog ECM durumunda6implantlar var.
Otolog implantasyonu hasat için hasta doku sınırlı kullanılabilirlik ve donör sitesinde işlevini engelleyen riski nedeniyle, ECM üretmek için yetenek vitro insan hücre hatları ile kültür iskele veya mümkünse bir hastanın kendi hücreleri cazip bir alternatif olduğunu. Bu yakalama zor moleküller haciz ECM vitro önemli miktarda üretiminde birincil sorunları var. Önceki çalışmalarda, ECM ECM-salgılayan fibroblastlar implantasyon7, için decellularized verim ECM kültür döneminden sonra çözünmüş kurban polimerik köpükler içinde kültür tarafından üretilen göstermiştir 8,9,10. ECM üretilen köpükler Köpükler iç mimarisini kabul eğilimindedir, hollow fiber membranlar (HFMs) konuları ve ECM üretimi için kurban bir iskele olarak keşfedilmeyi. Laboratuvar ölçekli için hücre kültür kalite hollow fiber zarları ve toplu hücre dışı matriks elyaf çekme--dan aynı döneminden sonra fibroblast kültürünün imalatı burada açıklanan yöntemleri görevli vardır. Bu statik kültür standart memeli hücre kültür donanımları içeren laboratuvarları tarafından kolayca adoptable yaklaşımdır. Bu yaklaşım tarafından üretilen ECM çeşitli klinik uygulamaları doğru uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre dışı matriks kurban Hollow Fiber membranlar kullanarak imalatı
Dikkat: N-metil-2-Pirolidon bir rahatsız edici solvent ve üreme toxicant dir. NMP maruz deri, göz, burun ve boğaz tahrişe neden olabilir. Solvent dayanıklı kişisel koruyucu ekipman NMP işlerken kullanılır. NMP kullanımı bir duman başlık içinde gerçekleştirilmelidir.
- Hollow fiber membranlar polysulfone Polimer çözüm hazırlanması
- Polysulfone Pellet 70 g tartmak (Moleküler ağırlığı 35 kD) bir analitik denge kullanarak tartmak tekneyle.
- 314 mL (323.3 g) N-metil-2-Pirolidon (NMP) bir temiz borosilikat şişesi aktarın.
- Bir heyecan bar karıştırıcı üzerine NMP ve yer şişesi ile şişeye koyun. Karıştırıcı ılımlı bir dönme hızına ayarlayın.
- Kuru bir huni yavaş yavaş NMP ile balonun içine polysulfone hazır 70 g eklemek için kullanın.
- Üç gün boyunca oda sıcaklığında veya homojenize oluncaya kadar karıştırmaya polimer "uyuşturucu" çözüm izin verin.
- Temassız ayarlama ve hollow fiber membran spinneret temizlik
Not: Spinnerets ticari olarak kullanılabilir; doğru spinneret boyutları başarılı membran imalat için kritik ve Malzemeler tablolistelenir. Spinneret iğne özellikle kırılgan olduğu gibi spinneret çok yavaşça başa.- Bir tornavida kullanın veya bir uygun tornavida bit ile dikkatli bir şekilde spinneret sökmeye matkap.
- Yavaşça aseton ile giriş ve çıkış, bir cam ölçek bertarafı için aseton ve artık herhangi bir polimer toplama spinneret akışı.
- Spinneret üst vücut tablo mengeneye yukarı bakacak şekilde iğne ile güvenli.
- Çıkış (alt) gövdenin üst vücut üzerine spinneret bir yer.
- Spinneret çıkış gövdesi yanal spinneret iğne doğrudan çıkış vücut ortasına kadar üzerinde mengene sabit üst vücut tutarak hareket ettirin.
- Dikkatli ve yavaş spinneret iki ceset iğne spinneret outlet görünür merkezli kalmasını sağlarken bağlayan vidayı takın.
