Neuroscience

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794

¹Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, ²National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

Zebrafish è un sistema di modello che ha molte caratteristiche importanti, compreso chiarezza ottica, rapido sviluppo esterno e, di particolare importanza nel campo dell'udito e l'equilibrio, situato esternamente cellule ciliate sensoriali. Questo articolo descrive come transgenici zebrafish può essere utilizzato per analisi sia delle cellule cigliate mechanosensation e funzione presinaptica in toto.

Abstract

Cellule ciliate sensoriali sono meccanorecettori trovati nell'orecchio interno che sono necessari per l'udito e l'equilibrio. Le cellule ciliate sono attivate in risposta a stimoli sensoriali che meccanicamente deviare protrusioni apicali chiamati pacchi dei capelli. Deflessione apre canali di meccanotrasduzione (MET) in pacchi dei capelli, che conduce ad un afflusso di cationi, compreso il calcio. Questo afflusso di catione depolarizza la cellula e apre i canali tensione-gated del calcio basally situati presso la presynapse della capelli-cellula. Nei mammiferi, le cellule ciliate sono racchiusi nell'osso ed è difficile da valutare funzionalmente queste attività in vivo. Al contrario, larvale zebrafish sono trasparenti e possiedono un organo situato esternamente di linea laterale che contiene le cellule ciliate. Queste cellule ciliate sono funzionalmente e strutturalmente simili ai mammiferi le cellule ciliate e funzionalmente valutabili in vivo. Questo articolo viene descritta una tecnica che utilizza un indicatore di calcio codificato geneticamente (GECI), GCaMP6s, per misurare stimolo-evocato calcio segnali nelle cellule ciliate di zebrafish linea laterale. GCaMP6s può essere utilizzato, insieme con rappresentazione confocale, per misurare i segnali di calcio in vivo al vertice e alla base delle cellule ciliate linea laterale. Questi segnali forniscono una lettura in tempo reale a quantificabile delle due attività di calcio mechanosensation - e presynapse-dipendente all'interno di queste cellule ciliate. Questi segnali di calcio anche forniscono importanti riguardanti funzionale come cellule ciliate rilevare e trasmettere stimoli sensoriali. Nel complesso, questa tecnica genera dati utili sulle variazioni relative nelle attività del calcio in vivo. È meno adatta per la quantificazione della magnitudine assoluta di cambiamenti di calcio. Questa tecnica in vivo è sensibile agli artefatti da movimento. Una quantità ragionevole di pratica e abilità sono necessari per il corretto posizionamento, immobilizzazione e stimolazione delle larve. In definitiva, quando correttamente eseguita, il protocollo descritto in questo articolo fornisce un modo potente per raccogliere preziose informazioni circa l'attività delle cellule ciliate nei loro Stati naturali, completamente integrati all'interno di un animale vivo.

Introduction

Formazione immagine funzionale del calcio è un potente strumento che può essere utilizzato per monitorare l'attività di molte cellule contemporaneamente¹. In particolare, la formazione immagine del calcio utilizzando indicatori codificato geneticamente calcio (GECIs) ha dimostrata di essere vantaggioso perché GECIs può essere espressa in tipi cellulari specifici e localizzati subcellularly². In ricerca in neuroscienza, queste caratteristiche hanno reso imaging di calcio utilizzando GECIs un potente metodo per definire i modelli di attività all'interno di reti neuronali sia misurare l'afflusso del calcio alle singole sinapsi³^,⁴. Approfittando di queste caratteristiche, un recente studio usato microscopia confocale e GECIs per monitorare l'attività subcellulare all'interno delle collezioni di cellule ciliate sensoriali⁵.

Le cellule ciliate sono meccanocettori che rilevare stimoli sonori e vestibolari nell'orecchio interno e movimento dell'acqua locale del sistema di linea laterale in acquatica vetebrates⁶^,⁷. Le cellule ciliate sono spesso bersaglio di danni o mutazioni genetiche che provocano la forma più comune di perdita della capacità uditiva in esseri umani conosciuti come perdita dell'udito neurosensoriale⁸^,⁹. Pertanto, è fondamentale per capire come queste funzione di cellule al fine di capire come trattare e prevenire la perdita dell'udito. Per funzionare correttamente, le cellule dei capelli utilizzano due strutture specializzate chiamate mechanosensory-capelli bundle e nastri sinaptiche per rilevare e trasmettere stimoli, rispettivamente. Pacchi dei capelli si trovano all'apice delle cellule ciliate e sono costituiti principalmente da sporgenze fine, capelli-come noti come stereocilia (Figura 1A). In cellule ciliate vestibolari e linea laterale, ogni fascio di capelli ha anche un kinocilium lungo singolo (Cilio unica vera della cella), che può estendersi molto di sopra di stereocilia (Figura 1A). Stimoli che mechanosensory deviano pacchi dei capelli, e deflessione mette tensione sulle sinergie chiamati "punta-link" che stereocilia¹⁰di interconnessione. Questa tensione apre canali di meccanotrasduzione (MET) situati in stereocilia, risultante in un afflusso apicale dei cationi, tra cui calcio¹¹^,¹². In definitiva, questa attività apicale depolarizza la cellula ciliata e apre i canali tensione-gated del calcio (Ca_v1.3) alla base della cella. Canali del CA_v1.3 si trovano adiacenti a nastri sinaptiche, una struttura presinaptica che attacchi vescicole alle zone attive. Afflusso del calcio basale attraverso canali del Ca_v1.3 è necessaria per la fusione della vescicola, neurotrasmissione e attivazione di neuroni afferenti¹³^,¹⁴.

Per molti anni, sono stati utilizzati tecniche elettrofisiologiche come cellule intere patch di bloccaggio per sondare le proprietà funzionali delle cellule ciliate in molte specie, tra cui zebrafish¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^, ¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Queste registrazioni elettrofisiologiche sono stati particolarmente preziose nei campi dell'udito e l'equilibrio, perché possono essere usati per ottenere misurazioni estremamente sensibili da singole cellule sensoriali, cui scopo è quello di codificare stimoli estremamente veloci sopra un vasta gamma di frequenze e intensità²¹^,²². Purtroppo, le registrazioni della intero-cellula non possono misurare l'attività delle popolazioni delle cellule ciliate. Per studiare l'attività delle popolazioni di cellule nella linea laterale di zebrafish, potenziali microfonici e afferenti i potenziali di azione sono stati utilizzati per misurare le proprietà di risposta postsinaptica di singoli neuromasts^{23 e sommati mechanosensitive} ^,²⁴. Purtroppo, né cellule intere registrazioni né misure potenziali di campo locale hanno la risoluzione spaziale per individuare la cui attività è in corso all'interno di singole celle o misurare l'attività di ogni cella all'interno di una popolazione. Più recentemente, calcio coloranti e GECIs sono state impiegate per bypassare queste sfide²⁵^,²⁶.

In zebrafish, GECIs hanno dimostrato di essere un approccio potente per esaminare la funzione di cellula ciliata dovuto la relativa facilità di creazione di zebrafish transgenici e la chiarezza ottica di larve²⁷. Nelle larve di zebrafish, cellule ciliate presenti nell'orecchio interno così come il sistema della linea laterale. La linea laterale è composto da cluster di rosetta-come delle cellule ciliate chiamate neuromasts che vengono utilizzati per rilevare i cambiamenti locali in movimento dell'acqua (Figura 1). La linea laterale è particolarmente utile perché è situata esternamente lungo la superficie del pesce. Questo accesso ha reso possibile stimolare le cellule ciliate e misurare segnali di calcio otticamente in larve intatte. Nel complesso, la facilità di transgenesi, trasparenza delle larve e l'accesso senza pari delle cellule ciliate linea laterale hanno reso zebrafish un prezioso modello per studiare l'attività delle cellule ciliate in vivo. Si tratta di un significativo vantaggio rispetto ai sistemi di mammiferi in cui le cellule ciliate sono circondate da strutture ossee dell'orecchio interno. Questa mancanza di accesso ha reso molto difficile acquisire misure funzionali in vivo delle cellule ciliate dei mammiferi.

Il protocollo descritto qui viene descritto come monitorare le modifiche di canale - e presynapse-dipendente MET di calcio all'interno di singole cellule ciliate e tra le celle all'interno di neuromasts in zebrafish larvale. Questo protocollo utilizza una linea di zebrafish transgenici stabilito che esprime un GCaMP6s membrana localizzato sotto il controllo della capelli-cellula specifica myosin6b promotore²⁸. Questa localizzazione di membrana posizioni GCaMP6s per rilevare l'afflusso del calcio attraverso canali ionici localizzati nelle membrane plasmatiche che sono critici per la funzione delle cellule cigliate. Ad esempio, GCaMP6s membrana localizzato può rilevare calcio afflusso attraverso MET canali in pacchi dei capelli apicale e attraverso Ca_V1,3 canali vicino a nastri sinaptiche alla base della cella. Questo contrasta con l'utilizzo di GECIs localizzata nel citosol, come GECIs citosolico di rilevare segnali di calcio che sono una combinazione di attività_V1.3 canale MET e Ca, nonché a contributi di calcio da altre fonti (ad esempio, negozio rilascio). Questo protocollo viene descritto come immobilizzare e paralizzare GCaMP6s larve transgeniche prima di formazione immagine. Viene quindi descritto come preparare e usare un getto di fluido per deviare i fasci di capelli per stimolare le cellule ciliate linea laterale in modo controllato e riproducibile. Vengono presentati dati rappresentativi che possono essere raggiunto usando questo protocollo. Esempi di dati che rappresentano artefatti di movimento sono anche presentati. Esperimenti di controllo che vengono utilizzati per verificare i risultati ed escludere gli artefatti sono descritti. Infine, è descritto un metodo per visualizzare segnali di calcio spaziale nel software Fiji. Questa analisi di Fiji è adattata da metodi di visualizzazione stabiliti in precedenza sviluppati utilizzando MATLAB⁵. Nel complesso, questo protocollo delinea una tecnica di preparazione potente che utilizza GECIs in zebrafish larvale per misurare e visualizzare la dinamica del calcio capelli-cellula in vivo.

