Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Effekter av Blast-indusert Biografiske filmer på trykksatt gnager midt Cerebral arterier

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/58792
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch, 2The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research, University of Texas Medical Branch

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beskrive metoder for ex vivo vaskulær reaktivitet besluttsomhet etter en primær blast traumatisk hjerneskade (bTBI) bruker isolert, trykksatt, gnager midten cerebral arteriell (MCA) segmenter. bTBI induksjon gjøres ved hjelp av et sjokk rør, også kjent som en avansert Blast Simulator (ABS) enhet.

Abstract

Selv om det har vært studier på histopathological og atferdsmessige effekter av eksplosjon eksponering, dedikert færre til blast's cerebral vaskulær effekter. Betydning (dvs., ikke-blast) traumatisk hjerneskade (TBI) er kjent for å redusere trykket autoregulation i hjerne blodkar i både mennesker og forsøksdyr. Hypotesen som eksplosjon-indusert traumatisk hjerneskade (bTBI), som påvirker TBI, fører til svekket cerebral vaskulær reaktivitet ble testet ved å måle myogenic dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykk i gnager midten cerebral arteriell (MCA) segmenter fra rotter utsatt for mild bTBI bruker en avansert Blast Simulator (ABS) sjokk rør. Voksen, mannlige Sprague-Dawley rotter var anesthetized, intubated, ventilert og forberedte humbug bTBI (identiske manipulasjon og anestesi unntatt blast skade) eller mild bTBI. Rotter ble randomisert til å motta humbug bTBI eller mild bTBI etterfulgt av offer 30 eller 60 minutter etter skade. Umiddelbart etter bTBI, rettende refleks (RR) undertrykkelse ganger ble vurdert, euthanasia på tide poeng etter skade ble fullført, hjernen ble slaktet og personlige MCA segmentene var samlet, montert og trykk. Som intraluminal trykket perfused gjennom arteriell segmentene ble redusert i 20 mmHg trinn fra 100 til 20 mmHg, ble MCA diameter målt og registrert. Med synkende intraluminal press, MCA diameter stadig økt betydelig over grunnlinjen i humbug bTBI grupper mens MCA dilator svar ble betydelig redusert (p < 0,05) i begge bTBI grupper som gjenspeiles av handikappede, mindre MCA diameter registrert for bTBI grupper. I tillegg RR undertrykkelse i bTBI gruppene var signifikant (p < 0,05) høyere enn i humbug bTBI grupper. MCA er samlet fra Sham bTBI grupper utstilt typiske vasodilatory egenskaper til nedgang i intraluminal press mens MCAS samlet etter bTBI utstilt betydelig svekket myogenic vasodilatory svar til redusert trykk faste i minst 60 minutter etter bTBI.

Introduction

Lik som følger effekten (dvs., ikke-blast) TBI, blast-indusert traumatisk hjerneskade (bTBI) har vært forbundet med cerebral vaskulære skader1 og svekket cerebral vaskulær kompenserende Svar å forekomster som endringer i delvis presset av karbondioksid (PaCO2)2,3,4 og oksygen (Pão2)5. I tillegg har eksplosjon eksponering forårsaket cerebral arteriell vasospasme i dyr6 og bTBI pasienter7,8. Mens klinisk TBI9 og væske-perkusjon skade (FPI)10,11,12 er assosiert med svekket cerebral vaskulær svar til endringer i arterielt blodtrykk (dvs., Trykk autoregulation)9,10,11,12, usikkerhet igjen om effekten av bTBI på cerebral vaskulær press autoregulation kapasitet.

Cerebral sirkulasjon reagerer på variasjoner i systemisk arteriell trykk med hensikten å opprettholde en kontinuerlig oksygen og næringsstoffer levering levert til metabolically aktiv hjernen13,14,15, 16. En unik form for homeostase, autoregulation17,18,19 oppstår når "et organ opprettholder en konstant blodstrøm til tross for endringer i blodtrykk (perfusjon) eller andre fysiologiske eller patologisk stimuli" 20. cerebral arterier constrict eller dilate svar blodtrykk, nitrogenoksid (NO), blod viskositet, PaCO2 og Pão2, etc.4,11,16, 21. arterial myogenic svar refererer til slike sammentrekninger eller dilations. Myogenic vaskulære svaret, først beskrevet av Bayliss22 og store mekanisme bidra til autoregulation av CBF, er preget av vasokonstriksjon hvis perfusjon trykket øker og vasodilatation hvis perfusjon trykket reduseres 14 , 17. dette vaskulær svaret er iboende evne til kontraktile vev (som vaskulær glatt muskelceller, VSMC'S) å svare på strekke og/eller endringer i lumen og/eller vegg spenning23,24, 25,26,27,28,29. Når blodårene er strukket (f.eks, under intravascular trykket øker), VSMC'S constrict24,25,26,28.

