Summary
מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.
Abstract
טרשת עורקים מובילה למחלות קרדיווסקולריות (CVD). לא ברור עדיין אם ריכוז כולסטרול-HDL (cHDL) ממלא תפקיד סיבתי בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, גורם חשוב בשלבים המוקדמים של היווצרות הפלאק atheroma הוא היכולת בזרימת כולסטרול HDL (היכולת של חלקיקי ה-HDL כולסטרול מן מקרופאגים לקבל) על מנת למנוע היווצרות תאי קצף. זהו צעד המפתח הימנעות ההצטברות של כולסטרול של אנדותל, וחלק תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT) כדי למנוע כולסטרול דרך הכבד. קיבולת בזרימת הכולסטרול בסרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח זה יכול לשמש סמן עבור טרשת עורקים. באופן מסורתי, [3H]-כולסטרול כבר בשימוש מבחני בזרימת כולסטרול. במחקר זה, אנו שואפים לפתח אסטרטגיה מהירה ובטוחה באמצעות פלורסנט מתויג כולסטרול (הכולסטרול-להארכה) ב וזמינותו הסלולר לאתר את ספיגת הכולסטרול ותהליכי בזרימת ב מקרופאגים THP 1-נגזר. לבסוף, אנו לייעל, לתקנן את שיטת בזרימת להארכה-כולסטרול ולפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.
Introduction
לפי ארגון הבריאות העולמי, הגורמים העיקריים הנוכחי למוות ברחבי העולם הם מחלת לב איסכמית וקו (חשבונאות עבור סכום כולל של 15.2 מיליון מקרי מוות)1. שניהם נמצאים מחלות לב וכלי דם (CVD) זה יכול להיות קדמו טרשת עורקים, שבר atheroma הפלאק של כלי הדם2,3.
טרשת עורקים היא כלי קיר דלקתיות מחלה שבה מקרופאגים, תאי T, תאי פיטום, תאים דנדריטים לחדור את אנדותל ולצבור מהדם, בסופו של דבר ויוצרים הפלאק טרשת עורקים. שלטי טרשת עורקים מציגים ליפופרוטאין קריסטלים הליבה וכולסטרול, שמעידים ברזולוציה גבוהה B-מצב בדיקת אולטרה סאונד מדידות של4,5עובי מדיה התרדמה אינטימה. ב מקרופאגים, כולסטרול בזרימת לכיוון השומנים מקבל חלקיקים מתבצעת על ידי אמצעים של קולטני קלטת (ABC) מחייב ATP ABCA1, ATP איגוד קלטת תת G חבר 1 (ABCG1), הקולטן נבלות SR-BI. האיזון של זרם הכולסטרול ולא בזרימת ב מקרופאגים נחשב תהליך מפתח חניכה טרשת עורקים6. כולסטרול בזרימת נחשבת צעד המפתח כולסטרול חיסול של רקמות היקפיים כדי פלזמה והכבד בתהליך הנקרא תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT). כולסטרול יועברו מ מקרופאגים בעיקר כדי אפוליפופרוטאין A1 (ApoA1) על פני השטח של חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL). HDLs תחבורה ואז הכולסטרול בכבד הפרשה וסילוק מחדש7,8,9.
באופן מסורתי, נעשה שימוש טריטיום (3H) מתויג רדיו כולסטרול כולסטרול בזרימת10. האות פליטה של רדיואיזוטופים הוא מאוד רגיש10; עם זאת, כולסטרול מתויג הרדיו מציג מגבלות ברורים כגון פרוטוקולים ארוכים, סיכון של חשיפה לקרינה מייננת בצורך מיוחד רדיואקטיביות מתקנים וציוד על מנת להבטיח טיפול בטוח של פליטת רדיואקטיבי. להפך, זריחה יש בהצלחה שולבו טכניקות אבחון בשל פשטותו זיהוי אותות פלואורסצנט, מגוון רחב של fluorophores זמין, ו שלה בטיחות11. בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מספר השתמשו ללמוד מטבוליזם הכולסטרול כולל dehydroergosterol (עם פלורסצנטיות מהותי), כולסטרול dansyl, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - כולסטרול, ו 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (להארכה-כולסטרול). במיוחד, להארכה-כולסטרול מציג ספיגה יעילה תאים אנושיים12. שני שונים להארכה מתויג כולסטרול זמינים כעת: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-להארכה) ו 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-להארכה; איור 1). כולסטרול בלוחיות הסבר moiety 22-להארכה ייתכן ולביצועי כולסטרול בזרימת מחקרים, בעוד 25-להארכה-כולסטרול משמש בעיקר הממברנה התאית dynamics מחקר13,14.