- Polysulfone hollow fiber membranlar imalatı
- "45 mL N-metil-2-Pirolidon ve 255 mL deiyonize su ile NMP % 15 karışımı oluşturan deiyonize su içeren bir geçişli çözüm" hazırlayın.
- Konsantrik hollow fiber membran spinneret oda sıcaklığında musluk suyu banyo yüzeyi yukarıda 8 cm bağlayın.
- Spinneret polimer giriş ve spinneret geçişli giriş en az 350 mL bir iç hacmi sahip iki ayrı çelik basınçlı kaplar bağlayın. Her iki gemi Ters supablar prizlerine olması gerekir.
- Basınçlı kaplar, her ayrı N2 gaz tüpleri düzenleyiciler için bağlanma
- Bir huni içine spinneret polimer koya bağlı basınç gemi hazır uyuşturucu çözüm (~ 315 mL) eklemek için kullanın. Geminin üst sıkı kapalı olun.
- Kullanım için hazırlanan eklemek için bir huni içine spinneret geçişli giriş bağlı basınç gemi çözüm (300 mL) delik. Geminin üst sıkı kapalı olun.
- Çek valf geçişli gemi için ilk, sonra polimer gemi ikinci açın. Spinneret yeterince temiz ise, geçişli çözüm dışarı spinneret çıkış akışı başlayacak.
- Her iki gemi 1 psi basınç. Görsel olarak polimer ve geçişli çözümler kombine akarsu su banyosu başvurun gibi sürekli beyaz filaman presipite ile spinneret, çıkarken onaylayın.
- Uzun forseps doğmakta olan fiber silindirler banyo ortasına altında yol göstermesi için kullanın ve etrafında dönen bir tekerlek bir motor için bağlı doğmakta olan fiber rüzgar.
- Almak-up tekerlek ve motor yaklaşık iki metre / dakika hızında döndürmek için ayarlayın.
- Küçük ayarlamalar düzenleyiciler veya kararlı durum akışı elde kadar gerektiği gibi almak-up tekerlek hız yapmak. Yeni doğmakta olan fiber 90 ° açı ile su banyosu yüzey oluşturmalıdır.
- Yakın N2 silindir düzenleyiciler ve basinç vanalar denetleyin ve sonra tüm polimer ve geçişli çözüm gemileri kalıptan çekilmiş almak-up tekerlekli motorlu kapatın.
- Hazır içi boş fiber membranlar kaldırmak ve üç gün, günde bir kez kalan solvent kaldırmak için deiyonize su alışverişi deiyonize su banyosu koyun.
- Hollow fiber membranlar tarafından ısıyla sterilize 121 ° C'de 30 dakika ya da onlara bir günde %70 etanol için çeker tarafından onları.
- Hücre içi boş fiber zarı tohumlama
Not: Tüm hücre kültür yordamları bir Biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir.- Hollow fiber membranlar sığır plazma fibronektin 20 µg/mL çözeltisi ile PBS içinde tedavi (pH 7.4 =) hücre eki tanıtmak için.
- Toz sığır plazma fibronektin tartmak tekne 1 mg tartmak ve 1 mL steril PBS çözülür (pH 7.4 =) steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde.
- 1 mg/mL sığır plazma fibronektin çözüm kuluçka 30 dakika boyunca kuluçkaya. 49 mL steril 50 mL konik santrifüj tüpü içinde steril PBS için çözüm ekleyin.
- Lifleri sığır plazma fibronektin %5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka hazırlanan 50 ml 1 saat kuluçkaya. Fibronektin çözüm için daha sonra kullanmak ve steril 50 mL konik santrifüj tüpü 4 ° C'de deposunda hatırlamak
- Steril microscissors lifler istenilen uzunluğa kesmek için kullanın (< 6 cm).
- Tohum fibroblast hücreleri doğrudan hollow fiber membranlar 1 mL şırınga ile 21'lik iğne kullanarak fiber başına 100.000 hücre tohumlama yoğunluğu, lumina içine.