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di uso animale presso il National Institutes of Health, protocollo di studio sugli animali #1362-13.

Nota: Questo protocollo prende circa 0.5-1 h per completare senza interruzioni se le soluzioni e le attrezzature sono preparati e impostare in anticipo. Questo protocollo è ottimizzato per Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)⁵^,²⁹ zebrafish larve al momento della post-fecondazione 3 – 7 giorni (dpf). Questa linea transgenica esprime un GCaMP6s membrana localizzato (zebrafish codone-ottimizzato) in particolare in tutte le cellule ciliate di zebrafish. Prima di formazione immagine, le larve vengono generate nel buffer dell'embrione (E3) in condizioni standard. Fare riferimento alla Tabella materiali per i numeri di catalogo di tutte le attrezzature e i farmaci necessari per eseguire questo protocollo.

1. preparazione delle soluzioni

Preparare 1 mL di α-bungarotossina (125 µM), che viene utilizzato per paralizzare le larve di zebrafish durante la formazione immagine funzionale.
1. Aggiungi 968.6 µ l di acqua ultrapura sterile e 33,4 µ l di rosso fenolo a 1 mg di α-bungarotossina (intera bottiglia). Rendere le aliquote di 100 µ l e conservarli a-20 ° C.
  Attenzione: Indossare guanti e fare i preparativi nella cappa quando si maneggia polvere α-bungarotossina. Quando la soluzione di α-bungarotossina, si consigliano anche i guanti.
Preparare 1 L di tampone di 60 x embrione (E3).
1. Aggiungere 17,2 g di NaCl e 0,76 g di polvere di KCl 954,4 mL di acqua ultrapura.
2. Aggiungere alla soluzione 19,8 mL di 1 M CaCl₂, 19,8 mL di 1 M MgSO₄e 6 mL di tampone HEPES 1 M. Conservare la soluzione di riserva x E3 60 a 4 ° C fino a 6 mesi.
Preparare 10 L di 1 x E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl₂0,33 mM MgSO₄, pH 7,2), che è una soluzione che le larve vengono propagate nella prima formazione immagine funzionale.
1. Aggiungere 167 mL della soluzione madre di 60 x E3 in 10 L di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di x E3 1. Conservare la soluzione di x E3 1 a temperatura ambiente (TA) per fino a 6 mesi.
Preparare il tampone di un neurone (NB) (140 mM NaCl; 2 mM KCl; 2 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 10 mM di tampone HEPES, pH 7,3), che viene utilizzato per immergere le larve durante l'imaging funzionale.
Nota: 1 x E3 può essere utilizzato anche per l'imaging funzionale, ma le risposte sono più robusti e affidabili in NB
1. Combinare 28 mL di 5 M di NaCl, 2 mL di KCl 1 M, 2 mL di 1 M CaCl_2,1 mL di 1 M MgCl₂e 10 mL di tampone HEPES 1 M con 957 mL di acqua ultrapura. Portare il pH a 7,3 con 1 M NaOH.
2. Filtro sterilizzare. Conservare a 4 ° C fino a 1 mese.
  Nota: Portare a RT prima di utilizzare la soluzione.
Preparare il brodo di MS-222 (tricaina, 0,4%), che viene utilizzato per anestetizzare le larve.
1. Sciogliere 400 mg di sale di methanesulfonate 3-aminobenzoate etilico e 800 mg di Na₂HPO₄ in 100 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7. Conservare a 4 ° C.
2. Utilizzare 0,04% MS-222 da anestetizzare le larve durante l'iniezione di immobilizzazione e α-bungarotossina.

2. preparazione di Imaging camera e perni

Preparare la camera imaging (Figura 2A). Applicare un sottile strato di grasso al silicone vuoto alta sul fondo della camera di aspersione lungo i bordi della piazza a cui aderirà il vetrino coprioggetti. Non lasciare spazi vuoti nel grasso. Premere con forza verso il basso intorno ai bordi del coprivetrino per sigillarlo alla camera di imaging. Pulire il grasso in eccesso assente.
Nota: Una siringa da 5 mL con una punta di una micropipetta 200 µ l è consigliata per applicazione di grasso.
Preparare l'incapsulante in silicone per riempire la camera. Mescolare un rapporto di 10:1 (in peso) di base per agente indurente. Mescolare accuratamente, ma delicatamente, utilizzando una punta di una micropipetta per creare bolle di minime.
1. Versare l'incapsulante in silicone sul coprioggetto apposto in modo che è livello con la superficie della camera. Circa 3 g di incapsulante riempirà la camera.
2. Attentamente tocca la camera contro una superficie piana, tenendolo orizzontale, o per rimuovere o tirare bolle al bordo della camera di usare una punta di una micropipetta (sotto un microscopio stereoscopico).
3. Posizionare la camera in un forno di laboratorio durante la notte a 60 – 70 ° C. Posizionare la camera all'interno di una finestra ventilata per garantire che aria calda non soffia direttamente sull'incapsulante per evitare di creare increspature.
Utilizzare una pinzetta e filo di tungsteno per moda i perni utilizzati per immobilizzare le larve attraverso la testa e la coda (Figura 2B1) sull'incapsulante indurito.
1. Per spilli con testa, tenere un pezzo di filo di tungsteno 0,035 mm in una mano sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzando una pinzetta in altra mano, piegate il filo 1mm fino dall'estremità a 90°. Scambiare il forcipe per forbice e taglio 1 mm dopo la curva per creare il pin.
2. Ripetere il passaggio 2.3.1 utilizzando un filo di 0,025 mm per fare coda perni, ma lasciare 0,5 mm di filo su entrambi i lati della curva. Utilizzare pinze per inserire i perni nell'incapsulante indurito sulla camera (per stoccaggio).

3. preparazione degli aghi per paralisi e stimolazione

Preparare gli aghi per iniezione cuore utilizzando tubi capillari in vetro con un filamento. Tirare gli aghi di un diametro interno di 1 – 3 µm (Figura 2C).
Preparare gli aghi getto fluido utilizzando tubi capillari in vetro senza un filamento. Tirare aghi con una punta sottile, lunga che può essere rotto per il diametro della punta corretta.
1. Rompere la punta sottile, lunga dell'ago fluido-jet strofinando perpendicolarmente contro un altro getto di fluido ago o una piastrella di ceramica appena sopra dove la punta dell'ago può essere piegata per creare un diametro interno di 30 – 50 µm [Figura 2C (immagine centrale) e Figura 3 A2]. Assicurarsi che la rottura è anche attraverso la punta (Figura 2C, immagine centrale) e non frastagliate o troppo grande (Figura 2C, immagine a destra) per garantire anche e flusso preciso fluido durante la stimolazione delle cellule cigliate.
  Nota: Un lucidatore dell'ago può essere utilizzato per correggere frastagliate pause.

4. pinning e immobilizzare Larva Imaging camera

Il bagno di una larva di Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) a circa 1 mL di tampone di E3 contenente 0,04% MS-222 per 1 – 2 min sulla superficie del silicone incapsulante della imaging camera fino a quando la larva diventa immobile o non risponde al tatto.
1. Sotto un microscopio stereoscopico, è possibile posizionare la larva al centro della camera di aspersione in modo che si trova sul suo lato contro l'incapsulante in silicone.
  Nota: Per coerenza, montare sempre le larve sullo stesso lato (ad es., lato destro verso il basso, lato sinistro verso l'alto) (Figura 2B1).
Utilizzando una pinzetta, portare un pin di 0,035 mm testa giù perpendicolarmente la larva e la camera. Inserire il perno di testa tra l'occhio e la vescicola otica e giù nell'incapsulante (figure 2B1 e 2B2). Utilizzare un secondo set di pinze per stabilizzare la larva lungo il suo lato dorsale o ventrale mentre pinning. Assicurarsi che la parte orizzontale del perno contatti la larva e non premere completamente nell'incapsulante. Il pin di angolo ventralmente (Figura 2B1) o rivolta leggermente verso l'anteriore del pesce per evitare di interferire con iniezione successiva del cuore e l'imaging delle cellule cigliate.
1. Utilizzando le pinze, inserire un pin di coda di 0,025 mm la notocorda quanto più vicino possibile all'estremità della coda (Figura 2B1).
  Nota: Fare attenzione a evitare che allunga la larva. Pin la larva piatta. Gli occhi devono essere sovrapposti (2 figuraB1). Questo è molto importante per la facilità di iniezione di cuore (Figura 2B2-B2', passaggio 5), facilitando un aereo imaging desiderabile (Figura 1B1-B2 cm, passaggi 8 e 9) e quantificare l'intensità dello stimolo fluido-jet ( Figura 3A3, passaggio 7).