שורות תאים המשמש בדרך כלל כולסטרול במבחנה בזרימת מבחני הם תאים דמויי מונוציט כגון לוקמיה-derived THP-1 התאים של האדם, 264.7 גלם מאתר תאים15או J774.1. כל התאים האלה יכול להיות מובחן מקרופאגים במבחנה באמצעות 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA), אך THP 1-נגזר מקרופאגים (dmTHP-1) הכי טוב לשקף לחקות את המקרופאגים האנושי16.
במחקר הנוכחי, אנו לייעל, לתקנן שיטה תפוקה גבוהה פלורסנט כדי לקבוע את הקיבולת בזרימת כולסטרול הדוגמאות סרום dmTHP-1, באמצעות 22-להארכה-כולסטרול כחלופה [3H]-כולסטרול. בנוסף, אנו משווים את הטכניקה פלורסנט ממוטבת עם אנלוגי רדיואקטיבי סטנדרטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר זה, אישור ועדה אתית (Comitè Ètic d'Investigació קליניקה, חולים במרפאה, ברצלונה; מספר אישור HCB/2014/0756), הודיע בכתב הסכמת כל הנושאים התקבלו.
1. כולסטרול להארכה הכנה
- להמיס את להארכה הכולסטרול (MW 494.63; ראה טבלה של חומרים) אתנול טהור כדי להשיג את המניה (2 מ מ). בשביל בקבוקון 10 מ ג, לפזר את תוכן כל בקבוקון באמצעי אחסון 10.1 מ"ל אתנול לרכוש מניה 2 מ מ.
- לדלל את להארכה-כולסטרול מן המלאי ב- 1640 RPMI בתוספת 10% עוברית שור סרום ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין (R10 בינוני) כדי להגיע ריכוז סופי של 5 μM (למשל, לקבל 10 מ של כולסטרול להארכה ב 5 הריכוז הסופי μM) על ידי דילול μL 25 מניות להארכה-כולסטרול (2 מ מ) R10 בינוני. אמצעי אחסון זה מספיקה בשביל צלחת 96-ובכן.
2. התא תרבות, זריעה (יום 2)
- התרבות התאים THP-1 R10 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התאם ל 0.3 x 106 תאים/מ ל כל 3 ימים.
- הזרע התאים צלחת 96-ובכן לבן עם חלק תחתון שטוח, ברור ב- 0.2 x 106 תאים/היטב במדיום R10 (100 μL לכל טוב).
- לטיפול תאי עם לענייני חוץ phorbol ננומטר 100, פעילים-12 13-אצטט (PMA מ מניה 10 μM) עבור 48-72 שעות, המקננת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 להבדיל THP-1 תאים לתוך dmTHP-1.
הערה: מומלץ להשתמש μL 5 מניות PMA (10 μM) בμl 500 R10 בינוני. לפני כן, להכין μM 10 מניות ובחום על ידי המסת בקבוקון lyophilized 1 g ב- 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), aliquot, ואת המניה ב-20 ° C. - לחילופין (הצעה) לשלב פעולות 2.2 ו- 2.3 עבור המגון טוב יותר. להכין 10 מ ל THP-1 תאים בשפופרת 15 מ"ל, להוסיף μL 200 מניות PMA (10 μM), מערבבים בעדינות, מיד זרע μL 100 לכל טוב לצלחת. דגירה התאים כפי שמתואר בשלב 2.3.
3. אפוליפופרוטאין B דלה הכנה סרום (ABDS) (יום 2 או 3)
- כדי להכין פתרון פוליאתילן גליקול (PEG), לדלל גליצין ב- PBS 10% (עם H סטרילי2O) כדי ריכוז של 200 מ"מ ב- pH 7.4. 40 מ ל-200 מ מ גליצין להוסיף 10 גרם של פג 8000 להשיג פג 20% (w/v). מערבבים את הפתרון נמרצות כדי homogenize.