Not: şırınga yükleme için hücre süspansiyon hazırlamak için uygulanabilir bir hedef, her 30 microliters orta için 100.000 hücre bir süspansiyon yoğunluğudur. - Altı numaralı seribaşı lifleri 6 cm çapında Petri kabına yerleştirin. %5 CO2 37 ° C'de beş dakikalığına kuluçkaya numaralı seribaşı lifler izin.
- Numaralı seribaşı lifleri kuluçka kaldırmak ve onları ilâ 3 hafta boyunca DMEM/F-12 50 µg/mL L-askorbik asit ve 150 µg/mL L-askorbik asit 2-fosfat son konsantrasyonları içeren kültür (taze hazırlanmış ve steril filtre), 5 ng/mL TGF-β1 (dan steril -20 ° C'de depolanan aliquots süzülmüş) ve % 1 penisilin-streptomisin 6 cm Petri kabına içinde 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka Exchange cep orta iki günde.
- Hollow fiber membranlar sığır plazma fibronektin 20 µg/mL çözeltisi ile PBS içinde tedavi (pH 7.4 =) hücre eki tanıtmak için.
- Hücre dışı matriks çekme--dan kültürlü hollow fiber membranlar
- Yer lifleri forseps kullanarak bireysel mercek şişe kültürlü.
- NMP ilâ 5 mL Cam Pipet kullanarak her şişe yerleştirin.
- Toplam NMP üç değişimi gerçekleştirme NMP, içi boş lifler bırakın. Yavaş yavaş ayıklanan ECM yırtılma önlemek için 1 mL pipet kullanarak eski NMP Aspire edin.
Not: taze NMP eklerken, bu şişeyi yatırmak yararlı ve kenarları aşağı koşmak NMP izin aksi takdirde geri kalan ECM iskele hangi yırtılmaya neden olabilir yamultmak için tabi tutulur. - NMP kaldırmak ve elde edilen ECM iplik 3 kez deiyonize suyla durulanır.
- Silikon kauçuk 3 inç, genişliği 1 inç uzunluğunda için 1/32-inç kalınlığında sac kesme ve bir 8 mm lastik uzunluğu merkezinde 4 mm dikdörtgen kalıp kekemelik.
- Kauçuk üzerine bir standart 3-inç 1-inç mikroskobu slayt ve basınçlı kap tarafından hazırlanan parçası 121 ° C'de 30 dakika yerleştirin.
- Görünür hiçbir açık alan kalmayana kadar 4 mm silikon kalıp tarafından her ECM fiber 8 mm yan yana yatıyordu.
- Kalıp bir 50 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin ve-80 ° kadar tamamen donmuş C'de dondurmak.
- Donmuş ECM kafes gecede veya kadar tamamen kuru lyophilize. Decellularization için hazır kadar kafes 4 ° C'de depolayın.
2. hücre dışı matriks decellularization
- %1 (w/w%) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) deiyonize su çözeltisi hazırlamak.
- Bir rocker nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 24 saat içinde kalıp içinde % 1 SDS ayıklanan hücre dışı matriks kuluçkaya.
- Durulama üç kez içinde steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile nazik ajitasyon, PBS 3 mL durulama başına kullanarak hücre dışı matriks ayıklanır.
Not: Durular yavaşça hazırlanan iskele yırtılma en aza indirmek için yapılmalıdır. - DNaz/RNAse sindirim arabelleği 1 L hazırlayın.
Not: DNaz/RNAse sindirim arabellek birkaç ay 4 ° C'de depolanmış olabilir- 1,54 g Tris HCL, MgCl2308 mg ve 56 mg CaCl2 ayrı tartmak teknelerde tartın.
- Tris HCl, MgCl2ve CaCl2 1 litre deiyonize suyla bir heyecan bar ile büyük bir şişesi ile birleştirmek ve tüm bileşenleri eriyene kadar karıştırın.