Studier som undersøker motstand fartøy ex vivo har ofte ansatt en av to metoder for å teste egenskapene farmakologiske og fysiologiske isolert motstand fartøy: ring-montert metoden og den cannulated, trykk metoden. Ring-montert fartøy forberedelse metoden innebærer to ledninger gikk intraluminally gjennom fartøyet segmentet, som holder segmentet på plass. Måle mengden av kraften på isometrically vedvarende ledninger målere stimulering av VSMC'S. Men denne teknikken bærer med seg visse reservasjoner, særlig den uunngåelige skaden påført endothelial laget av lumen som ledningene er gått gjennom det30 og varierende grad av strekker påført isolert segment som igjen fører til fartøyet veggen distensjon, til slutt påvirker fartøyets følsomhet for farmakologisk agenter31. Cannulated, trykk fartøy forberedelse metodikken benytter en arteriograph består av to separate kammere som hver hus plasseringen av en midtre cerebral arteriell (MCA) høstet fra en enkelt dyr. Brønnene settes inn i hver ende av segmentet, den proksimale enden av segmentet er festet til brønnene med suturer og lumen er sakte parfyme med en fysiologisk saltløsning (PSS) for å fjerne blod og andre stoffer. Den klubbeformede enden er deretter sikret med suturer. Transmuralt eller luminal trykk ligger ved å heve to reservoarene knyttet til hver Pipetter til en egnet høyde over hvert segment, men ved ulike høyder med hensyn til de andre32,33,34,35 ,36. Trykk transdusere plassert langs reservoarer og Mikropipetter gir perfusjon automatiske blodtrykksmålinger mens fartøy forstørret bruker en invertert mikroskop utstyrt med en skjerm, videokamera og skalering tillater for måling av eksterne MCA diameter. Selv om begge metodene er verdifull, cannulated, trykkluft fartøy forberedelse metodikken bedre etterligner og tillatelser fartøyene undersøkt for å være nærmere sin i vivo forhold32,37.

Effekten av ulike typer innvirkning (dvs., ikke-blast) TBI cerebral vaskulær tiltak har tidligere vært undersøkt i cerebral arteriell segmenter21,35,36,38. Bruker en lignende ex vivo MCA protokollen for fartøyet innsamling, montering og perfusjon som beskrevet i denne studien, oppnådd tidligere studier suksess med sine respektive undersøkelser i de tilknyttede mekanismene av hjerne blodkar dysfunksjon følgende TBI. Golding et al.34 undersøkt endothelial-mediert dilations i voksen, mannlige lange-Evans rotte MCAS etter alvorlig TBI ved kontrollert kortikale innvirkning (CCI for) skade. I en annen studie, Golding et al.36 undersøkt cerebrovascular reaktivitet hypotensjon eller CO2 etter høsting MCAS fra rotter som opprettholdt en mild CCI. Yu et al.38 analysert om peroxynitrite renovasjonsarbeider forbedret dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykket i voksen, mannlige Sprague-Dawley rotten MCA segmenter utsatt for FPI mens Mathew et al.21 studerte myogenic svar til hypotensjon i MCA er høstet etter moderat, sentrale FPI.

Bedre undersøke hypotesen at bTBI, som ikke-blast TBI, fører til svekket cerebral vaskulær reaktivitet, vi testet en mekanisme bidra til svekket autoregulation ved å måle myogenic dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykk ex vivo i isolerte, trykksatt gnager MCA segmenter (figur 1) fra rotter utsatt for mild bTBI bruker en avansert Blast Simulator (ABS) sjokk tube modell (figur 2 og Figur 3) (se Rodriguez et al.39 Tabell 1) som bruker trykkluft levert direkte til en driver kammer å generere Freidlander-lignende40 over og under trykk bølger (se Rodriguez et al.39figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : Plasseringen av midtre cerebral arteriene (MCA). Opprydning rotte hjernen utheving plasseringen av MCAS bakre hjerne arteriene (PCA), interne carotis arteriene (ICA), eksterne carotis arteriene (ECA), basilar arterien (BA) og felles carotis arteriene (CCA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Avansert Blast Simulator (ABS) sjokk rør enhet. ABS brukes til å produsere primære eksplosjon skader i alle studie dyr. 1 = driveren kammer; 2 = ekspansjon kammer;  3 = prøven kammer; 4 = reflektert bølge suppressor; gul stjerne = prøven skuffen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Texas Medical Branch, et annet vurdering og akkreditering av laboratoriet dyr omsorg (AAALAC) akkreditert anlegget.