- החל 4 חלקים של 20% יתד לכל 10 חלקים סרום/פלזמה על כל מדגם סרום/פלזמה צינור 1.5 מ ל ולהשאיר את התערובת על קרח במשך 25 דקות17 (לדוגמה, עבור 100 μL של פלזמה או סרום, להוסיף 40 μL של 20% יתד פתרון).
- Centrifuge את התמיסה פג-אפוליפופרוטאין B ב 13,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- למחוק את התמיסה. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
הערה: אנו ממליצים להכין את ABDS ביום השלישי (טרי). אם זה לא אפשרי, להכין את ABDS ביום 2 ולשמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. להארכה-כולסטרול תא טעינה (יום 2)
- ביטול המדיום תרבות של ה-dmTHP-1 ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- לטעון את התאים עם 5 μM להארכה-כולסטרול (100 μL לכל טוב) במדיום R10 דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
5. דגירה עם כולסטרול Acceptors (יום 3)
- ביטול המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
- דגירה התאים עם 2 – 5% ABDS או הריכוז הרצויה של מקבל השומנים מטוהרים (HDL, ApoA, ספקיות, וכו ') מעורבבת עם RPMI 1640 השקופה בינונית (100 μL לכל טוב) עבור 4-6 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כוללות פקד שלילי (נולד ב- C) המורכב השקופה RPMI 1640 בינונית ללא acceptors ופקד חיובי (C +) (למשל, ABDS מתוך מאגר של תורמים בריאים) או מטוהרים HDLs. שים לב כי הפקד חיובי חל במיוחד כאשר המטופל דגימות (תנאי המחלה) הם ניתחו (משלים איור 1). - להכין מלאי 200 מ של הפתרון פירוק התא 1 (50 מ מ טריס מאגר, 150 מ מ NaCl, H2O). מערבבים את היחס פתרון 1-1:1 (v: v) פירוק התא עם אתנול טהור כדי לקבל את הפתרון פירוק 2.
6. ניאון האות ללכוד (יום 3)
-
זיהוי להארכה-כולסטרול מדיה
- הסר המדיום תא הלוחות ולאסוף אותו בצלחת 96-ובכן לבן חדש עם התחתון שטוח אטום.
- לצורך זיהוי האות זריחה אופטימלית הדגימות מדיה, להוסיף 100 μL של כוהל טהור 100 μL של כל מדגם בינוני כדי לקבל יחס של 1:1 בצלחת לבנה 96-ובכן.
- לשמור לצלחת עם התקשורת שטופלו נוספים מודדים עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) אורך גל nm (עירור/פליטה) 463⁄536 ב luminometer.
-
זיהוי להארכה-כולסטרול תאיים
- לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
- כדי להשיג את כולסטרול intracellular, lyse התאים על ידי המקננת בהם עם μL 100 של פירוק פתרון 2 לכל טוב ומנערים את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 25 דקות.
- עבור זיהוי האות זריחה אופטימלית הדגימות lysate תא, ללכוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית lysates תא באותו לבן 96-ובכן צלחת עם תחתית ברורה במול (באותה צלחת שבה התאים היו נזרע בשלב 2.2).
- 6.3 למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) ב- luminometer תוך התאמת הפרמטר רגישות ל- 50 בתוכנה (ראה טבלה של חומרים).
7. תוצאות ניתוח
- אקספרס בזרימת כולסטרול קצב דגימה כאחוז מחושבת באמצעות הנוסחה:
- השג המדד הסופי של כולסטרול בזרימת (CE) על-ידי חיסור של CE של הפקד שלילי (דוגמה עמוסה להארכה-כולסטרול אבל מודגרות השקופה RPMI 1640 בינונית, ללא כולסטרול acceptors) CE של נתן דוגמאות:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטרה של כולסטרול בזרימת וזמינותו היא לקבוע במבחנה את הקיבולת בזרימת כולסטרול סרום נתון, פלזמה, או תגובת שיקוע המכיל חלקיקי ה-HDL. השיטה מורכבת loading כולסטרול מתויג תרבות של קו תא מקרופאג סטנדרטי שייצור קשר עם הדגימה הבדיקה מדולל FBS ללא מדיה עם התאים. בסופו של דבר, רמות פלורסנט להארכה נמדדים תא lysate וכלי תקשורת. כדי למטב את המידות, רמת הכולסטרול effluxed מתאי למדיה מעורבב עם אמצעי אחסון אחד החומר הממיס המכיל אתנול. להארכה-הכולסטרול בתאי שנותרה היא resuspended לתוך הממס המכיל אתנול או דטרגנט לפני מדידות. לבסוף, נקבע היחס של effluxed/סה כ כולסטרול מתויג. כדי להגדיר את הטכניקה, שימש אפוליפופרוטאין B מדולדל סרום (ABDS) מתוך מאגר של תורמים בריא.