5. iniezione di α-bungarotossina nella cavità del cuore per paralizzare la Larva

Nota: Indossare guanti quando α-bungarotossina.

Centrifugare brevemente prima dell'uso per evitare l'intasamento dell'ago per iniezione cuore α-bungarotossina aliquota.
1. Recupero informazioni 3 µ l di soluzione di α-bungarotossina in un ago per iniezione cuore utilizzando un puntale di caricamento del gel. Caricare la soluzione in modo uniforme fino alla punta con nessun bolle.
2. Inserire l'ago per iniezione cuore in un supporto di pipetta attaccato ad un micromanipolatore manuale. Sotto un microscopio stereoscopico, posizionare l'ago in modo allineato perpendicolarmente all'asse A-P delle larve appuntate e anestetizzate, rivolta verso il basso con un angolo di circa 30°.
3. Collegare il supporto per pipetta per l'iniettore di pressione. Applicare le seguenti impostazioni suggerite: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s e Pcompensation = 5 hPa. Iniettare la soluzione per verificare se la punta dell'ago è un brevetto di un bolo.
4. Cerca un piccolo soffio della soluzione rosso (da rosso fenolo) per lasciare la punta dell'ago. Se nessun colore rosso è visto, molto delicatamente raschiare la punta dell'ago contro il bordo di un perno e riprovare fino a quando l'ago è brevetto. In alternativa, tirare un ago con una maggiore apertura di punta.
Fare avanzare l'ago verso il cuore fino a toccare la pelle di fuori del cuore (Figura 2B2). Premere l'ago in larva e guardare per il rientro della cella del pigmento sulla pelle davanti al cuore per assicurarsi che l'ago è posizionato nel piano corretto rispetto la larva (Figura 2B2').
1. Fare avanzare l'ago di ulteriormente fino a che trafigge la pelle ed entra nella cavità del cuore. Tirare l'ago leggermente indietro. Iniettare un bolo di α-bungarotossina nella cavità del cuore. Aspetto per inflazione della cavità del cuore o per tintura rossa entrando nella cavità.
Sciacquare delicatamente la larva 3 volte con 1 mL di NB per rimuovere residui MS-222. Mai rimuovere tutto il fluido. Mantenere la larva in circa 1 mL di NB sulla camera di aspersione.
Nota: Assicurare quel battito cardiaco larvale e flusso sanguigno rimangono robusti dopo iniezione pinning e cuore e in tutto l'intero esperimento di formazione immagine.

6. preparazione del microscopio e installazione di fluido-jet

Assemblare un microscopio confocale verticale utilizzando i componenti descritti nella Tabella materiali: un microscopio confocale con un 488 nm laser e filtri appropriati, software di microscopio per controllare e coordinare la formazione immagine e stimolazione, 10 x aria obiettivo, obiettivo 60x acqua, piezo-Z scanner oggettivi (per z-stack), macchina fotografica ad alta velocità, adattatore camera circolare, tavolino motorizzato e adattatore Inserisci fase. Fare riferimento a Zhang et al.²⁹ per opzioni aggiuntive e istruzioni sulle configurazioni di microscopio.
Assemblare il getto fluido composto da 3 componenti principali: un vuoto e pressione pompa, morsetto di pressione ad alta velocità e fase testa (anche descritto nella tabella materiali). Utilizzare il morsetto di pressione ad alta velocità per controllare i tempi e la durata di scarico pressione o vuoto fuori dello stadio di teste e nella pipetta fluido-jet.
1. Collegare l'uscita della fase a testa per il getto di liquido pipetta titolare tramite pareti spesse tubazione del silicone.

7. allineamento della Larva e fluido-jet

Nota: Ci sono 3 piani di interesse all'interno di ogni neuromast: (1) le punte dei capelli bundle (Figura 3A3: può, utilizzato per misurare l'intensità dello stimolo); (2) il piano MET fascio di capelli (Figura 1B1-B1': la base dei fasci capelli apicale dove vengono rilevati segnali di calcio MET-canale-dipendente); e (3) l'aereo sinaptica (Figura 1B2-B2': dove vengono rilevati segnali di calcio presinaptico alla base della cellula ciliata). Questi aerei sono descritti nella Figura 1A.

Recupero informazioni 10 µ l di NB in un ago di liquido-jet correttamente rotto (dal punto 3.2) usando un punta di caricamento del gel. Caricare la soluzione in modo uniforme fino alla punta con nessun bolle. Inserire l'ago nel dispensare titolare collegato il micromanipolatore motorizzato.
Posizionare la camera di aspersione in un adattatore di camera circolare sul tavolino del microscopio.
Nota: Per coerenza, posizionare sempre la larva nello stesso orientamento (ad es., la camera contenente la larva con suo posteriore verso il getto fluido e ventrali lato rivolto verso lo sperimentatore).
1. Spostare il tavolino motorizzato in modo che la larva è al centro del campo visivo. Girare l'adattatore camera circolare in modo che l'asse A-P della larva è all'incirca allineato con la traiettoria dell'ago fluido-jet.
2. Usando il contrasto di interferenza di luce e differenziale trasmessa (DIC), la larva di mettere a fuoco e centrarlo nell'ambito dell'obiettivo 10x. Sollevare l'obiettivo 10x.
Utilizzando il micromanipolatore motorizzato, portare l'ago di liquido-getto verso il centro del campo visivo così è illuminato da luce trasmessa e a malapena toccando la soluzione NB.
1. Abbassare l'obiettivo 10x. Concentrarsi sulla larva per confermare la sua posizione. Concentrarsi fino a trovare l'ago fluido-jet. Spostare l'ago di liquido-jet con il micromanipolatore in assi x e y fino a quando non è in una posizione parallela al lato dorsale del pesce.
2. Concentrarsi nuovamente sulla larva. Portare l'ago verso il basso nell'asse z. Posizionare l'ago lungo il lato dorsale del pesce e ~ 1 mm dal corpo (Figura 3A1).
3. Muovere con cautela l'adattatore camera circolare (se necessario) per garantire che l'ago del fluido-jet è allineato lungo la linea mediana A-P della larva (Figura 3A1).
4. Spostare il tavolino motorizzato per posizionare il neuromast di interesse nel centro del campo visivo. Tenere la punta dell'ago fluido-getto lungo il lato dorsale del pesce. Non toccare la punta dell'ago fluido-getto per la larva o la superficie della camera.
Passare a 60 x diametro obiettivo di acqua. Garantire che l'obiettivo sia immerso nella soluzione NB. Uso la messa a fuoco micrometrica da individuare mediante un neuromast trasmesso luce e ottica DIC.
Nota: Questa configurazione è destinata a stimolare neuromasts lungo la principale linea laterale posteriore. Cellule ciliate all'interno di questi neuromasts rispondere al flusso del fluido diretto anteriore o posteriore. Vedi Chou et al³¹ per una mappa accurata della neuromast sensibilità fluido all'interno del sistema della linea laterale.
1. Posizionare l'ago di liquido-jet con il micromanipolatore affinché sia 100 µm dal bordo esterno del neuromast (Figura 3A2).
  Nota: Scegliere neuromasts che offrono una vista chiara verticistica (figure 1B1'-B2' e Figura 3A3) piuttosto che vista lato-ad angolo (Figura 1C1-C2). Una visione chiara top-down consente simultaneo di tutti i pacchi di apicale dei capelli in un unico piano ottico di imaging o imaging delle zone sinaptiche in meno aerei ottici (Figura 3A3).
2. Concentrarsi fino alle punte dei capelli-fasci apicale (può) (Figura 1A, figure 3A2 e 3A3). La base dell'ago getto di liquido deve essere a fuoco in questo piano.
Impostare il morsetto di pressione ad alta velocità dal manuale modalità esterna per ricevere input dal software di imaging.
1. Azzerare il morsetto di pressione ad alta velocità premendo il tasto "zero". Utilizzare la manopola del setpoint per impostare la pressione di riposo leggermente positiva (~ 2 mmHg). Confermare l'output riposo del morsetto ad alta velocità pressione utilizzando un manometro PSI associato all'output della fase testa.
  Nota: Impostare una pressione leggermente positiva a riposo per evitare l'assorbimento graduale di fluido nell'ago getto di fluido nel tempo. Se il liquido entra il tubo collegato al fluido-getto e raggiunge la fase testa, può danneggiare l'apparecchiatura.
2. Determinare la pressione necessaria per stimolare i pacchi dei capelli. Utilizzare un ingresso di V 0,125 o 0,25 (6.25 e 12,5 mm Hg) per 200 – 500 ms per applicare uno stimolo test (Figura 3A3-A3 cm).
  Nota: Il morsetto di pressione ad alta velocità converte una tensione in ingresso (da software o altri dispositivi che si connettono alla porta BNC sulla porta ad alta velocità pressione morsetto comando) in pressione viene scaricata dalla fase di testa e in definitiva, l'ago di getto di fluido (1.0 V = 50 mmHg, mentre -1,0 V =-50 mmHg). In questa configurazione (Vedi punto 7.2) positivo pressione (push) devia pacchi dei capelli verso l'anteriore, e pressione negativa (pull) devia pacchi dei capelli verso il posteriore.
3. Con luce trasmessa e DIC ottiche insieme a una barra di scala, misurare la distanza di deviazione dagli stimoli 6.25 e 12,5 mm Hg delle punte dei pacchi dei capelli, la può (Figura 1A e figure 3A3-3 cm). Scegliere una pressione che sposta i fasci (come 1 unità coesa) una distanza di circa 5 µm (Figura 3A3 cm). Garantire che le punte dei può rimangano a fuoco tutto il tempo.
4. Spostare il getto fluido ± 25 µm lungo l'asse A-P della larva di trovare una distanza e una pressione che devia le punte di può 5 µm.
  Nota: Utilizzando GCaMP6s in larve 3 – 7 dpf, una deviazione di 5 µm dovrebbe realizzare vicino saturando segnali di calcio GCaMP6s e non dovrebbe danneggiare strutture fascio di capelli apicale (Figura 3A3 cm). Più piccole distanze di spostamento possono essere utilizzati per fornire stimoli non saturare (Figura 3A3'). Distanze di spostamento > 10 µm sono difficili da stimare ( Figura 3A3 ' ') e può essere dannoso nel corso del tempo. Saturazione del segnale dipende dall'età del neuromast (e kinocilial altezza) così come l'indicatore utilizzato. Controllare la pervietà dell'ago getto di fluido in ogni direzione (pressione/push e vuoto/pull) periodicamente durante la formazione immagine. Getto di fluido aghi intasano facilmente e perdono la pervietà vuoto, ma mantengono la pervietà pressione residua. È possibile utilizzare DIC ottica e un breve test stimolo in ogni direzione per controllare la pervietà fluido-jet.
5. Concentrare il campione in aereo di interesse (ad es., la base dei fasci capelli apicale o alla base della cellula ciliata nel piano sinaptico; Figura 1 B1-B2').