1. dyr forberedelse for ABS eksplosjon skader

  1. Slå på mekanisk gnager volum ventilator og sett pusten rate mellom 40-45 åndedrag per min.
  2. Bryteren Termostatbatteri kontrollert oppvarming teppe ON og tape en blå puten over den.
  3. Koble vifte slangen til ventilen.
  4. Samle endotracheal intubasjon slede, laryngoskop, lang pickup pinsett, stylet, Villena og en bomullspinne dynket med 0,05 mL 1% Lidocaine HCl. Organiser på den blå puten.
  5. Kontroller at gnager bedøvende "boble" kammer, ventilator, luftkammer og isoflurane kammeret slanger er sikkert koblet og knyttet til deres respektive plugg eller socket. Anestesi boble chamber klemmen bør være åpen; ventilator klemmen skal LUKKES.
  6. I luftkammer, angi knott for romluften 2 L/min og knott for oksygen til 1 L/min.
  7. Slå på isoflurane og sette knotten til 4% av volumet blanding.
  8. Starter en tidtaker og sett en ung voksen (≈3 måneder gammel), mannlig Sprague-Dawley rotten (350-400 g) i bedøvende boble chamber for 4-6 minutter.
  9. Veie rotten på 2 min merket.
  10. Bekreft rotten er fullt anesthetized ved forsiktig pinching bakben pote tær. Hvis ingen pote uttak er observert, redusere rommet luften og sette knotten til 1 L/min, oksygen til 0,4 L/min og isoflurane til 2% av volumet blanding.
  11. Slå på endetarms telethermometer temperatur monitor.
  12. Åpne klemmen til ventilen og Lukk klemmen til anestesi boble chamber.
  13. Fjerne rotten fra bedøvende boble chamber og posisjon på endotracheal intubasjon sleden.
  14. Intubate rotte. Plasser laryngoskop i dyr munnen, bruk lenge pickup pinsett for å plassere tungen ut av veien, vattpinnen lidocaine-gjennomvåt bomull swab tips langs innsiden av halsen og forsiktig inn stylet som inneholder den cuffed endotracheal tuben i rat's luftrøret.
  15. Når intubated, sett enden av ventilen slangen til utenfor slutten av Villena og observere og bekrefte rotta er puste jevnt og uten problemer.
  16. Tie ned endotracheal røret i stedet ta vare at tungen er uten knuten.
  17. Hvit vaselin gjelder endetarms telethermometer sonde og sett rett under halen.
  18. Fjern ABS prøven skuffen fra prøven kammeret og plasser under varme lampen for oppvarming før rotte plassering på skuffen.
  19. Barbere toppen av rottes hodebunnen over øynene og ned til mellom ørene.
  20. Skjær en standardstørrelse skum øret plugg i identiske halvdeler med saks. Starter i midten av foten av pluggen og kuttet rett opp avrundet spissen. Sett litt halvert i hvert øre tips først langs ørekanalen til kontakt laget med trommehinnen.
  21. Overvåke endetarms temperatur. Når en temperatur på 37 ° C er nådd, er rotta klar til å bli lastet inn i ABS prøven skuffen.
  22. Sikre rotta på ABS prøven skuffen. Fjern vifte slangen fra endotracheal røret og raskt men sakte skyve rotta i overkant av skuffen, forsiktig guiding hodet gjennom hodet holder åpne og gummi krage. Sette ventilator slangen tilbake i den endotracheal tuben, når gummi krage å sørge for at det er trygt, men ikke stramt rundt halsen og kontroller at rotta er å legge en lateral utsatt posisjon (Figur 3).
  23. Slå av isoflurane og fjerne vifte slangen fra endotracheal tube.
  24. Lås og sikre ABS prøven skuffen som inneholder bedøvet rotta i ABS prøven kammeret.
  25. Forsiktig knipe hind pote tærne med lang pinsett hver 3 s før uttak refleks svar er skapte.

2. ABS Blast enheten forberedelse og Blast-TBI induksjon

Merk: Protokollen trinnene 2.1-2.10 vanligvis fullføres samtidig som trinn 1.1-1,22 så ABS er klar for eksplosjon skader administrasjon rett etter rotta er lastet og sikret i prøven kammeret.

  1. Løsne hydraulisk hånden pumpen (Figur 4A) knott for å tillate alle gjenværende innestengte luften å unnslippe fra driveren kammer (Figur 4B) og løsne kammeret fra sitt segl.
  2. Løsne hetten nøtter (Figur 4C) fra alle-tråden stenger (Figur 4D) rundt driveren kammeret og skyv kammeret til venstre og fra ekspansjon kammeret (Figur 4E).
  3. Fjerne to all-tråden stenger og deres tilsvarende cap nøtter ligger på toppen av driveren kammeret for å tillate for plassering av mylar ark mellom driveren og utvidelse kammer.
  4. Stabel og tape sammen langs overkanten fire pre kuttet og pre-målt (30 cm lengde, 20 cm bredde, 0.004 tommer tykk) mylar ark (danner en mylar ' membran") med en 2,54 cm maskeringstape. Med en andre bånd, sikkert tape toppkanten av mylar membranen til toppen av ekspansjon kammeret og over midten av åpningen mellom driveren og utvidelse kammer (Figur 4F).
  5. Sikre driveren kammeret mot mylar membranen ved å erstatte to all-tråden stenger øverst i kammeret og hånd-stramme alle cap nøtter rundt kammeret.
  6. Plassere tilbehør stål blokken mot hydraulisk hånden pumpen blokk og driver kammeret til sikkert passer.
  7. Snurp hydraulisk hånden pumpen knotten og bekrefte driveren kammeret forblir trykksatt med ingen lekkasjer ved å observere en konstant press terskel på hydraulisk måleren.
  8. Åpne utløseren oppkjøpet filen som registrerer ABS blast enheten press spor på ABS blast enhet datamaskinen.
  9. Løsne trykkluft tankens (Figur 4G) viktigste knotten nok litt åpne luftveiene.
  10. Operere hydraulisk håndpumpe til måler-indikator når den røde pilen indikerer et ønsket chamber press nivå av ≈5, 000 psi.
  11. Sikre og plasser bedøvet dyret på ABS prøven skuffen (Figur 4H) i laterale utsatt posisjon (Figur 3) og låse prøven skuffen i ABS prøven kammeret (Figur 4jeg).
  12. Forsiktig knip en hind pote med lang pinsett hver 3 s før uttak refleks svar er skapte.
  13. Klikk Start på siden åpnet oppkjøp på ABS blast enhet datamaskinen.
  14. Når vinduet 'Acquisitioning' vises på skjermen, utløse trykk og hold nede ABS blast enheten før eksplosjonen går av, rupturing mylar membranen og administrere ABS blast skade (20.9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) rotta. Rett etter eksplosjonen detonates, starte en andre tidtaker for å holde oversikt over hvor mye tiden (i minutter og s) har gått etter skade.
  15. Fjern rotta fra ABS prøven brett og tilbake til blå puten og oppvarming teppe, plasserer ham fullt på ryggen for vurdering av rettende refleks undertrykkelse.
  16. Registrere tiden for retur av rettende refleks. Observere andre stoppeklokken dokumentet i min og s lenge etter skade det tar for rotta å rulle fra ryggen på magen tre påfølgende ganger. Returnere rotta til anestesi boble chamber.
  17. Løsne hydraulisk hånden pumpen knott for å tillate driveren kammer løsne og bevegelse.
  18. Stram trykkluft tankens viktigste knotten vil lukke luftveiene.