התנאים הטובים ביותר דילול עבור להארכה-כולסטרול בינוני והן אתנול נחקרו. בדקנו את התנהגות פלורסנט להארכה חינם-כולסטרול בסביבות הממס מספר, לרבות יחסים שונים של אתנול וביו -1640 RPMI השקופה. עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) להארכה-כולסטרול מדולל בתמיסה המימית הראו ערכי פי הנמוך ביותר, בעוד להארכה-הכולסטרול בתוך אתנול טהור הנפלטים על פי הגבוה ביותר. הדבר מצביע על כך פליטת קרינה פלואורסצנטית המולקולה 22-להארכה-כולסטרול תלויה מאוד המדיום שבו הוא הכיל. בהתאם לכך, האות זריחה של 22-להארכה-הכולסטרול גבוה משמעותית כאשר מניחים של אתנול המכיל מדיה. הבחנו כי ביחס של 1:1 מדיה: אתנול, האות עוצמת קרינה פלואורסצנטית מגביר באופן יחסי עם ריכוז הכולסטרול אנלוגי בטווח של 0.5 – 50 μM, רומז על התנהגות נאותה של המכשיר במקרה זה (איור 2 ). ההתנהגות ליניארית במצב 1:1 (מדיה: אתנול) מיוצג על-ידי המשוואה בצע: y = 20.88 x + 146.7 עם R2 = 0.9341.
צעד. מפתח בשיטה זו הוא הזמן בילה המקננת התאים טעון עם כולסטרול acceptors אז רמת הכולסטרול הוא מסוגל בזרימת. על מנת לקבוע את זמן הדגירה הנדרשים, המדיה הנייד היה נקצרו timepoints שונים (1 עד 24 שעות; איור 3). בזרימת כולסטרול בטווח של 0 עד 6 h התפתחו באופן ליניארי (p < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3) באופן תלוי-זמן. האות המרבי בשבי היה 6 שעות לאחר ABDS נוספה לתאים. לאחר 6 שעות, רמת הכולסטרול איבד סדירות בזרימת, אז השתנות גדל לאחר 6 שעות של דגירה עם ABDS (איור 3).
בנוסף בדקנו את סף רוויה ואת טווח דינמי שהוחלה על האדם ABDS על ידי מדידת CE-אחוזים שונים של מדיה המכילים HDL (ABDS). בזרימת להארכה-כולסטרול בוזמינותו תפוקה גבוהה (96-ובכן צלחת) התפתח באופן ליניארי בתוך ABDS 1 – 7%, איפה FI מוגברת באופן תלוי-ריכוז עם ABDS, להגיע לפסגה של כולסטרול בזרימת קיבולת 7% ABDS (איור 4). בריכוזים גבוהים יותר מ- 7%, פי ירד בחודש הופכי בין עם אחוז ABDS. ייתכן שהדבר אירע בגלל הכולסטרול היה צורך בהזנה חוזרת של שתאים מן להארכה-הכולסטרול טעון HDL נוכח בתקשורת.
השיטה הרגילה למדידת כולסטרול בזרימת משתמש כולסטרול התווית על-ידי רדיו (3H)16. כדי להעריך את הביצועים של השיטה מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלנו, עלינו לבצע, לעומת טכניקות פלורסנט והן התווית על-ידי רדיו. מצאנו כי הטכניקה המסורתית רדיואקטיביות ושיטת להארכה-כולסטרול שלנו היו מאוד בקורלציה (r פירסון = 0.97; p < 0.001) באמצעות ריכוזים שונים של ABDS (1 – 8%; איור 5). בסך הכל, הדבר מצביע על כי שיטת פלורסנט שלנו עשוי להיות תחליף בטוח יותר מאשר הטכניקה רדיואקטיבי.