8. imaging acquisizione procedura opzione 1: Piano singolo acquisizione

Nota: Tutte le immagini descritte in questo protocollo viene eseguita a TA.

Impostare il software di imaging di acquisire un'acquisizione di 80-telaio streaming o continuo con una cattura ogni 100 ms per raggiungere un frame rate di 10 Hz.
Impostare il guadagno, l'apertura e potere del laser per ottimizzare il rilevamento del segnale, ma evitare la saturazione, photobleaching e rumore. Impostazioni di esempio per un Opterra/SFC sono come segue: potere del laser di 488 nm: 50 (piano di MET fascio di capelli), 75 (sinaptica aereo); fessura di 35 µm; guadagno = 2,7; Guadagno di EM = 3900.
Nota: Applicare 2 X binning se i segnali sono troppo deboli o troppo rumoroso o avere eccessiva photobleaching. 2 x binning volontà migliorare segnale rilevazione al costo di risoluzione spaziale.
Selezionare uno stimolo a consegnare durante il 80-frame (8 s) acquisizione dopo fotogramma 30, a 3 s.
Nota: Alcuni stimoli di esempio sono i seguenti: 200 ms (+ o - 0,25 V) fino a 2 s (+ o - 0,25 V) passo in direzione anteriore o posteriore per determinare la sensibilità direzionale di ogni cellula ciliata; 2 s, onda quadra 5 Hz (0.25 V per 200 ms, -0.25 V per 200 ms, ripetuti 5 volte) per stimolare tutti i capelli cellule simultaneamente. Una pressione positiva (anteriore stimolo) attiverà la metà delle cellule ciliate. Una pressione negativa (stimolo posteriore) attiverà l'altra metà delle cellule ciliate. Assicurarsi che il software di stimolo o dispositivo restituisce il morsetto di pressione torna a 0 V dopo lo stimolo è terminato.
Risposte a misura mechanosensitive calcio. Concentrarsi sulla base dei fasci capelli apicale (figure 1A e 1B1-B1') e avviare l'acquisizione di immagini.
Nota: Se il neuromast è visto chiaramente dall'alto verso il basso (Figura 1B1-B1'), tutti i pacchi di apicale dei capelli possono essere imaged simultaneamente in un unico piano.
Misurare le risposte del calcio presinaptico. Messa a fuoco alla base delle cellule ciliate (figure 1A e 1B2-B2') e avviare l'acquisizione di immagini.
Nota: Se il neuromast è visto chiaramente dall'alto verso il basso (Figura 1B2-B2'), i piani di formazione immagini presinaptici di tutte le cellule ciliate possono essere acquisiti in 2 – 3 aerei set di 2 µm a pezzi. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] pesci transgenici possono essere utilizzato per identificare e individuare i siti di calcio voce²⁹e nastri presinaptici.

9. imaging acquisizione procedura opzione 2: Acquisizione multi-piano

Sintonizzare il piezo-Z fissato all'obiettivo 60x per acquisizioni veloce (12 – 18 ms). Assicurarsi che siano selezionate le impostazioni di velocità max.
Creare un'acquisizione di Z-stack utilizzando un piezo-Z. Acquisire l'attività MET di fascio di capelli in 5 aerei con passo di 0,5 µm. acquisire i segnali presinaptici in 5 aerei con passo di 1 µm.
Impostare il frame rate a 10 Hz. Ogni fotogramma sarà catturato ogni 20 ms e ogni Z-stack ogni 100 ms.
Impostare l'acquisizione per 400 fotogrammi o 80 Z-stack a 10 Hz per un 8 s acquisizione in streaming.
Impostare la potenza del laser, l'apertura e guadagno per ottimizzare il rilevamento del segnale, ma evitare la saturazione, photobleaching e rumore. Impostazioni di esempio per un sistema di Opterra/SFC sono come segue: potere del laser di 488 nm: 75 (piano di MET fascio di capelli), 125 (sinaptica aereo); fessura di 35 µm; guadagno = 2,7; Guadagno di EM = 3900.
Nota: Applicare 2 X binning se il segnale è troppo debole,rumorosa, o avere eccessiva photobleaching. 2 x binning volontà migliorare segnale rilevazione al costo di risoluzione spaziale.
Selezionare uno stimolo a consegnare durante l'acquisizione a partire fotogramma 150, dopo 3 s.
Continuare il protocollo, come descritto in precedenza per l'acquisizione su un unico piano, ma centro Z-stack nei piani basali o apicali (passaggi 8.4 e 8.5).

10. controllo: Blocco farmacologico di segnali di calcio tutto evocati

Nota: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etano-N, N, N′, N′-tetraacetico acido) il trattamento è un controllo critico quando si stabilisce in primo luogo questo protocollo.

Dopo aver completato i passaggi 8 o 9, sostituire il NB con 1 mL di NB contenente 5 mM BAPTA fendere i link punta necessari a cancello apicale MET canali che si trovano in pacchi dei capelli.
Incubare per 10 – 20 min a RT.
Lavare via BAPTA 3 volte con 1 mL di NB
Ripetere il passaggio 8 o 9. Dopo il trattamento BAPTA, non ci dovrebbe essere nessun cambiamento in GCaMP6s fluorescenza in risposta alla stimolazione di getto di fluido nell'aereo sinaptica o pacchi dei capelli apicale. Se le modifiche in GCaMP6s fluorescenza permanenti, questi non sono segnali di calcio vero e possono essere artefatti da movimento.

11. controllo: Blocco farmacologico di segnali di calcio presinaptico (opzionali)

Dopo aver completato i passaggi 8 o 9, sostituire il NB con NB contenente 10 µM Isradipina con 0,1% di dimetilsolfossido (DMSO) per bloccare i canali del calcio tipo L presso la presynapse della capelli-cellula.
Incubare per 10 min a RT.
Senza eseguire un lavaggio, ripetere il passaggio 8 o 9. Dopo il trattamento, ci dovrebbe essere ancora modifiche di fluorescenza di GCaMP6s in risposta alla stimolazione di getto di fluido in fasci di capelli apicale ma non l'aereo sinaptica. Se le modifiche in GCaMP6s fluorescenza persistono nel piano sinaptico, questi non sono segnali di calcio vero e possono essere artefatti da movimento.

12. rappresentazione grafica e di elaborazione dei dati di immagine

Nota: Utilizzare Fiji (passaggi 12.1 – 12.1.5) e un programma di grafica (passaggi 12.2 – 12.2.3) per passaggio 12. StackReg, TurboReg (passo 12.1.3), Time Series Analyzer V3 (misure 12.1.4–12.1.6), e sono inoltre Fiji plugins richiesti (Vedi Tabella materiali).