Figure 3
Figur 3 : Rotte plassering på ABS prøven brett og inne absolutt Retning og orientering av studien dyret i ABS. Når plassert i ABS, er dyret i tverrgående utsatt posisjon med dorsal overflaten av hodet vinkelrett på sjokkbølgen retningen (røde piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Avansert Blast Simulator (ABS) sjokk tube enheten. Store deler av ABS. A = hydraulisk håndpumpe; B = driveren kammer; C = cap nøtter; D = all-tråden stenger;  E = ekspansjon kammer; F = plassering av mylar membran plassering; G = pressluftflasker; H = prøven skuff. Jeg = prøven kammer.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

3. forberedelse av gnager MCA PSS løsning

Merk: Protokollen trinnene 3.1-3.3 vanligvis fullføres samtidig som trinn 1.1-1,22 ha PSS løsningen er klar til bruk.

  1. Forberede og bland en 1000 mL fysiologiske salt løsning (PSS) av følgende sammensetning og konsentrasjoner: 130 mM NaCl; 4.7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; 5 mM glukose; 1.5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.
  2. Equilibrate PSS med en gassblanding av 21% O2 og 5% CO2 i en balanse av N2. Løsningen er klar når pH leser 7.4.
    Merk: Alle gasser hentes fra komprimert gass sylindere i de ovennevnte konsentrasjonene.
  3. Fylle reservoaret flasker og rør med PSS løsningen og chill gjenværende løsningen.

4. utvinning av gnager MCA segmenter

  1. Etter dokumentere lengden av rettende refleks tid, returnere rotta til anestesi boble chamber. Lukk klemmen til ventilen, og åpne klemmen til kammeret. Slå isoflurane på 4% av volumet blanding og holde rotta i kammeret i 2-3 min til dypt anesthetized.
  2. Når rotta er anesthetized, åpne klemmen til ventilen og Lukk klemmen til anestesi boble chamber. Redusere isoflurane til 2% av volumet blanding og fjerne ham fra boble chamber. Plasserer ham på magen på oppvarming teppet og sett slutten av ventilen slangen til utenfor slutten av Villena.
  3. Opprettholde mekanisk ventilasjon frekvensen pust mellom 40-45 åndedrag per min og anestesi på 2% av volumet blanding i 30 eller 60 min umiddelbart innlegg-bTBI skade.
  4. Etter ferdigstillelse av enten 30 eller 60 min overlevelse tid, øke isoflurane til 4% av volumet blanding, og dypt bedøve for 5-6 min. umiddelbart euthanize ved halshogging bruker en gnager-spesifikke giljotinen.
    Merk: I disse eksperimentene holdt vi dyrene anesthetized og mekanisk ventilasjon etter retur av rettende refleks til halshogging.  Hvis studien krever lengre overlevelse timepoints, bør smertestillende gis til dyret før fremveksten bedøvelsen.
  5. Delikat fjerne hjernen fra skallen. Bruke en #10 skalpell blad for å gjøre et sentralt, 1,5 tommers loddrette, bein dyp snitt fra toppen av barbert hodebunnen ned i occipital condyle.
  6. Bruk små ben rongeurs åpne og skille hodebunnen huden fra skallen benet.
  7. Bruke store bein rongeurs kuttet og pakke tilpassing, interparietal og nedre halvdel av frontal bein encasing hjernen.
  8. Bruk en kirurgisk slikkepott til å nøye grave hjernen av skallen når hjernen er gratis omkringliggende bein.
    Merk: Ta varsomhet når skille hjernen fra skallen så ikke å unødvendig rykk, rykk eller trekke delikat MCA segmenter fra skallen veggen.
  9. Innskudd høstet hjernen til kjølt PSS løsningen i et lite glass Petriskål som ligger direkte på en solid isblokk.
  10. Fjern forsiktig både venstre og høyre MCA begynnelsen på sirkelen av Willis. Fortsette å fjerne segmentet lateralt og ryggen for ca 4-5 mm.
  11. Forsiktig rengjøre samlet MCA segmentene på ca 4-5 mm i lengde av alle forbinde tissue benytter microforceps.
  12. Montere MCAS på arteriograph. Cannulate den proksimale enden av hvert segment med den første glass brønnene (diameter ≈70 µm) og sikre med en 10-0 nylon Sutur.
  13. Sakte perfuse lumina med PSS for å fjerne eventuelle gjenværende blod og annet innhold fra lumen.
  14. Cannulate distale hvert segment med den andre brønnene uten strekking MCA segmentet og sikre med en 10-0 nylon Sutur.
  15. Etter vellykket montering av MCA segmentet, kan du plassere kammer på en invertert visningskroppen scenen for forstørrelse av fartøyene. Mikroskopet er utstyrt med et videokamera, skjerm og en video skalering kalibrert med en optisk mikrometer for arteriell diameter målinger.
  16. Fylle hvert segment og omkringliggende arteriograph bad med kontinuerlig sirkulert PSS varmet fra rom temperatur å 37 ° C og equilibrated med gassblanding av 21% O2 og 5% CO2 i en balanse av N2.
  17. Equilibrate MCA segmentene ved et trykk på 50 mmHg for 60 min ved å heve reservoaret flaskene koblet til Mikropipetter til en riktig høyde over segmentene. Trykk transdusere ligger mellom Mikropipetter og reservoaret flasker vil vurdere transmuralt press i MCA segmentet som angir når ønsket 50 mmHg trykket er oppnådd.
  18. Etter balanse perioden, øke intravascular trykket til 100 mmHg ved å angi reservoaret flaskene på ulike høyder.
  19. Levere 30 mM K+ (for bekreftelse av fartøyet sammentrekning) via det luminal perfusate og måle arteriell diameter. Ca 10 min senere levere 10-5 M Ach (for fartøyet dilatasjon) og måle arteriell diameter.
  20. Undersøke fartøyet dilatory reaksjoner. Lavere reservoaret flaskene å redusere intravascular trykket fra 100 mmHg til 80 mmHg. Tillate MCA segmentene til equilibrate for 10 min. mål arteriell diameter.
  21. Redusere intravascular trykket fra 80 mmHg til 60 mmHg. Tillate MCA segmentene til equilibrate for 10 min. mål arteriell diameter.
  22. Redusere intravascular trykket fra 60 mmHg til 40 mmHg. Tillate MCA segmentene til equilibrate for 10 min. mål arteriell diameter.
  23. Redusere intravascular trykket fra 40 mmHg til 20 mmHg. Tillate MCA segmentene til equilibrate for 10 min. mål arteriell diameter.