בסופו של דבר, אנחנו לעומת השיטה שלנו שונה להארכה פלורסנט בדיקה. השווינו את השיטה שלנו לערכה assay מבוססת תא תפוקה גבוהה מסחרית שמטרתה לקבוע את בזרימת הכולסטרול בתאים (כולסטרול בזרימת assay קיט; מבוססת-תא). השיטה שפותחה בקבוצה שלנו היה רגיש לעליית ריכוז מקבל (% ABDS) בתוך CE ערכים בין 5 ל- 15%. עם זאת, ערכת מסחרי, ביצע ההוראות של היצרן, הביא CE אמצעים להלן 5% לאורך טווח של ABDS לבדיקה; לפיכך, לסה נ וכתוצאה מכך לא הושפע בעיקרו של דבר מתי ABDS היה גדל (איור 6).
איור 1: מבנה מולקולרי של כולסטרול טבעי (א) 22-להארכה-כולסטרול (ב), 25-להארכה-כולסטרול (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עוצמת קרינה פלואורסצנטית להארכה-כולסטרול (FI) עם יחס שונה של אתנול וביו -בינוני RPMI 1640 השקופה. להארכה-כולסטרול הייתה מעורבבת עם 1:0, 3:1, 1:1, 1:3, ו- 0:1 אתנול: יחסי גודל בינוני מימית בריכוזים להארכה-כולסטרול בין 0.5 ל- 50 מיקרומטר. פי אות זוהה על ידי luminometer עם הפרמטר רגישות שוכן בגובה 70 בתוכנה fluorimeter. האות האלחוטי תא lysate ומדיה נמדדה באמצעות לוחות 96-ובכן לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בזרימת הזמן-התקדמות להארכה-כולסטרול ב מקרופאגים THP 1-נגזר. ה-dmTHP-1, היו מפוצצות 5 מיקרומטר להארכה-כולסטרול, מודגרות עם 5% ABDS. תא מדיה נמדדו בצלחת 96-ובכן לבן-timepoints שונים (h 1-24). הערכים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן של בארות quadruplicate. האות האלחוטי אותרה על ידי luminometer עם הפרמטר רגישות שוכן בגובה 70 בתוכנה fluorimeter. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: בזרימת להארכה-כולסטרול ב- THP 1-נגזר מקרופאגים בצלחת 96-ובכן עם ריכוזים שונים של ABDS. התאים dmTHP-1 שטופלו 5 מיקרומטר להארכה-כולסטרול, מודגרות עם אחוזים שונים של ABDS, ו lysed עם אתנול. האות האלחוטי תא lysate ומדיה נמדדה באמצעות צלחת לבנה 96-ובכן fluorimeter-1:1 (אתנול: פירוק פתרון 1). האמצעים של פקדים שלילי (מדיה שאינו מטופל ABDS) היו המופחת ברמות מסופקים. הערכים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן של בארות triplicate. האות האלחוטי אותרה על ידי luminometer עם הפרמטר רגישות שוכן בגובה 50 בתוכנה fluorimeter. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: המתאם של כולסטרול להארכה ו [3H]-כולסטרול בזרימת ב מקרופאגים THP 1-נגזר. בעקבות dmTHP-1 עם המקביל מתויג-הכולסטרול עבור 6-אייץ '. בזרימת כולסטרול נמדדה באמצעות ABDS 1-8%. לקבלת דוגמאות להארכה-כולסטרול, האות פלורסנט זוהה באמצעות לוחות 96-ובכן לבן fluorimeter-1:1 אתנול: פירוק פתרון 1. האות האלחוטי אותרה על ידי luminometer עם הפרמטר רגישות שוכן בגובה 50 בתוכנה fluorimeter. עבור [3H]-כולסטרול, האות רדיואקטיבי התגלה באמצעות µL 100 של מדיום ודוגמאות תא lysate מעורבב עם נצנוץ קוקטייל ואדום על הדלפק נצנוץ, בעקבות פרוטוקול מתוארת על ידי נמוך ואח17. המתאם יעילות נקבע באמצעות מקדם המתאם של פירסון r. האמצעים של פקדים שלילי (מדיה שאינו מטופל ABDS) היו המופחת פלורסצנטיות והן רמות רדיואקטיביים