Aprire una sequenza di immagini in Fiji, piano singolo tempo serie (80-telaio singolo aereo) o serie temporali dello stack Z (400-telaio multi piano). Fare clic su "File", selezionare "Importa" dal menu a discesa e fare clic su "Sequenza di immagini."
1. Per una serie di volte dello stack Z, Z-progetto ogni volta punto (5 aerei al timepoint) per creare una sequenza di immagine 80-frame. Fare clic su "Immagine", selezionare "Stacks" dal menu a discesa, selezionare "Strumenti" dal menu a discesa e fare clic su "Raggruppato Z-progetto". Selezionare "Media intensità" come il metodo di proiezione e immettere "5" per "Dimensione di gruppo".
  Nota: Ogni aereo all'interno dello Z-stack può essere analizzato separatamente per ulteriori informazioni spaziali.
2. Rimuovere il primo 1 s (10 fotogrammi) dal 8 s (80 fotogrammi) di acquisizione di immagini. Fare clic su "Immagine", selezionare "Stacks" dal menu a discesa, selezionare "Strumenti" dal menu a discesa e fare clic su "Make Substack." Immettere "11-80" per "Fette".
  Nota: Questo substack verrà essere denominato stk1.
3. Registrare la sequenza di immagini (stk1) utilizzando il plugin StackReg³². Fare clic su "Plugins", selezionare "StackReg" e selezionare "Traduzione" come il metodo di registrazione per la serie 70-cornice temporale.
  Nota: Questo substack registrati saranno considerati come stk2.
4. Utilizzare il plugin volte serie Analyzer V3 per estrarre le misurazioni di intensità (F) GCaMP6. Collocare una regione di interesse (ROI) su pacchi dei capelli apicale o siti presinaptici in stk2. Consultare il sito Web di ImageJ (Vedi Tabella materiali per il link) per istruzioni su come usare tempo serie Analyzer V3.
  Nota: Utilizzare una circolare 1 – 2 µm ROI per pacchi dei capelli apicale e una circolare 3 – 5 µm ROI per l'aereo sinaptica (figure 4A1 e 4A2).
5. Selezionare i parametri di misurazione. Fare clic su "Analizza", selezionare "Set misura" e assicurarsi che solo "significa valore grigio" sia selezionata.
6. Nel gestore di ROI, selezionare tutti i ROIs e utilizzare la funzione di multi-misura per generare i valori di intensità (F) per ogni ROI nella serie temporale. All'interno di ROI Manager, fare clic su "Più >>" e selezionare "Multi misura" dal menu a discesa.
Tracciare i valori (F). Incollare i valori (F) dai risultati "Multi misura" in un programma di grafica per creare un grafico X-Y (figure 4A1 'e 4A2').
Nota: (X) di creare valori manualmente oppure utilizzare il timestamp dai metadati.
1. Quantificare la linea di base (F_o) per ogni ROI calcolando i valori (F) nel programma di grafica dalle cornici pre-stimolo 1 – 20.
2. Per ogni ROI, sottrarre la F (_o) i valori (F) a ogni timepoint per creare valori ΔF (F-F_o). Rintraccia, se lo si desidera.
3. Calcolare e tracciare ΔF/F_o. Per ogni ROI, dividere la misurazione ΔF di (F_o) e ritraccia (figure 4A1 cm e 4A2 cm).

13. elaborazione di immagini e calore mappa rappresentazione di segnali di calcio spazio-temporali

Nota: Lavoro precedente per creare calore spaziale mappa rappresentazione di segnali di calcio in zebrafish cellule ciliate linea laterale sono utilizzati software personalizzato scritto in Matlab⁵^,²⁸. Questa analisi è stata adattata per il software di analisi di open source Fiji³³. Utilizzare Fiji per tutte le fasi descritte di seguito. Plugin StackReg e TurboReg Fiji sono anche necessarie (vedere Tabella materiali).

Eseguire i passaggi 12.1 – 12.1.3 per ogni Z-stack o serie temporali su un unico piano creare il substack registrato, indicato come stk2.
Utilizzare stk2 per creare un'immagine di base. Fare clic su "Immagine", selezionare "Stacks" dal menu a discesa e selezionare "Z Project". Selezionare "Media intensità" per "Tipo di proiezione" e immettere "1" per "Start fetta" e "20" per "Stop fetta".
Nota: Questa Z-proiezione verrà essere denominata baselineIMG.
1. Bin temporaneamente la sequenza di immagini (F) 70-telaio (stk2) in 14 0,5-s bidoni. Fare clic su "Immagine", selezionare "Stacks" dal menu a discesa, selezionare "Strumenti" dal menu a discesa e fare clic su "Raggruppati Z Project". Selezionare "Media intensità" come il "metodo della proiezione" e immettere 5 per "Dimensione di gruppo."
  Nota: Questa raggruppati Z-proiezione sarà essere deferita come stk2bin e F nella Figura 5.
2. Sottrarre il valore in pixel della linea di base (baselineIMG) la sequenza di immagini (F) di binned (stk2bin) per creare una sequenza di immagini ΔF. Fare clic su "Processo" e selezionare "Immagine calcolatrice" dal menu a discesa. Selezionare stk2bin come "Image1" e baselineIMG come"Image2." Selezionare "Sottrarre" per "Operazione".
  Nota: Questa linea di base-sottratto Z-proiezione è indicata come stk2binBL e F-BL = ΔF nella Figura 5.
Scegliere una tabella di ricerca (LUT) di scelta per visualizzare la sequenza di immagini ΔF (stk2binBL). Fare clic su "Immagine", selezionare "Tabelle di ricerca" dal menu a discesa e fare clic su una tabella LUT di scelta.
Nota: "Red Hot" è il LUT utilizzato nella Figura 5. Questa linea di base-sottratto Z-proiezione con LUT è denominata stk2binBL-LUT e ΔF LUT nella Figura 5.
1. Impostare i valori di luminosità massima (max) per stk2binBL-LUTe minimo (min). Fare clic su "Immagine", selezionare "Regolare" e fare clic su "Luminosità/contrasto". Impostare il valore di min per rimuovere il rumore di fondo da stk2binBL-LUT. Impostare i valori max di mantenere segnali di interesse ma evitare la saturazione del segnale [ad es., da 200 a 1600 (gamma di intensità di immagine 12-bit = 0 a 4095)].
  Nota: Utilizzare gli stessi valori min e max quando effettuano confronti visivi o rappresentanze. Un bar LUT ΔF taratura può essere generato in Fiji per ogni sequenza di immagini LUT (ad es., stk2binBL-LUT). Fare clic su "Analizza", selezionare "Strumenti" e fare clic su "Barra di calibrazione". Deseleziona "Sovrapposizione" per generare un'immagine separata, individuale con la barra di calibrazione LUT per riferimento.
2. Convertire entrambi i ΔF (stk2binBL-LUT)con l'immagine desiderata LUTand il temporaneamente binned (F) (stk2bin) sequenze di RGB. Fare clic su "Immagine", selezionare "Tipo" e fare clic su "Colore RGB".
  Nota: RGB-convertito Z-proiezioni saranno essere denominate stk2binBL-LUT-RGB e stk2bin-RGB, rispettivamente.
Sovrapporre le immagini LUT ΔF (stk2binBL-LUT-RGB) sul binned (F) immagini (stk2bin-RGB). Fare clic su "Processo" e quindi "Immagine Calculator". Selezionare stk2bin-RGB come Image1 e stk2binBL-LUT-RGB come Image2. Selezionare "Trasparente-zero" per il "Funzionamento".
Nota: Se c'è troppo rumore o sfondo della mascherina di LUT ΔF, ripetere il passaggio 13,3 per aumentare il valore di min. Se c'è saturazione, ripetere il passaggio 13,3 e aumentare il valore di max.

14. immagine rappresentazione di mappa di elaborazione e spazio-temporali calore utilizzando una Macro di Fiji

Nota: Nella sezione seguente fa riferimento a una macro Fiji chiamata LUToverlay basato su passaggio 13 che creerà automaticamente la rappresentazione mappa calore spaziale dei segnali GCaMP6s. Questa analisi richiede l'opensource software analisi Fiji³³ e il plugin StackReg e TurboReg Fiji (Vedi Tabella materiali).

Scaricare la macro di sovrapposizione di Fiji LUT (LUToverlay.ijm) che accompagna questo protocollo (Vedi File di codifica supplementare).
Aprire una serie multi-piano temporale o serie di piano singolo tempo (Vedi punto 12.1).
Fai clic su "Plug-in," selezionare "Macro", fare clic su "Esegui" e selezionare la macro LUToverlay. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con il testo, "Tell me about vostra acquisizione immagine".
Nota: Nella finestra di dialogo, i numeri presenti sono i valori suggeriti e possono essere cambiati secondo il programma di installazione utilizzato dallo sperimentatore. I valori elencati nella casella e sotto sono impostati per una serie di multi-piano temporale con 400 immagini e 5 aerei al timepoint (passo 9).
Dopo "Numero di aerei al timepoint", immettere il numero di aerei al timepoint (ad es., per passo 12.1.1 utilizzando un multi-aereo 400 serie temporali con 5 aerei al timepoint, immettere "5"). Per un acquisto su un unico piano (ad es., passaggio 8) inserire "1".
Nota: Nelle restanti finestre di dialogo, per una serie di multi-piano temporale, "Punti temporali" si intendono il numero immagini nello Z-stack proiettata (ad es., per passaggio 12.1.1 indica 80 punti temporali).
1. Utilizzare l'opzione "Definire l'intervallo per analizzare" per rimuovere il primo 1 s della sequenza di immagini (ad esempio, per selezionare passo 12.1.2 "11-80" per rimuovere i primi 10 fotogrammi e prima 1 s).
2. Dopo "definiscono punti temporali in linea di base", immettere il numero di immagini da utilizzare per creare l'immagine di base [ad es., per passo 13.2., immettere "20" per utilizzare le immagini di pre-stimolo (11-30)].
3. Dopo "Punti temporali per bin temporale" immettere il numero di immagini da bin per la sovrapposizione. (ad es., per passo 13.2.2. select "5" per creare 14 bidoni di 0,5-s).
4. Dopo "Intensità Min" e "Max intensità" immettere i valori di minimo e massimo della luminosità che rimuoverà il rumore di fondo (minimo) e mantenere i segnali di interesse, evitando la saturazione (massimo).
5. Dopo "scegliere una tabella di ricerca", seleziona il LUT desiderato per la sovrapposizione. Fare clic su "OK".
  Nota: La macro si concluderà analizzando le immagini secondo le istruzioni riportate nel passaggio 13. Le immagini generate dalla macro verranno denominate anche secondo le istruzioni riportate nel passaggio 13.
Chiudere tutte le finestre di analisi prima di elaborare una nuova sequenza di immagini.