Representative Results

Gjennomsnittlig bTBI overtrykk for alle studie dyr var 20.9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). Gjennomsnittlig varighet rettende refleks (RR) undertrykkelse for rotter utsatt for ABS bTBI shockwave eksponering (5.37 min ±2.1) var ikke betydelig lengre (p = 0,36, bTBI vs humbug) enn i gruppen humbug (5.10 min ±1.6).

I begge 30 og 60 min humbug grupper økt MCA diameter over planlagt som intraluminal Press ble redusert fra 100 til 20 mmHg. Sammenlignet med de tilsvarende humbug gruppene, MCA dilatory reaksjoner til kontinuerlig pålagt reduksjon i intravascular trykket i observerte 30 min (p = 0,01, bTBI vs humbug) og 60 minutter (p = 0,02, bTBI vs humbug) ABS bTBI grupper var betydelig redusert etter eksplosjon eksponering (figur 5). En mer detaljert informasjon om disse resultatene, se Rodriguez et al.39.

Disse studiene viste det milde bTBI betydelig svekket cerebral kompenserende dilator Svar å redusert intravascular trykk i MCA segmenter 30 og 60 min etter milde bTBI mens mild sjokkbølgen nivåene brukt i disse studiene resulterte i aktivitetsvarighet undertrykkelse av RR (< 30 s) ligner i humbug-skadde rotter.

Statistiske analyser ble utført med programvare. Myogenic respons på endringer i intravascular Press ble vurdert ved å beregne prosentendring fra grunnlinjen (100 mmHg) for hvert nivå av intraluminal Press (80, 60, 40 og 20 mmHg). Kort Student t-tester ble brukt for å evaluere forskjellene mellom bTBI og humbug gruppe grunnlinjene. Forskjeller i MCA dilator svar mellom bTBI og humbug ble vurdert ved hjelp av en gjentatt veis variansanalyse (ANOVA) Dunnett flere sammenligninger test og en Bartlett test for lik varians.

På grunn av reduksjon i statistisk styrke som gjentatte tester, sammenligninger på hver bestemte bladspiss i MCA eksperimenter (f.eks, mellom 100 og 80 mmHg eller mellom 60 og 40 mmHg, etc.) ble ikke gjennomført. Betydning ble akseptert på p ≤ 0,05 nivå. Alle data i tekst, referansetabellen og figur uttrykkes som betyr ± standardfeil betyr (SEM).

Figure 5
Figur 5 : Effekter av bTBI på midten cerebral arteriell (MCA) Svar å redusert intravascular trykk. Dilator svar til progressiv reduksjoner i intravascular press utstilt svekket vasodilatory svar og ble betydelig redusert i 30 min (p = 0,01, bTBI vs humbug) og 60 minutter (p = 0,02, bTBI vs humbug) bTBI grupper (n = 6/gruppe) etter eksplosjon eksponering sammenlignet begge humbug grupper (n = 12). I begge 30 og 60 min humbug grupper økt MCA diameter over planlagt som intraluminal Press ble redusert fra 100 til 20 mmHg. Verdier tegnes som betyr ± SEM. *p < 0,05 vs humbug. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Som med alle protokoller og instruksjoner, er det viktig at enkelte trinn for protokollen i denne studien følges så nøyaktig og så nøyaktig som mulig. Etter den første intubasjon av rotte er det viktig å bekrefte at det puster jevnt og uten problemer. Feilaktig innsetting av endotracheal tube i spiserøret i stedet for luftrøret vil resultere i rasping, vanskelig åndedrag, blødning og den påfølgende fengende av rotte på grunn av mangelfull bedøvende levering til lungene.