הניתנים. הערכים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן של בארות triplicate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: השוואה בין תפוקה גבוהה להארכה-כולסטרול בזרימת assay וערכת ממוסחר פלורסנט assay מבוססת תא. כולסטרול בזרימת מ ABDS נאמד בעקבות פרוטוקול המתואר, באמצעות פירוק הממס אתנול (50%) או Tween 80 (1%). ערכת assay מבוססת תא פלורסנט הוערך לפי הפרוטוקול של היצרן בערכה. הערכים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן של בארות triplicate. האות האלחוטי היה שזיהה את luminometer עם הפרמטר רגישות שוכן בגובה 50 בתוכנה fluorimeter אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: דיאגרמת זרימת עבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: כולסטרול להארכה בזרימת של הדוגמאות סרום נגועים ב- HIV, פקד חיובי סטנדרטי (C +). וריאציית הבין-אישי של השיטה בזרימת להארכה-כולסטרול חל ערכת נגועים ב- HIV מוצג. פקד פנימי חיובי (C +) מייצג דה להארכה-כולסטרול בזרימת מתוך מאגר של sera דגימות של 8 מטופלים בריאים. קווי שגיאה מראים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתויג פלורסנט כולסטרול היא אסטרטגיה מבטיח לנתח ולחקור את המאפיינים ואת חילוף החומרים של הפריה טבעי כולסטרול. היתרונות העיקריים שלה הם כי זה שאפשר לקחת על ידי תאים, מאפשר תאיים ולימודים ממברנה הפצה, ולא ניתן להחיל על כולסטרול בזרימת מבחני כגון פרוטוקול זה (איור 7). בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מסוימים מאפשרים כולסטרול מעקב גופית כולל BODIPY-כולסטרול, כולסטרול dansyl, dehydroegrosterol ו- 22 ו- 25-להארכה-כולסטרול12. במיוחד, 22-להארכה-כולסטרול מתאים ללמוד dynamics כולסטרול עם סוגי תאים שונים, כתחליף כולסטרול התווית על-ידי רדיו18. לא קיימת הסכמה כללית שיטה להעריך את האות פלורסנט assay בזרימת כולסטרול. שיר et al.14 שנקטפו lysates בינוני ותא למדוד FI בנפרד; ליו et al.14 הועבר המדיום לוחות אחרים, ואת האות פלורסנט תאיים נמדד ישירות לצלחת תרבות; ג'אנג ואח15 פעם מאגר פירוק lyse תאי, ואחריו טיהור של רמת הכולסטרול פלורסנט למהול אותו באתנול טהור ולגלות את האות עוצמת קרינה פלואורסצנטית19. ב- assay בזרימת הכולסטרול שלנו, להשתמש הקומפוזיציה הסופית ממס באותה מדיה, תאים מותר המגון את התקשורת תא ומדידות של lysate בצורה יעילה.
המחקר הנוכחי צדודית של בזרימת להארכה-כולסטרול לאורך זמן ומצאתי התקדמות תלויי-זמן עד 6 שעות של דגירה עם ABDS מקבל, דומה אל השיר et al.14 , ליו ואח14 , בניגוד ג'אנג ואח שהשתמשו תקופת הדגירה 1 h עם השומנים acceptors19 מצאנו כי לאחר 6 שעות של דגירה, רמת הכולסטרול effluxed איבד ליניאריות; לכן חשוב ביותר לא יעלה על 6-אייץ '. שלנו טווח אופטימלי של כולסטרול בזרימת היה בין 3 עד 6 שעות לאחר הוספת את acceptors. אנו מציעים המקננת תאים במשך 4 שעות עם acceptors כולסטרול. פעולות קריטיות נוספות הן שימוש של אמצעי התקשורת השקופה כדי להחיל את acceptors על מנת להימנע רקע, זריעה שכבה תרבות תא confluent למחצה, ומבטיחה של הדבקות הנכון של אלה לצלחת. יצוין התחתון ברור של צלחת לבנה שימושית לעקוב אחר התאים תחת מיקרוסקופ אור ההופכי.