- Steril filtre sindirim arabellek bir steril 1 L borosilikat şişe ve mağaza 4° C'de 0,22 µm filtreli
- 5 mL DNaz/RNAse sindirim çözeltisi hazırlamak.
Not: Sindirim eriyik hazırlığı 24 saat içinde kullanılmalıdır.- DNaz 0,125 mg (50 kU) tartmak ı bir tartmak tekne ve sindirim arabellek için 5 mL ekleyin.
- 75 µL RNAse A hisse senedi çözüm sindirim arabelleğe ekleyin.
- Her kalıp sindirim çözüm ile doldurun ve 4 ° C'de 6 saat kuluçkaya.
- Sindirim çözüm Aspire edin ve üç kez steril PBS durulayın.
- PBS Aspire edin ve iskele % 10 penisilin-streptomisin PBS içinde 4 ° C'de geceleme kuluçkaya
- Penisilin streptomisin Aspire edin ve iskele üç kez steril PBS durulayın.
- Kalıp bir 50 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin ve-80 ° C'de dondurmak
- Decellularized ECM kafes gecede veya kadar tamamen kuru lyophilize.
- Kullanım bekleyen 4 ° C'de steril bir kap içinde bir Biyogüvenlik hood lyophilized iskele aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre dışı matriks kurban iskele üzerinden başarılı üretim uygun iskele imalatı, hücre kültürü ve solvent durulama yordamlar şartlı olduğunu. Hollow fiber membranlar imalatı ekstrüzyon Polimer çözüm piyasada bulunan bir çelik halka aracılığıyla kullanan ticari olarak mevcut bileşenleri (Şekil 1) monte bir kuru-jet ıslak eğirme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir spinneret (iç çap = 0.8 mm, dış çap = 1,6 mm) hollow fiber membran su banyosu ile temas üzerine içine precipitates Polimer çözüm doğmakta olan bir kutu oluşturmak için.
HFMs ECM çıkarılması için bir örnek işlem Şekil 2' de gösterilmiştir. Şekil 3A polysulfone HFMs enine kesiti bu iletişim kuralı'nı, fabrikasyon parmak benzeri gözenekleri bir asimetrik membran karakteristik iç ve dış katmanları sergilenmesi gösterir. Bu protokol için hücre membran iç lümen özellikle tohumlari ve hücre membran tüm yüzeylerde çoğalırlar eğilimi ile 6 cm çap Petri yemekler (Şekil 3B), kültürlü. Kültürlü membranlar sonra toplu NMP ve standart cam mercek şişeleri (Şekil 3 c), deiyonize suyla durulama ECM (şekil 3D) yarı saydam konuları üreten tabi. ECM üreten hücrelerin içinde HFMs uygun Kültür (Şekil 4) 3 haftalık dönem kalır.
Birincil fare iskelet kas fibroblastlar (RSMF) N-metil-2-Pirolidon, üç alışverişi sonra durulanır onlar üç kez deiyonize suyla çözünmüş ile üç haftadır kültürlü HFMs. Ayıklanan matris, (Şekil 5A), normalde sulu zaman görünüşte yarı saydam olmak-hidrasyon bulut eğiliminde olacaktır değilse için uygun çözelti durulama artık polimer varlığı nedeniyle tabi. Ayrıca iyi forseps ile işleme bakım gerektiren membran dağılmasından sonra kalan ECM biraz kırılgan olduğunu belirtmek. Kafesler monte ve sonra liyofilize ECM lifler bir off-beyaz rengi ve brüt boyuna hizalama (Şekil 5B) ile fibröz görünümü sergiler.