Når taping mylar membran arkene over midten av åpningen mellom driveren og utvidelse kammer, er det viktig at arkene er sentrert og dekker hele åpne39,41. Misaligning ark over åpningen vil medføre luftlekkasje fra driveren kammer, en dråpe i nødvendige trykket for membran burst-potensielle og fornektelse av administrasjonen av eksplosjonen skaden. Riktig situating og sikkert passende tilbehør stål blokken mot hydraulisk håndpumpe blokk og driver kammeret er også viktig som er stramme hydraulisk hånden pumpen knotten og bekrefter driveren kammeret er fortsatt trykksatt uten lekkasjer. Riktig plassering av stål blokken kan driveren kammeret tett lukke mot ekspansjon kammeret, dermed skape obligatorisk segl behov over kammeret åpning av Mylar membran arkene og mellom driveren og utvidelse kammeret.

Under forberedelsene før MCA fartøyet utdrag, gassing PSS med nødvendige blanding av 21% O2 og 5% CO2 i en balanse av N2 equilibrates løsningen og forenkler necessitated nøytral fysiologisk pH nødvendig for en arbeider PSS løsning21,33,34.

Equilibrating segmentene ved konstant trykk for 60 min21,32,33,34 er svært obligatorisk som dette trinnet tillater segmentene til constrict følgende en maksimal dilatasjon vises under deres første primære pressurization. Denne hendelsen viser forekomsten av spontane tone, en egenskap som kan tyde på en sunn arterien32,33,34. Selv om diverse press nivåene for segmentet balanse har vært benyttet i andre studier33,34,42, denne studien og de av Mathew et al.21, Golding et al.35 og Golding et al.43 equilibrated segmentene på 50 mmHg. Mens equilibrating samlet segmenter hvor som helst mellom 40 mmHg – 100 mmHg32 tillater enkelte fleksibilitet og endringer for dette trinnet av protokollen, en time for balanse i parametrene trykk til slutt bekrefter sunn arteriene nødvendig for videreføring av eksperimentet.

Tar svært forsiktig når du fjerner hjernen fra skallen og venstre og høyre MCA segmentene fra sirkel av Willis mens beholder disse fartøyene er kanskje det mest kritiske trinnet av hele protokollen. Punktering hjernen med bein rongeurs, rive eller alvorlig strekking av segmentene under fjerning eller tilfeldigvis rykk fartøyene med kirurgisk spatelen når graving hjernen av skallen sluttfører til ødeleggelse av de høstes MCA, forårsaker ubrukelig segmenter og avviklet bruken av den arteries, til slutt renons hele eksperimentet for at dyr.

Om måling cerebral vaskulær svar på dilatory eller constrictory stimuli i MCA segmenter ex vivo samlet etter innvirkning eller eksplosjon TBI i vivo har gitt suksess, er metodene ikke uten sine problemer og/eller begrensninger. Kanskje en mer synlig kompleksiteten forbundet med å undersøke konsekvensene av TBI på blodsirkulasjonen i hjerne blodkar er koble eksplisitt effekten av TBI på skipene fra implisitt effektene oppstår på grunn av ulike og elementer som genereres av skadet hjernen44. Denne tenkelig forvirring kan potensielt være unngått ved å analysere ex vivo vasoconstrictory og vasodilatory reaksjoner av høstet, parfyme og/eller trykk MCA'S. I et forsøk på å redusere varigheten som cerebral arterier i vivo er utsatt for lokalt utladet parenchymal vasoactive materiale før døden, samling av cerebral arteriene direkte etter TBI kan minske graden av slike langvarig eksponering effekter. Ex vivo studier på isolerte MCA i tillegg presentere utsiktene til å analysere mekanismer for traumatisk vaskulære skader ved hjelp av bestemt reseptor agonister og antagonister eller anerkjente kjøretøy til vaskulære skader som ikke ville råd søkelys effektivt eller som diskriminerende vivo. Deretter kan dette ex vivo metoden kombineres med ex vivo-eksponering for narkotika å teste resulterende myogenic svar (vasokonstriksjon eller utvidelse av fartøyet segmentet på grunn av intravascular eller ekstravaskulær overvåking av narkotika eksponering).

Andre begrensninger omfatter omtrent eller utålmodig fjerne MCAS fra høstet hjernen som kan føre til tidlig rive av fartøyene, således renons bruken. I tillegg kan la mer enn noen få minutter gå mellom euthanasia av dyret, samling av fartøyene og deres plassering i PSS løsningen også oppheve sin levedyktighet. Når riktig utført og etterfulgt, kan er beskrevet i denne protokollen for å teste myogenic svar av MCAS når bTBI tar flere timer fra start til slutt og forsøk på å begrense tiden som kreves for suksess føre eksperimentelle feil. Men denne metoden er gjort i vitro og utnytter betydelig mer kostnadseffektiv instrumentering og utstyr enn i vivo høyoppløselig magnetisk resonans (MR) imaging45,46 eller konvensjonelle Doppler sonography / velocimetric teknikker47,48,49 som er også ansatt for fartøyet studier.