Representative Results

Dopo myo6b:GCaMP6s-caax pesci transgenici sono correttamente immobilizzati e lo stimolo di getto di fluido è trasportato alle cellule ciliate linea laterale, robusto calcio segnali possono essere fruiti e misurata (figure 4 e 5, prese a 2 X binning). Durante la stimolazione di getto di fluido, calcio segnali può sia essere misurata nei fasci capelli apicale, dove canali MET aprono in risposta agli stimoli, o alla base delle cellule ciliate, dove i canali del calcio presinaptici Ca_v1.3 innescano neurotrasmissione. Un esempio rappresentativo delle risposte del calcio in queste regioni con un neuromast individuali sono mostrati in Figura 4A1-A2 cm. In questo esempio, uno stimolo di fluido-jet 2-s 5 Hz è stato consegnato per attivare tutte le cellule ciliate all'interno il rappresentante neuromast. Durante lo stimolo, segnali di calcio robusto possono essere rilevati in pacchi dei capelli (Figura 4A1-A1 cm, vengono visualizzate le risposte da 8 pacchi dei capelli). In questo sistema, quasi tutte le cellule mature di capelli visualizzare questo afflusso apicale di calcio⁵. Al contrario, all'interno della stessa neuromast, ci sono segnali di calcio rilevabile nel piano basale, sinaptico in solo un sottoinsieme (~ 30%) delle cellule ciliate (Figura 4A2-A2 cm, 4 celle con risposte presinaptiche sono mostrate)⁵. I 4 verde ROIs Visualizza cellule con nessun segnale significativo del calcio presinaptico (Figura 4A2-A2 cm) nonostante segnali di robusta calcio apicale (Figura 4A1-A1 cm). In questo esempio rappresentativo (Figura 4A1-A2 cm), colorate ROIs corrispondono pacchi dei capelli nel piano MET apicale (Figura 4A1) con i loro corpi cellulari nel piano basale sinaptico (Figura 4A2). Questo esempio evidenzia come sia segnali di calcio dipendente e presinaptica MET possono essere misurati all'interno di singole cellule ciliate e tra le popolazioni delle cellule ciliate.

I segnali di calcio in entrambi i pacchi dei capelli e la presynapse possono essere tracciati graficamente come intensità (F) GCaMP6s prima o intensità_oGCaMP6s ΔF/F (vedere il passaggio 12, figure 4A1'-A1 ' e 4A2'-A2 cm). I grafici (F) GaMP6s evidenziare che l'intensità della fluorescenza della linea di base per ogni cella può differire (4A1 figure ' e 4A2'). Nei grafici_oGCaMP6s ΔF/F, ogni cella è normalizzato al valore basale e la variazione di intensità relativa dal basale è tracciata (figure 4A1 cm e 4A2 cm). In entrambi i (F) e ΔF/F_oGCaMP6s trame, i segnali di calcio sia nel fascio di capelli apicale e basale presinaptico aereo avviare con l'inizio dello stimolo (scatola grigia) e diminuiscono in modo esponenziale dopo lo stimolo si conclude. Durante lo stimolo, segnali di calcio in pacchi dei capelli crescere rapidamente e saturare se non cambia la forza della deflessione (Figura 4A1-A1 cm). Al contrario, all'interno il sottoinsieme delle cellule ciliate con segnali di calcio rilevabile nel piano sinaptico, i segnali di calcio aumentare più gradualmente e sono meno inclini a saturazione (Figura 4A2-A2 cm). In cellule ciliate senza segnali di calcio presinaptico (ROIs verde), i segnali di calcio rimangono nei pressi della linea di base.

Oltre a queste rappresentazioni grafiche (Figura 4), segnali di calcio possono essere visualizzati nello spazio entro il neuromast intero durante il corso di tempo della registrazione. Nella Figura 5 è riportato un esempio di una rappresentazione spazio-temporale per presinaptici GCaMP6s segnali nel piano basale di un neuromast. In Figura 5, i passaggi principali per elaborare una sequenza di immagini per la visualizzazione spaziale sono descritte come descritto nel passaggio 13. In primo luogo, le immagini raw (F) GCaMP6s sono temporaneamente cestinate [Figura 5: 1 ° f (5 dei 14 bidoni sono mostrati); passo 13.2.1]. Quindi, l'immagine della linea di base, calcolato da pre-stimolo frame (passo 13,2), viene sottratto i segnali di fluorescenza (F) GCaMP6s per ottenere immagini ΔF (Figura 5: riga 2; passo 13.2.2). Successivamente, le immagini in scala di grigi ΔF vengono convertite in un colore LUT (Figura 5: riga 3, Red Hot LUT; passo 13,3). Infine, le immagini ΔF con la conversione di LUT sono overlaid sulle temporaneamente binned immagini (F) (Figura 5, prima fila) per rivelare i segnali spatiotemporal entro il neuromast durante la stimolazione (Figura 5: ferro 4; passo 13,4). Le mappe di calore di ΔF GCaMP6s segnali forniscono entrambe preziose informazioni spaziali e temporali che non sono facile da analizzare da ROIs singolo e i grafici utilizzati nella Figura 4. Mappe di calore possono aiutare a visualizzare informazioni spatiotemporal critiche, comprese le subcellulare informazioni riguardanti l'inizio e la durata dei segnali di calcio all'interno di ogni cellula ciliata come pure le differenze di tempi e intensità tra cellule ciliate all'interno dell'intero neuromast.

È importante verificare che i grafici e le mappe di calore spaziali rappresentano segnali di calcio vero e non sono elementi a causa di movimento. In questo protocollo, artefatti da movimento possono essere il risultato di eccessivo deriva o movimento della larva o movimento dovuto stimolo fluido-jet. Tutti questi elementi sono difficili da eliminare completamente in questa preparazione in vivo. Mentre la registrazione di sequenze di immagini (passo 12.1.3) può correggere la maggior parte del movimento in x - e y, sequenze di immagini con movimento eccessivo nell'asse z deve essere identificata e rimosso dalle analisi. Artefatti da movimento sono più facili da identificare rappresentando graficamente i segnali del calcio. Esempi di modifiche di intensità di GCaMP6s che sono artefatti e non vero GCaMP6s segnali possono essere osservati all'apice (Figura 4B1'-B1 cm) e base (Figura 4C1'-C1 cm) delle cellule ciliate.

Nei fasci capelli apicale, artefatti da movimento sono comuni quando lo stimolo di getto di fluido è troppo forte (Figura 3A3 ' '). Durante questi stimoli eccessivamente forti, l'aereo di fascio di capelli apicale può spostare fuori fuoco durante la stimolazione di getto fluido quindi tornare all'aereo focale originale dopo lo stimolo termina (Figura 4B1'-B '). Questo rende difficile misurare con precisione i segnali di calcio apicali MET-dipendente. Un esempio di artefatti da movimento fascio di capelli può essere visto nella Figura 4B1'-B1 cm. Qui, i grafici mostrano una diminuzione della GCaMP6s segnali durante lo stimolo (scatola grigia) quando i pacchi dei capelli sono out-of-focus. Al termine dello stimolo, i segnali di GCaMP6s aumentano rapidamente come i pacchi dei capelli tornare alla loro posizione originale e tornano indietro a fuoco. Questo contrasta con l'esempio in Figura 4A1'-A1 cm in cui i segnali di calcio apicale aumentano all'inizio dello stimolo e diminuiscono quando finisce lo stimolo.

Mentre il movimento a causa di eccessivi liquido-jet stimoli può anche spostare l'aereo sinaptica fuori fuoco, questo tipo di artefatto movimento è meno comune in questo piano. Invece, le modifiche a fuoco nell'asse z a causa di movimento o deriva della larva sono le cause più comuni di artefatti da movimento. Movimento larvale o drift può influire sulle misurazioni di GCaMP6s presso l'apice e la base delle cellule ciliate. Nella Figura 4è riportato un esempio di movimento larvale che aumenta GCaMP6s nel piano basale, sinaptico durante lo stimoloC'-C '. Artefatti di movimento (Figura 4C1'-C1 cm) può essere distinto da veri segnali presinaptici (Figura 4A2'-A2 cm) esaminando il corso di tempo dei segnali GCaMP6s. Piuttosto che aumentare e diminuire in modo esponenziale con lo stimolo (Figura 4A2'-A2 cm), gli aumenti di movimento-induced in segnale di GCaMP6s hanno una piazza di forma e salgono e scendono bruscamente con l'inizio ed il contrappeso dello stimolo, rispettivamente ( Figura 4 C1'-C1 cm).

Oltre ad attento esame del corso di tempo dei segnali GCaMP6s, esperimenti di controllo utilizzando farmacologia può essere utilizzati per distinguere il vero GCaMP6s segnali da artefatti da movimento. Ad esempio, BAPTA (punto 10) può essere applicato per fendere il suggerimento-link che sono necessari per la funzione di MET-canale in pacchi dei capelli. BAPTA dovrebbe eliminare sia fluido-getto-evocato apicale afflusso di MET-canale-dipendente del calcio come pure l'afflusso di calcio basali, presinaptici successive attraverso canali del Ca_v1.3. Nell'esempio rappresentativo di segnali di calcio vero stimolo-evocato (Figura 4A1-A2 cm) durante la stimolazione fluido-jet, tutte le modifiche in GCaMP6s fluorescenza in entrambi i piani apicali e basali sarebbero state eliminate dopo il trattamento BAPTA. Al contrario, cambia in fluorescenza di GCaMP6s a causa di movimenti come quelli mostrati figure 4B1'-B1 ' e 4 C 1'-C1 cm non sarebbero eliminati dal trattamento BAPTA.