רוב מבחני בזרימת כולסטרול מתבצעות באמצעות השומנים מטוהרים acceptors במבחן בזרימת כולסטרול. נוכח הטכניקה פותחה כדי לקבל את קיבולת בזרימת הכולסטרול בנסיוב אדם או דגימות פלסמה. אנו משתמשים acceptors של כולסטרול מהותי נוכח הסרום, אבל זה קריטי כדי להסיר את החלקיקים המכיל אפוליפופרוטאין B, אשר recirculate מולקולות הכולסטרול בתוך תאים20,21. כמו שינויים, מטוהרים ApoAI וה -HDL יכול לשמש גם acceptors. בנוסף, שורות תאים שאינו THP אנושי-1 שימשו בהצלחה במבחני בזרימת כולסטרול פלורסנט, כגון מקרופאגים Raw 264.7 או J774A1 וכך ובכך עבודה סביר שלנו שיטת15,22.
המגבלות העיקריות של שיטה זו היא התוצאות תלויות הקו תא ספציפי, קו תא סטנדרטי אבל שיטה ללא תא יהיה יתרון לשימוש כמו סמן. כמו כן, שרה נהגו לתקנן בשיטה זו היה קפוא; moiety להארכה על כולסטרול הוא פיזיולוגי פחות מזו התווית על-ידי רדיו, ספיגת שלה שונה כולסטרול אנדוגני; בדקנו את התוצאה הסופית של קבוצת תהליכים (כלומר חלקיקים סרום מעורבים, , תאים בטור, אפשרי esterification של כולסטרול, ייתכן פעפוע של כולסטרול או בזרימת סימולטני ותהליכי זרם). עם זאת, כיתרון, טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית הראו שיש פוטנציאל גבוה וליישמו על טכניקות מתויג רדיו מסורתיות, ההחלפה של [3H]-כולסטרול, על ידי מולקולה מתויג פלורסנט לפקח כולסטרול בזרימת מבחני14.
כולסטרול בזרימת עשוי לשמש סמן של טרשת עורקים23, כפי שזה עולה בקנה אחד עם אירועי לב וכלי דם העתיד24,25. אפשרות ללמוד את התפקיד של מקרופאגים ב טרשת עורקים היא דרך HDLs מטוהרים והרכב שלו; עם זאת, טיהור HDLs היא תהליך מפרך ולגזול. חוץ מזה, במהלך הטיהור, רכיבים אחרים סרום עם אפקט atherogenic ייתכן המעיט או אבד. מסיבה זו, ABDS נבחר מקבל השומנים. סולם תפוקה גבוהה וצמצום הזמן התאפשרו בזכות מחליף את המונה נצנוץ קורא צלחת, מדידת אות ניאון בצלחת תרבות אותו (במקרה של התא lysate), והפחתת הפרוטוקול ביומיים. יתר על כן, טכניקה זו מראה רגישות גבוהה יותר כאשר תאים נחשפים ריכוזים שונים של סרום מאשר האמצעים המתקבל ערכת ממוסחר להעריך בזרימת כולסטרול.
לסיכום, תואר וזמינותו בזרימת להארכה-כולסטרול זה עולה בקנה אחד עם השיטה המסורתית רדיואקטיבי. אנחנו נקבע הזמן האופטימלי דגירה השומנים acceptors מדגימות אנושי (סרום או פלזמה) בצורה של ABDS. אנחנו אופטימיזציה את תא זריעה, בידול, טווח דינמי, ונקודת הרוויה של הטכניקה. לגבי החידוש העיקרי שלה, אנחנו אופטימיזציה שילוב הממס נעשה שימוש במדידות להשגת בעוצמות גבוהות ומגוון ליניארי משופרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים רוצה להצהיר כי הם הממציאים של הבקשה לרישום פטנט (EPO; 18382337.6-1118; 17 במאי 2018) זכאי "שיטה לקביעת בזרימת כולסטרול" המבוסס על שיטה זו.
Acknowledgments
עבודה זו היא נתמכה חלקית על ידי המחקר מעניקה FIS (PS12/00866) מ אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי, מדריד, ספרד; Fondo Europeo פארא el Desarrollo אזוריים (פדר); אדום de Investigación en סידה (RIS), ISCIII-RETIC (RD16 0025 0002) ותוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה. המחברים תודה את Retrovirology ואת המעבדה Immunopathology ויראלי של d'Investigacions אינסטיטוט Biomèdiques אוגוסט Pi I Sunyer (IDIBAPS). אנו מודים Escribà ט Rovira ג, ג הורטדו סיוע, Cufí ס מ הידע ואת טכנולוגיית העברת המשרד להדרכה שלה בהגנה על ההמצאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