Disse funnene at milde bTBI skader er forbundet med nedsatt cerebral dilatory reaksjoner til redusert intravascular press kan være en funksjon av vasospasme6,7 og VSMC hyperconstriction50 tidligere rapportert etter eksplosjon eksponering slutt fører til forekomster som redusert relative cerebral perfusjon. I tillegg kunne blast-indusert skade hindrer normal dilatory reaksjoner er hjerne blodkar muligens fremme ytterligere reduksjoner i cerebral perfusjon kombinert med arteriell hypotensjon, en hyppig forekomst under kampoperasjoner.

Disse resultatene indikerer at bTBI resulterer i en endring til mekanismer tilrettelegge arterielle vaskulære kontroll. Akutt fase cerebral vaskulær svekkelse av arteriell myogenic svar reduksjoner i intravascular press for minst en time etter skade ble observert, forblir det hull i informasjon omkring den akutte fasen etter bTBI. Betydningen av å identifisere hva fysiske og biokjemiske mangler skader er cerebral blodkar og hjernen eksponering bTBI årsaker kan hjelpe bestemme hvor terapeutiske og/eller rehabiliterende suksess ganske umiddelbart etter skade.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Studier ble gjennomført som del av et team som støttes av Moody Project for Traumatisk Brain skader translasjonsforskning og pris W81XWH-08-2-0132 fra den amerikanske hæren medisinsk forskning og materiale kommando - Forsvarsdepartementet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Blast Simulator (ABS) Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. N/A Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries 
Adult, male, Sprague-Dawley rats  Charles River Laboratories N/A Experimental animals
Arteriograph Living Systems Instrumentation, Inc. Arteriograph Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter 
Bone rongeurs, large FST Fine Science Tools Friedman Rongeur Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small FST Fine Science Tools Boynton Rongeur Brain extraction from skull
CaCl2  Sigma Calcium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs 3M Foam Ear Plugs 1100 Class AL  Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine 
Glucose Sigma D-[+]-Glucose Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane  Piramal Enterprises Limited  Isoflurane, USP Anesthetic
KCl Sigma Potassium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO4•7H2O  Sigma Magnesium sulfate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps Buxton Biomedical Inc. Micro Tying Fcps, 180mm Brain extraction from skull
Mylar sheets Texas Art Supply Mylar Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl Sigma Sodium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO3 Sigma Sodium bicarbonate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture Ethicon 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter      
Scalpel blade #10 Bard-Parker 10 Stainless Steel Surgical Blade Brain extraction from skull
Surgical spatula Delmaks Surgico Cement Spatula  Brain extraction from skull
Thermometer  Physitemp Instruments, Inc.,  Thermalert Monitoring Thermometer Monitoring of experimental animal's core body temperature 
Volume ventilator  Harvard Apparatus, Inc. Small Animal Ventilator Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket Gaymar Industries, Inc.  Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad Maintenance of experimental animal's body temperature 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Blast-induced brain injury and posttraumatic hypotension and hypoxemia. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 877-887 (2009).
  2. Overgaard, J., Tweed, W. A. Cerebral circulation after head injury. Part 1: CBF and its regulation after closed head injury with emphasis on clinical correlations. Journal of Neurosurgery. 41 (5), 531-541 (1974).
  3. Wei, E. P., Dietrich, W. D., Povlishock, J. T., Navari, R. M., Kontos, H. A. Functional, morphological, and metabolic abnormalities of the cerebral microcirculation after concussive brain injury in cats. Circulation Research. 46 (1), 37-47 (1980).
  4. Wei, E. P., Kontos, H. A., Patterson, J. L. Dependence of pial arteriolar response to hypercapnia on vessel size. The American Journal of Physiology. 238 (5), 697-703 (1980).
  5. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Effects of experimental fluid percussion injury of the brain on cerebrovascular reactivity of hypoxia and to hypercapnia. Journal of Neurosurgery. 56 (3), 332-338 (1982).
  6. Bauman, R. A., et al. An introductory characterization of a combat-casualty-care relevant swine model of closed head injury resulting from exposure to explosive blast. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 841-860 (2009).
  7. Armonda, R. A., et al. Wartime traumatic cerebral vasospasm: recent review of combat casualties. Neurosurgery. 59 (6), 1215-1225 (2006).
  8. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
  9. Bouma, G. J., Muizelaar, J. P. Relationship between cardiac output and cerebral blood flow in patients with intact and with impaired autoregulation. Journal of Neurosurgery. 73 (3), 368-374 (1990).
  10. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Autoregulation of cerebral blood flow after experimental fluid percussion injury of the brain. Journal of Neurosurgery. 53 (4), 500-511 (1980).
  11. DeWitt, D. S., et al. Effects of fluid-percussion brain injury on regional cerebral blood flow and pial arteriolar diameter. Journal of Neurosurgery. 64 (5), 787-794 (1986).
  12. Engelborghs, K., et al. Impaired autoregulation of cerebral blood flow in an experimental model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 17 (8), 667-677 (2000).
  13. Mchedlishvili, G. Physiological mechanisms controlling cerebral blood flow. Stroke. 11 (3), 240-248 (1980).
  14. Kontos, H. A. Regulation of the cerebral circulation. Annual Review of Physiology. 43, 397-407 (1981).
  15. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21 (4), 299-332 (1999).
  16. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Traumatic cerebral vascular injury: the effects of concussive brain injury on the cerebral vasculature. Journal of Neurotrauma. 20 (9), 795-825 (2003).