Oltre a utilizzare BAPTA per eliminare tutti i segnali di GCaMP6s stimolo-evocato, isradipina può essere applicato (punto 11) per bloccare in modo specifico l'afflusso di Ca_v1,3-dipendenti del calcio nel piano basale sinaptico lasciando apicale MET-canale-dipendenti calcio afflusso intatto⁵. Dopo l'applicazione di Isradipina, in un neuromast individuali senza artefatti di movimento, cambia in GCaMP6s fluorescenza in pacchi dei capelli apicale (Figura 4A1'-A1 cm) durante la stimolazione fluido-jet sarebbe inalterato, mentre tutti i GCaMP6s sinaptica modifiche di fluorescenza alla base sarebbero state eliminate (Figura 4A2'-A2 cm). Qualsiasi cambiamento nel segnale di GCaMP6s nel piano sinaptico dopo applicazione di isradipina (ad es.,Figura 4C1-C1 cm) molto probabilmente corrisponderebbe ad artefatti da movimento.

Figura 1 : Descrizione di un neuromast di linea laterale e piani di formazione immagine funzionale. (A) il diagramma a sinistra raffigura una vista laterale di un neuromast con quattro corpi delle cellule cigliate (nero) Contattare postsinaptici neuroni afferenti (blu). Nastri (verde) legare vescicole a presinaptici siti attivi all'interno di ogni cellula. Apicale per ogni corpo cellulare è un fascio di stereocilia (1 µm) che contengono canali MET. Ogni fascio di capelli ha un kinocilium che trasferisce la forza meccanica del movimento dell'acqua alla base del fascio di capelli. Il diagramma a destra raffigura lo stesso modello in una visione top-down. In questa top-down vista, nero è utilizzato per indicare le quattro celle raffigurate nel diagramma a sinistra, e grigio viene utilizzato per indicare altre cellule nella neuromast. All'interno di questo modello e questi 2 punti di vista, sono evidenziati tre aerei importanti: (1) le punte dei capelli bundle (può) utilizzati per quantificare l'entità della deviazione di fascio di capelli, (2) l'aereo MET apicale alla base dei pacchi dei capelli dove calcio entra nella cellula durante la stimolazione e (3) l'aereo sinaptica alla base della cella dove calcio entra vicino nastri sinaptiche. (B1-B1') Immagini di top-down DIC e GCaMP6s di MET aereo alla base dei pacchi dei capelli, dove mechanosensation-dipendenti del calcio segnali possono essere registrati. (B2-B2') Immagini di top-down DIC e GCaMP6s dalla neuromast stesso come B1-B1', ma alla base del neuromast nel piano sinaptico, dove possono essere rilevati segnali di calcio presinaptico. (C1-C2) Immagini di un neuromast esprimendo GCaMP6s dove le larve è montata in modo errato. In questo esempio, l'apicale MET piano (C1) e piano sinaptica (C2) alla base della cella sono posizionati ad angolo non ottimale. Questa posizione non è consentito per tutti i pacchi dei capelli essere imaged in un unico piano, e molti più aerei di formazione immagini sono necessari per acquisire attività presso tutte le sinapsi all'interno di questo neuromast rispetto al B1-B2'. Le immagini sono delle larve alle 5 dpf. La barra della scala in C2 corrisponde a tutte le immagini in B1-C2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Imaging camera, procedure di iniezione di montaggio e cuore di zebrafish e aghi. (A) mostrato è una camera di imaging con una larva (indicata da un rettangolo tratteggiato) appuntata al centro in cima l'incapsulante in silicone. (B1) Mostrato è una larva di dpf 5 immobilizzato da due perni. Un grande perno di testa è posizionato perpendicolare al corpo appena posteriormente all'occhio. I due occhi si sovrappongono completamente quindi l'occhio inferiore è completamente oscurata dall'occhio superiore. Un pin di piccola coda interseca la notocorda nella coda. La larva è piatta e non attorcigliate. (B2) Per paralizzare della larva, un ago per iniezione cuore è orientato perpendicolarmente al corpo e portato adiacente al cuore. L'ago per iniezione cuore dovrebbe contattare la cella di pigmento davanti al cuore. (B2') Depressione dell'ago nella pelle provoca rientro della cella pigmento davanti al cuore. (C) aghi in ordine da sinistra a destra: esempio di un ago per iniezione cuore con un'apertura di circa 3 µm; esempio di un buon getto di fluido ago con un'apertura di circa 50 µm; esempio di un ago di fluido-jet male rotto che è grande e frastagliate e produrrà probabilmente stimoli eccessivi e irregolari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Allineamento del getto fluido, il posizionamento e la taratura di stimolo. (A1) È illustrata una larva orientata con la testa rivolta a sinistra e la coda a destra e un ago di liquido-jet orientato parallelamente all'asse di A-P del corpo zebrafish. Questo ago fluido-jet è stato allineato per stimolare il neuromasts che rispondono a anteriore (push/pressione) e posteriore (pull/vuoto) diretto flusso fluido. (A2) Mostrato sono un neuromast (indicato dalla linea tratteggiata bianca) e punte dei pacchi dei capelli apicale (può) sul lato sinistro del pannello e l'ago di getto di liquido sul lato destro del pannello. Il getto di fluido è posizionato circa 100 µm dal bordo del neuromast. (A3-A3 ' ') Le punte dei pacchi dei capelli apicale (può) sono deflessi distanze diverse variando pressione fluido-jet stimolo. La traiettoria di una punta di singolo kinocilial è indicata per 1,5 µm (A3') e 5 µm (A3 cm) Distanze di deflessione. Il cerchio nero indica la posizione di riposo del kinocilium. È importante che può non siano sviati troppo lontano, altrimenti l'intensità di stimolo non può essere quantificato attendibilmente e può diventare dannoso (A3 ' '). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : MET apicale e basale presinaptici GCaMP6s segnali durante la stimolazione di getto di fluido in cellule ciliate linea laterale. (A1-A2 cm) GCaMP6s cambiamenti di intensità durante la stimolazione di getto di fluido all'interno di un rappresentante neuromast. Le immagini sulla sinistra mostrano l'apicale MET aereo (A1) e piano sinaptica basale (A2) all'interno della stessa neuromast. Il colore di ROIs codificato in A1 e A2 sono stati utilizzati per tracciare il corso di tempo (f) e ΔF/F GCaMP6s intensità grafici a destra di ogni immagine. (B1-B1 cm) Esempio di una sequenza di immagini MET apicale con movimento in eccesso durante la stimolazione di getto di fluido. L'immagine sulla sinistra (B1) Mostra il ROIs utilizzato per trama (F) e ΔF/F GCaMP6s intensità grafici a destra. (C1-C1 cm) Esempio di una sequenza di immagini in piano basale sinaptica che spettacoli artefatti di movimento e GCaMP6s segnale modifiche che non sono vero calcio segnali. L'immagine sulla sinistra (C1) Mostra il ROIs utilizzato per trama (F) e ΔF/F GCaMP6s intensità grafici a destra. La casella grigia in ogni grafico rappresenta la durata dello stimolo getto di fluido durante ogni sequenza di immagini. Uno stimolo di fluido-jet 2-s 5 Hz è stato utilizzato per l'esempio in A1-A2 'e B1-B1 '. In C1-C1 cm, uno stimolo di passo anteriore s 2 è stato utilizzato. L'asse Y per i grafici (F) GCaMP6s raffigura unità arbitrarie (A.U.) ottenuti da misure di intensità di immagine Fiji. Tutti gli esempi sono da larve al dpf 4-5. Barra della scala = 5 µm per tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Visualizzazione spatiotemporal di presinaptici GCaMP6s segnali durante la stimolazione di getto fluido. I passaggi per visualizzare le modifiche spatiotemporal in intensità di GCaMP6s all'interno di un neuromast durante stimolo sono descritte. Ora è rappresentata da sinistra a destra secondo il timestamp nella parte superiore delle immagini. La prima riga indica 5 dei 14 bidoni temporali da una sequenza di immagini di GCaMP6s (F) 70-telaio (passo 13.2.1). Nella seconda riga, la linea di base (passo 13,2) è stato rimosso da ogni immagine binned GCaMP6s (F) per creare immagini ΔF (passo 13.2.2). In terza fila, immagini ΔF sono stati convertiti da scala di grigi (seconda riga) al rosso caldo LUT (passo 13,3). Min e max di queste immagini LUT sono impostati secondo la mappa di calore rosso caldo LUT di intensità relativa ΔF (A.U.) sulla destra (passo 13.3.1). Nella riga inferiore, la terza fila ha stato sovrapposto sulle immagini (F) nella riga superiore (passo 13,4). La barra grigia nella parte superiore della figura indica la durata dello stimolo fluido-jet 2-s 5 Hz. L'esempio è da un 5 larve di dpf. Una legenda della mappa di calore rosso caldo LUT di intensità relativa ΔF (A.U.) è mostrata a destra. Barra della scala = 5 µm per tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In vivo imaging in animali intatti è intrinsecamente difficile. Diversi passaggi di questo metodo sono fondamentali per ottenere affidabile in vivo misure del calcio dalle cellule ciliate linea laterale. Ad esempio, è molto importante che la larva è bloccata e paralizzata correttamente prima dell'imaging per minimizzare il movimento durante la formazione immagine. Movimento in eccesso durante la formazione immagine può condurre ai cambiamenti in fluorescenza di GCaMP6s che non sono veri segnali e non corrispondono ai cambiamenti nei livelli di calcio (ad es., figure 4B1'-B1 ' e 4 C 1'-C1 cm). Perni di coda possono essere posizionati più anteriormente per ridurre al minimo movimento, anche se questo potrebbe rendere più neuromasts posteriore inaccessibile. Inoltre, dopo l'iniezione di cuore, spilli con testa può essere ruotate affinché la parte orizzontale del perno si trova da altra parte il tuorlo. Oltre ad alterare la posizione dei perni, è anche possibile utilizzare un'arpa di cervello-fetta invece di pin per immobilizzare le larve³⁴. Quando posizionata sopra le larve correttamente, un'arpa è un ulteriore, potenzialmente meno invasivo metodo di immobilizzare le larve. Mentre un movimento significativo può derivare da appuntare inadeguata, mancato di eseguire correttamente l'iniezione di cuore per consegnare α-bungarotossina e paralizzare le larve può provocare paralisi incompleta, movimento e in definitiva gli artefatti di movimento. Anche se comunemente utilizzati anestetici sono stati indicati per colpire l'eccitabilità delle cellule ciliate zebrafish, lavoro recente ha indicato che la benzocaina anestetico non interferisce con molti aspetti dell'attività della cellula ciliata. Allo stesso modo, il più comunemente usato anestetico che MS-222 solo interferisce con alcuni aspetti della capelli-cellula attività¹⁵. Di conseguenza, a causa della natura impegnativa di α-bungarotossina iniezione, benzocaina o applicazione MS-222 può rivelarsi un utile metodo alternativo della paralisi per impedire il movimento nella larva durante la formazione immagine funzionale del calcio.

Oltre le sfide tecniche coinvolte nel presente protocollo, anche un campione perfettamente montato è inutile se la larva e cellule ciliate non sono sane, prima e durante ogni esperimento imaging. Per garantire che le larve e le cellule ciliate sono sane, è importante che le larve sono mantenute in E3 buffer che è privo di detriti come chorions (gusci d'uovo), rifiuti e microrganismi. Anche se la posizione superficiale delle cellule ciliate linea laterale è vantaggiosa per l'imaging, questa posizione li rende più vulnerabili a danni cellulari quando il buffer di E3 è sporca. Un ambiente pulito, acquoso è particolarmente importante per le giovani larve (2-4 dpf) o mutanti che non possono mantenere una piscina in posizione verticale, posizionare e principalmente giacciono sul fondo del piatto Petri. In queste situazioni, cellule ciliate linea laterale e il cupula protettivo che circonda i pacchi dei capelli può facilmente diventare compromessa. Anche quando si inizia con larve sane e cellule ciliate, nel corso di ogni esperimento, è fondamentale per garantire che la larva ha un battito cardiaco e del flusso sanguigno rapido. Se il flusso di sangue rallenta o si ferma, la salute delle cellule ciliate può diventare compromessa. Nelle preparazioni di compromesse che coinvolgono malsane larve o perdita di flusso sanguigno, morendo le cellule ciliate possa essere identificato in diversi modi: primo, dalla comparsa di karyopyknosis o condensazione nucleare, che si manifesta come una bolla all'interno della cellula sotto ottica DIC; in secondo luogo, di restringimento delle cellule e la presenza di particelle all'interno del citoplasma; in rapido movimento e terzo, quando può consigli di strombatura in diverse direzioni³⁵. Quando i pacchi dei capelli sono interrotti, lo strombato può non spostare coesiva insieme durante la stimolazione.

Questa preparazione ha diversi limiti minori, uno è che la preparazione rimane solo robusta per 1-3 ore dopo che è stata stabilita. Modifiche come l'utilizzo di piccoli perni o una fetta di cervello arpa per immobilizzare le larve e l'aggiunta di un sistema di perfusione può estendere la durata di questa preparazione in vivo . Un'altra limitazione è che photobleaching e fototossicità può verificarsi dopo ripetute prove di formazione immagine. Un modo emozionante per superare questa sfida è quello di adattare questo protocollo per microscopia luce-foglio. Microscopia di luce-foglio è un modo efficace per ridurre la luce del fuoco, che conduce a meno photobleaching e fototossicità³⁶. Insieme, immobilizzazione più delicato e meno foto-esposizione può contribuire a prolungare ogni sessione di imaging. Le sessioni più imaging possono essere utilizzate per esaminare l'intera durata dei cambiamenti funzionali che accompagnano lo sviluppo e i processi che sottendono la clearance delle cellule cigliate e rigenerazione dopo la lesione. È importante sottolineare che, oltre alla microscopia luce-foglio, questo protocollo può essere adattato ad altri sistemi confocal di tipi (punto-scansione, 2-fotone e filatura disco) nonché relativamente semplice widefield sistemi²⁸^,³⁴. Nel complesso, la sua versatilità rende questo protocollo uno strumento prezioso che può essere adattato e utilizzato con più sistemi di imaging.

Mentre questo protocollo può essere adattato e utilizzato con molti sistemi di imaging, parti del presente protocollo possono anche essere adattati e utilizzati (1) con altri indicatori oltre GCaMP6s e (2) l'attività di image in altre cellule sensoriali e neuroni all'interno di zebrafish larvale. Ad esempio, in uno studio precedente, abbiamo utilizzato questo protocollo per attività di immagine utilizzando indicatori più geneticamente codificati all'interno di cellule ciliate linea laterale per rilevare calcio citosolico (RGECO1), fusione della vescicola (SypHy), tensione di membrana (Bongwoori) e membrana calcio (jRCaMP1a-caax e GCaMP6s-caax) e all'interno dei processi afferenti linea laterale per rilevare membrana calcio (GCaMP6s-caax)⁵. Basandoci sulla nostra esperienza di utilizzo di questi indicatori, la linea transgenica che TG(myo6b:gcamp6s-CAAX) descritto in questo protocollo offre un ottimo inizio per l'imaging di attività in linea laterale neuromasts. Di tutti gli indicatori sopra elencati, abbiamo trovato che GCaMP6s è il più sensibile e fotostabili. Oltre a queste funzionalità, evidenziamo la linea transgenica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) perché può essere utilizzato per effettuare due misurazioni distinte: cellula ciliata mechanosensation e calcio presinaptico all'interno di una singola linea transgenica.

La tecnica descritta in questo articolo viene illustrato come formazione immagine del calcio in zebrafish linea laterale può essere un metodo efficace per studiare il funzionamento di cellule ciliate in ambiente nativo. Questo approccio è complementare agli studi dei mammiferi in quale cellula ciliata funzione è attualmente allo studio in espianti di ex vivo . Inoltre, il modello di zebrafish può continuare a essere utilizzato come una piattaforma per testare l'efficacia di codificato geneticamente indicatori che possono quindi essere applicate per esaminare l'attività in cellule di mammifero i capelli.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIDCD ricerca intramurale fondi 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vorremmo riconoscere Candy Wong per la sua assistenza nella scrittura la macro di Fiji. Vorremmo anche ringraziare Doris Wu e Candy Wong per loro utili suggerimenti con il protocollo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Section 1
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%	Sigma-Aldrich	P0290	For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber	Siskiyou	PC-R	Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm	VWR	48366-227	To seal imaging chamber
High vacuum silicone grease	Fischer Scientific	14-635-5D	For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG	To fill imaging chamber to create a surface to pin fish
Oven	Techne	HB-1D	For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 with transmitted light illumination	For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	For making pins
Fine scissors	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm	Goodfellow	W005131	For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller	Sutter Instrument Company	P-97	For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament	Sutter Instrument Company	BF 150-86-10	Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher	Narishige	MF-830 microforge	To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile	Sutter Instrument Company	NC9569052	For scoring and evening breaking fluid-jet needles
Sections 4 & 5
Fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	For pinning larvae
Gel loading tips	Eppendorf	5242956003	For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 with transmitted light illumination	For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder	WPI	MPH315	To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin
Magnetic stand	Narishige	GJ-1	For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector	Eppendorf	Femtojet 4x	To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope	Bruker	Swept field/Opterra confocal microscope	Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software	Bruker	Prairieview 5.3	To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective	Nikon	MRH00101	Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective	Nikon	MRF07620	Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD camera	Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter	Siskiyou	PC-A	For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage	Prior Scientific	ZDN12MP	Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor	NIH Machine shop	custom	To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus	ALA scientific instruments	HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP	For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator	Sutter Instrument Company	MP-225	For holding and positioning of needle holder for fluid jet
Micromanipulator controller	Sutter Instrument Company	MPC-200	For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips	Eppendorf	5242956003	For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder	WPI	MPH315	To hold fluid-jet needles
PSI manometer	Sper Scientific	840081	For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant	ThermoFischer Scientific	B1204	To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine	Sigma-Aldrich	I6658	To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7	Graphpad	Prism7	Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI	Schindelin, et., al.³⁴	https://fiji.sc/	Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.²⁹	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.²⁹	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Neuroscience

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.