Şekil 1: resimli işlem akışı hollow fiber membranlar döküm için. Hollow fiber membranlar piyasada bulunan bileşenleri belirli maddeler tablosunda listelenen hazırlanan bir sistemi kullanarak her yerde sigara solvent indüklenen faz ayırma yöntemi (NIPS) kullanılarak üretilmektedir. Polysulfone NMP (17,8 w/w%) ve NMP geçişli çözümleri (15 w/w% suda NMP) ayrı paslanmaz çelik damarları basınçlı N2 tarafından tamamen precipitates spinneret çıkış, yeni doğmakta olan hollow fiber membran üreten bir spinneret içine musluk suyu yağış banyo ile temas. Yeni doğmakta olan içi boş lif el ile güdümlü altında ve üzerinde kılavuzları ve 2.3 metre / dakika bir hızda dönen bir motorlu take-up tekerlek üzerinde toplamak için izin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: resimli kültürlü hollow fiber membranlar ECM üretiminden. Hollow fiber Membranlar ile fibroblastlar tohumlari ve üç hafta boyunca NMP exchange tarafından takip kültürlü 3 x ve Satım deiyonize su 3 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Kültür ve ECM çıkarma. Asimetrik mesoporous hollow fiber membranlar (A) DMEM/F-12 RSMF hücrelerde desteklenmiştir askorbik asit ve TGF-β (B)ile üç haftadır kültürlü. Kültürlü içi boş lifler (C, D üst) n-metil-2-Pirolidon 3 alışverişlerde yoluyla çözülmüş olsaydı o zaman deiyonize su, ECM (D, alt) sürekli konuları içinde ortaya çıkan üç kez durulanır. Yüksek büyütme elektron mikroskobu test ECM lif yüzeyinin (E)tarama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: hücre içi boş fiber membranlar üzerinde canlılığı. Üç hafta boyuna HFMs luminal yüzeyinde ortaya çıkarmak için iyi bir jilet kullanarak kesitli için RSMF hücrelerle kültürlü ve Calcein AM ve EthD-1 ile canlı ölü boyama için tabi temsilcisi hollow fiber membranlar. Boyama canlılık hücrelerin konfluent tabakası ile ihmal edilebilir EthD-1 floresans saptandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: ECM implant Meclisi. Tek tek hücre dışı matriks konu (n = 30) elde edilen RSMF kültür hücreleri bir silikon kalıp (A) içine boyuna yerleştirildi ve ben, RNAse A ve penisilin-streptomisin decellularized % 1 SDS DNaz tedaviyle ardından tarafından. Decellularized ECM sonra bir off-beyaz mesh fibröz görünüm ve boyuna mimarisi (B)ile verimli liyofilize. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan işlemleri bir kuru-jet ıslak eğirme sisteminde membranlar hem standart hücre kültür malzemesi ucuz toplu üretimi için artığını hollow fiber membranlar kullanarak toplu ECM Biyomalzeme vitro üretimini sağlar. Bu protokol için fabrikasyon membran hücre kültüründe kullanmak içindir iken, açıklanan sistem ayrıca membran ayırma amacıyla, gözenek boyutu dağıtım ve içi boş lif boyutları değişen tarafından ayarlanabilir ile üretim için adapte edilebilir spinneret boyutları, kullanılan, polimer uyuşturucu ve akış hızı, almak-up hız ve çevre koşulları taşıyordu. 13 hollow fiber membranlar ayrıntılı protokolü kullanır rağmen herhangi bir eriyen hücre kültürü İskele yapısı-açık hücre gibi uygun taşıma özellikleri ile prensipte köpükler, önceki çalışma7', gösterildiği gibi kullanılabilir 8,9. Bu genel yaklaşım daha sadakatle iç mimari dokuların taklit edebilirsiniz kurban iskele tarafından ECM iskele imalatı için yararlı görünüyor. Bu iletişim kuralı tarafından özellikle üretilen implantlar tendon, bağ ve kas iskelet gibi son derece hizalanmış doku yeniden inşası doğru belirli yararına olabilir bir brüt hizalama (Şekil 5B), sergi.
Düzenli döviz orta ve özellikle, orta askorbik asit ve TGF-β takviyesi askorbik asit kollajen sentezi içinde temel bir enzimdir ve TGF-β birkaç ECM protein10 sentezi indükler ECM, üretim için çok önemlidir . Ayrıca, ECM NMP ile kapsamlı durulama gerçekleştirilmesi gerekir, aksi takdirde artık polimer olarak beyaz bir film su durular sırasında ortaya çıkarılan ECM alanında bulunacaktır. Nispeten kırılgan olduğu gibi bakım değil aşırı ECM membran dağılması sırasında kışkırtmak için alınması gerekir. İmplantasyon için amaçlanan toplanan ECM iskele decellularization adıma bir potansiyel ev sahibi yabancı cisim yanıt en aza indirmek için xenogeneic epitopları kaldırmak için açıklandığı gibi maruz gerekir.
Bu teknik önemini üretiminin vücudun yara iyileşmesi kendi işlemler tarafından yenilenmiş tüm hücre dışı matriks bir biocomplex iskele yatıyor. ECM hücrelerden belirli bir hedef türler için üretmek için bu yaklaşım kullanarak, bu sınıftaki bir Biyomalzeme klinik etkinliğinin engel yabancı cisim yanıt en aza indirmek mümkün olabilir; tek bir bireye belirli hücreleri kullanarak, yabancı cisim yanıt daha da azaltılabilir. Bu yaklaşım aynı zamanda son raporlar doku özgü ECM belirli uygulamaları12' özellikle etkili olabileceğini düşündüren ile belirli dokulara doğru hedef ECM üretimi sağlar. Olarak bu ECM üretimi çeşitli hücre hatları üzerinden iletişim kuralı sağlar ECM birkaç hücre türleri (Örneğin kas, sinir, endotel) birleştirme implantlar implantlar daha sadakatle yapısı ve kimyasal yaklaştırmak için uyarlamak için kullanılabilir hedef dokulara karmaşıklığı. Burada sunulan ECM kafesler aslında yara onarım için iskele olarak istenmeyen iken, onlar da hücre-ECM etkileşimleri, durotaxis ve biosensing soruşturmalar için platformlar olarak kullanmak olabilir. Özellikle, bu yaklaşım araştırmacı doku özgü ECM yapısı, kompozisyon ve işlev biyolojik önemi yeni görüşler için izin verebilir ilgi belirli hücre türlerinden ECM üretmek yeteneği oldukça rahat.
Burada sunulan ECM üretim teknikleri için potansiyel iyileştirmeler ölçek-up yolu ile dinamik ve önceden Klima Biyoreaktörler kullanımı hem hem alternatif kurban İskele malzemeleri ve mimarileri içerebilir. Özellikle, bir solventless iskele kaldırma işlemi için geçiş çıkarma işleminin güvenliğini artıracak; kurban iskele enzimler, rejenere selüloz gibi parçalanabilir malzemelerden bestelediği solventless ECM ayıklama14için izin verebilir. Bu malzemelerin gerilme kuvveti bu sentetik malzemeler olmakla birlikte, çeşitli kültür koşulları, medya formülasyonları ve kurban iskele geometrileri keşfi de dahil olmak üzere bu iskele geliştirilmesi için çeşitli yollar vardır. Son genetik mühendisliği gelişmeler ECM yakalama için platformlar ile birlikte klinik talepleri tatmin edici iskele imalatı sağlayabilir pro-fibrotik hücre satırlar üretmek için kaldıraçlı. Ayrıca, varolan dinamik kültür sistemleri sürekli akışı döngü hollow fiber membran Biyoreaktörler yüksek oranda besin kolaylaştırmak gibi daha büyük ve daha hızlı ECM üretimi için elverişli Döviz ve bu yararlanarak belirli ilgi olabilir ECM biyolojik araştırma ve klinik daha büyük miktarlarda üretim tekniği kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü artrit ve Musculoskeletal ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaradaki R15AR064481, Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1404716), cilt hastalıkları tarafından desteklenen yanı sıra Arkansas Biosciences Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