  17. Paulson, O. B., Strandgaard, S., Edvinsson, L. Cerebral autoregulation. Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews. 2 (2), 161-192 (1990).
  18. Lang, E. W., Diehl, R. R., Mehdorn, M. Cerebral autoregulation testing after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: the phase relationship between arterial blood pressure and cerebral blood flow velocity. Critical Care Medicine. 29 (1), 158-163 (2001).
  19. Soehle, M., Czosnyka, M., Pickard, J. D., Kirkpatrick, P. J. Continuous assessment of cerebral autoregulation in subarachnoid hemorrhage. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 1133-1139 (2004).
  20. Roy, C. S., Sherrington, M. B. On the regulation of the blood-supply of the brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  21. Mathew, B. P., DeWitt, D. S., Bryan, R. M., Bukoski, R. D., Prough, D. S. Traumatic brain injury reduces myogenic responses in pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Neurotrauma. 16 (12), 177-186 (1999).
  22. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  23. Johnson, P. C., Henrich, H. A. Metabolic and myogenic factors in local regulation of the microcirculation. Federation Proceedings. 34 (11), 2020-2024 (1975).
  24. Johnson, P. C. The myogenic response and the microcirculation. Microvascular Research. 13 (1), 1-18 (1977).
  25. Atkinson, C. L., et al. Opposing effects of shear-mediated dilation and myogenic constriction on artery diameter in response to handgrip exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 119 (8), 858-864 (1985).
  26. Johnson, P. C. The myogenic response in the microcirculation and its interaction with other control systems. Journal of Hypertension. 7 (4), Supplement 33-39 (1989).
  27. Allen, S. P., Wade, S. S., Prewitt, R. L. Myogenic tone attenuates pressure-induced gene expression in isolated small arteries. Hypertension. 30 (2), Pt 1 203-208 (1997).
  28. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  29. Ahn, D. S., et al. Enhanced stretch-induced myogenic tone in the basilar artery of spontaneously hypertensive rats. Journal of Vascular Research. 44 (3), 182-191 (2007).
  30. Demay, J. G., Gray, S. D. Endothelium-dependent reactivity in resistance vessels. Progress in Applied Microcirculation. 8, 181-187 (1985).
  31. Nilsson, H., Sjöblom, N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 125, 429-435 (1985).
  32. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  33. Bryan, R. M., et al. Stimulation of α2 adrenoreceptors dilates the rat middle cerebral artery. Anesthesiology. 85, 82-90 (1996).
  34. Golding, E. M., et al. Endothelial-mediated dilations following severe controlled cortical impact injury in the rat middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (8), 635-644 (1998).
  35. Golding, E. M., Contant, C. F., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Temporal effect of severe controlled cortical impact injury in the rat on the myogenic response of the middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (11), 973-984 (1998).
  36. Golding, E. M., et al. Cerebrovascular reactivity to CO(2) and hypotension after mild cortical impact injury. The American Journal of Physiology. 277 (4), Pt 2 1457-1466 (1999).
  37. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  38. Yu, G. X., et al. Traumatic brain injury in vivo. and in vitro. contributes to cerebral vascular dysfunction through impaired gap junction communication between vascular smooth muscle cells. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 739-748 (2014).
  39. Rodriguez, U. A., et al. Effects of mild blast traumatic brain injury on cerebral vascular, histopathological and behavioral outcomes in rats. Journal of Neurotrauma. 35 (2), 375-395 (2018).
  40. Friedlander, F. G. The diffraction of sound pulses; diffraction by a semi-infinite plane. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences. 186 (1006), 322-344 (1946).
  41. Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
  42. Cipolla, M. J., Vitullo, L., McKinnon, J. Cerebral artery reactivity changes during pregnancy and the postpartum period: a role in eclampsia. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2127-2132 (2004).
  43. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers. Brain Research. 785 (2), 293-298 (1998).
  44. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Assessment of cerebral vascular dysfunction after traumatic brain injury. Animal Models of Acute Neurological Injuries II: Injury and Mechanistic Assessments. , Humana Press. New York. (2012).
  45. Degnan, A. J., et al. MR angiography and imaging for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic disease. American Journal of Neuroradiology. 33 (8), 1427-1435 (2012).
  46. Liu, Q., et al. Comparison of high-resolution MRI and CT angiography and digital subtraction angiography for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic steno-occlusive disease. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 29 (7), 1491-1498 (2013).
  47. Newell, D. W., Winn, H. R. Transcranial Doppler in cerebral vasospasm. Neurosurgery Clinics of North America. 1 (2), 319-328 (1990).
  48. Schenone, M. H., Mari, G. The MCA Doppler and its role in the evaluation of fetal anemia and fetal growth restriction. Clinics in Perinatolgy. 38 (1), 83-102 (2011).
  49. Morris, R. K., Say, R., Robson, S. C., Kleijnen, J., Khan, K. S. Systemic review and meta-analysis of middle cerebral artery Doppler to predict perinatal wellbeing. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 165 (2), 141-155 (2012).
  50. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12705-12710 (2011).

Tags

Nevrovitenskap problemet 146 TBI blast-indusert traumatisk brain skader (bTBI) blast-indusert Biografiske filmer primære eksplosjon skader cerebral vaskulær reaktivitet midterste cerebral arteriene (MCA) myogenic svar
Effekter av Blast-indusert Biografiske filmer på trykksatt gnager midt Cerebral arterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, … More

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter