Summary
血清または血漿マクロファージ細胞モデルの in vitro におけるコレステロール排出能力の測定は、動脈硬化症のバイオ マーカーとして有望なツールです。本研究で我々 は、蛍光 NBD コレステロール排出法を標準化して 96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発を最適化します。
Abstract
動脈硬化は、心血管疾患 (CVD) に します。コレステロール HDL (cHDL) 濃度が動脈硬化の進展に因果的役割を果たしているかどうかは不明です。しかし、アテローマ プラーク形成の初期段階に重要な要因は HDL (大食細胞からコレステロールを受け入れるように HDL 粒子の能力) はコレステロール排出容量泡沫細胞の形成を避けるために。これは、血管内皮細胞との逆のコレステロールの輸送 (RCT) 肝臓でコレステロールを排除するために一部のコレステロールの蓄積を回避する上で重要なステップです。血清またはマクロファージ細胞モデルにおける血漿コレステロール排出能力は、アテローム性動脈硬化のマーカーとして使用できる有望なツールです。伝統的に、[3H]-コレステロールは、コレステロール排出試金で使用されています。本研究では THP-1 由来マクロファージのコレステロール摂取量と流出プロセスをトレースするアッセイで蛍光標識コレステロール (NBD コレステロール) を使用してより安全でより高速な戦略を開発する目指しています。最後に、我々 は、最適化 NBD コレステロール排出方法を標準化、96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発します。
Introduction
世界保健機関によると、死の世界の現在の主な原因は虚血性心疾患と脳卒中 (1520 万の死の合計のための会計)1。どちらも、動脈硬化や血管の2,3アテローム斑の破裂によって付けることができます心血管疾患 (CVD)。
動脈硬化は、血管壁炎症性疾患、マクロファージ、T 細胞、肥満細胞、樹状細胞、血管内皮細胞に潜入し、最終的に動脈硬化性プラークを形成、血から蓄積です。動脈硬化性プラークは脂質に頸動脈内膜メディアの厚さ4、5の高解像度の B モード超音波測定によって立証される、コアとコレステロールの結晶を提示します。マクロファージ、脂質受容体粒子へのコレステロール排出 (ABCG1) ATP 結合カセット (ABC) 受容体 ABCA1、ATP 結合カセット亜科 G メンバー 1 の手段とスカベン ジャー受容体 SR 双方向で実行されます。コレステロールの流入と流出マクロファージの不均衡は、アテローム性動脈硬化開始6キー プロセスと見なされます。プラズマに末梢の組織からコレステロール除去の重要なステップ、逆のコレステロールの輸送 (RCT) と呼ばれるプロセスで肝臓コレステロール排出であります。コレステロールは、主にアポリポ蛋白 A1 (ApoA1) 見つけられる大食細胞高密度リポタンパク質 (HDL) 粒子の表面にから転送されます。Hdl は、排泄と再利用の7,8,9の肝臓へのコレステロールを輸送します。
伝統的に、トリチウム (3H) ラジオ ラベル コレステロールは、コレステロール排出10で使用されています。放射性同位元素の発光信号が高感度10;但し、無線標識のコレステロールは長いプロトコル、電離放射線への暴露のリスクと放射性排出物の安全な取り扱いを確保するため特別な放射能設備と機器の必要性など明らかな障害を示します。それどころか、蛍光は蛍光信号検出、さまざまな fluorophores が付いて、およびその安全性11の単純さのための診断技術で正常に組み込まれています。いくつか蛍光標識ステロールは、コレステロールの代謝 (蛍光) と dehydroergosterol, ダンシル コレステロール, 4, 4-フッ素-3 a、4adiaza s indacene を含む (団) を研究に使用されている - コレステロール、および 22-(n-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD コレステロール)。特に、NBD コレステロールは人間の細胞12の効率的な吸収を示します。2 つ異なる NBD ラベル-コレステロールは、現在利用可能な: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) と 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD;図 1)。コレステロール 22 NBD 部が付いた可能性がありますコレステロール排出研究合わせて最高 25 NBD コレステロールは細胞膜のダイナミクス研究13,14で主に使用します。
通常コレステロールの体外排出の試金で使用される細胞は、THP 1 ひと白血病細胞、マウスの未加工 264.7 のセルの15、J774.1 など単球のようなセルです。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を用いてマクロファージに分化可能これらのセルのすべてが、THP-1 由来マクロファージ (dmTHP-1) ベスト反映、ヒトマクロファージ16を模倣します。
本研究では、最適化し、代わりに [3H] 22 NBD コレステロールを使用して dmTHP - 1、血清のコレステロール排出容量を決定する蛍光高スループット方法を標準化-コレステロール。さらに、我々 は標準的な放射性アナログと最適化された蛍光法を比較します。
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Protocol
本研究では、倫理委員会の承認 (Comitè Ètic d'Investigació 早速、病院クリニック、バルセロナ; 承認番号 HCB/2014/0756) とすべての科目の通知書面による同意が得られました。
1. NBD コレステロール準備
- NBD-コレス トロールを溶かし (MW 494.63; 参照テーブルの材料) で純粋なエタノール (2 mM) の株式を取得します。10 mg バイアル 10.1 mL 量の 2 mM の在庫を取得するエタノールで全体バイアル内容を解散します。
- 5 μ M の最終濃度に到達する 10% 胎仔ウシ血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシン (R10 中) を添加した RPMI 1640 年に在庫から NBD コレステロールを希釈 (例えば, 5 μ M 最終濃度で NBD コレステロールの 10 mL を取得) でR10 中 NBD コレステロール株式 (2 mM) の 25 μ L を希釈します。このボリュームは、96 ウェル プレートで十分です。
2. 細胞培養と播種 (日 2)
- 37 ° C、5% CO2で R10 中文化 thp-1 細胞。3 日おき 0.3 x 106セル/mL に調整します。
- シード 106細胞/ウェル R10 中 (100 μ L/ウェル) × 0.2 でフラットな底で白い 96 ウェル プレート内のセル。
- 100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートで細胞を治療 (PMA; 10 μ M 在庫から) 48-72 h、37 ° C で培養の THP 1 を区別するために 5% CO2セルの dmTHP 1 に。
注:PMA 株式 (10 μ M) の 5 μ L を使用するは、500 μ L の R10 媒体でそれをお勧めします。これに先立ち、準備 10 μ M PMA 株式ジメチルスルホキシド (DMSO)、分注、-20 ° C で在庫の 10 mL に 1 g の凍結乾燥バイアルを溶解することにより - また (提案) 結合手順 2.2 および 2.3 より均質化のため。10 mL を 15 mL チューブで thp-1 細胞を準備、PMA 株式 (10 μ M) 200 μ L を追加、優しく、ミックス、すぐに 100 μ L/ウェル プレートを播きます。2.3 の手順で説明するように、セルをインキュベートします。
3. アポリポ蛋白 B 枯渇血清 (ABDS) 準備 (2 または 3 日目)
- ポリエチレング リコール (PEG) 溶液を準備、グリシン pH 7.4 で 200 mM の濃度 (滅菌 H2O) と 10 %pbs で希釈します。ペグを取得するペグ 8000 の 10 g を 200 mM グリシンの 40 mL を加えて 20% (w/v)。均質化に、積極的にソリューションをミックスします。
- 4 の適用の 20% の部分 1.5 mL チューブの血清/血漿検体の血清/血漿の 10 部分ごとペグし、25 分17氷の混合物を残す (例えば、100 μ L の血漿または血清、追加 20% の 40 μ L のペグ ソリューション)。
- 4 ° C で 15 分間 13,000 x gでペグ アポリポ蛋白 B 沈殿を遠心分離します。
- 沈殿物を破棄します。上清を新しいチューブに転送します。
注:(新鮮な) 3 日目、ABDS の準備をお勧めします。それができない場合は、2 日目に、ABDS を準備し、一晩で 4 ° C を維持します。
4. NBD コレステロール セル読み込み (2 日目)
- DmTHP 1 の培養液を破棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 と 2 回細胞を洗浄します。
- 5 μ M とロードセル NBD コレステロール (100 μ L/ウェル) R10 培地で 37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートし、。
5. コレステロール受容体 (3 日目) の孵化
- 媒体を廃棄し、PBS で 2 回細胞を洗浄します。
- 2-5 %abds または 37 ° C で 4-6 時間無色 RPMI 1640 培地 (100 μ L/ウェル) で希釈精製脂質受容体 (HDL、脊椎、アポ等) の目的の濃度で細胞をインキュベートします。
注: 否定的な制御 (c-) 受容体と肯定的な制御 (C +) (例えば、健常者のプールから ABDS) または Hdl を精製せず無色 RPMI 1640 媒体から成るが含まれます。メモ (補足図 1) を分析した肯定的な制御は、特に患者サンプル (病態) が適用されます。 - 細胞溶解液 1 (50 mM Tris バッファーは、150 mM の NaCl、H2O) の 200 mL の在庫を準備します。換散の解決策 2 を取得する純粋なエタノールとセル換散の解決策 1 1:1 (v: v) で比率をミックスします。
6. 蛍光信号 (3 日目)
-
メディア NBD コレステロール検出
- 細胞の培地をプレートから外し、不透明なフラットボトムと新しい白 96 ウェル プレートで収集します。
- メディア サンプルに最適な蛍光信号検出、白 96 ウェル プレートで 1:1 の比率を取得する各媒体サンプルの 100 μ L に純粋なエタノールの 100 μ L を追加します。
- ルミノの 463⁄536 nm (励起/蛍光) 波長の蛍光強度 (FI) さらにメジャーに扱われたメディアでプレートを保持します。
-
細胞内のコレステロール NBD 検出
- PBS で 2 回細胞を洗浄します。
- 細胞内のコレステロールを得るためには、溶解液 2 ウェルあたりの 100 μ L とそれらをインキュベートし、細胞を溶解、室温 (RT) 25 分でプレートを振る。
- 細胞ライセート サンプルに最適な蛍光検出が同じ白のセル lysates の蛍光強度をキャプチャの 96 ウェル プレートはフラット クリア (細胞が播種手順 2.2 で同じプレート) を下します。
- 6.3 ソフトウェアで 50 の感度パラメーターを調整しながら、ルミノ (FI) の蛍光強度を測定 (材料の表を参照してください)。
7. 結果分析
- ような割合の式で計算サンプルのコレステロール排出率を表します。
- CE からネガティブ コントロール (サンプル NBD コレステロールで読み込まれますが、コレステロール受容体なしの無色の RPMI 1640 媒体で培養) の CE を差し引くことによってコレステロール排出 (CE) の最終測定を取得、指定したサンプル。
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Representative Results
コレステロール排出分析の目的は、生体外で与えられた血清、血漿、または HDL 粒子を含む上清のコレステロール排出容量を決定します。メソッドは標準のマクロファージ細胞株の培養にラベル コレステロールを読み込んで、セルと FBS 自由な媒体に希釈した試験サンプルと接触を誘発するから成っています。最後に、メディアと細胞ライセート、NBD から蛍光レベルが測定されます。測定を最適化するには、メディアへの細胞から effluxed コレステロール混合エタノールを含む溶媒の 1 つのボリュームです。NBD コレステロールを細胞の残りはエタノールや測定前に洗剤を含む溶媒に再停止されます。最後に、effluxed/合計ラベル コレステロールの比率が決定されます。テクニックを設定、アポリポ蛋白 B 枯渇血清 (ABDS) 健常者のプールを使用しました。
中規模およびエタノール NBD コレステロールに最適な希釈条件を調べた。エタノールと無色 RPMI 1640 の異なる比率を含むいくつかの溶媒環境で無料 NBD コレステロールの蛍光挙動をテストします。NBD コレステロール希釈水溶液の蛍光強度 (FI) は下位の FI 値を示し、純粋なエタノール内の NBD コレステロール排出最高 FI。これは 22 NBD コレステロール分子の蛍光性の放出が含まれているメディアに大きく依存して示唆しています。したがって、22 NBD コレステロールの蛍光信号が有意に高いメディアを含むエタノールに置かれました。1:1 メディア: エタノールの比率で蛍光強度信号と増加する比例して 0.5-50 μ M、この場合、プローブの適切な行動を示唆しているの範囲でアナログのコレステロールの濃度 (図 2を見ました).1:1 の状態 (メディア: エタノール) で線形動作に従って方程式によって表されます: y = 20.88 x + R2 146.7 = 0.9341。
このメソッドの重要なステップは、アドロイに読み込まれたコレステロール受容体とコレステロールが排出することができるので時間ができました。異なる縦長 (1 に 24 h; で収穫された携帯メディア必要なインキュベーション時間を決定するために図 3)。0 〜 6 時間の範囲でコレステロール排出が直線的に進化した (p < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3) 時間依存的に。ABDS をセルに追加した後、キャプチャ最大信号は 6 h でだった。6 時間後、コレステロールは ABDS (図 3) の孵化の 6 時間後に変動が増加したので、排出の規則性を失った。
我々 はさらに HDL を含むメディア (ABDS) 別の割合で CE を測定することにより人間 ABDS に適用される飽和とダイナミック レンジをテストしました。高スループット試金 (96 ウェル プレート) の NBD コレステロール排出進化して 7 %abds (図 4) のコレステロール排出能力のピークに達し、ABDS で濃度依存的に増加した当ホテルは、1-7 %abds 直線的。7% よりも高い濃度で FI は ABDS 割合と逆の関係に減少しました。これは、NBD コレステロールからセル読み込み HDL メディアに存在コレステロールを再入力されたために発生した可能性があります。
コレステロールの排出を測定する標準的な方法は、標識 (3H) コレステロール16を使用します。蛍光法のパフォーマンスを評価するには、実施し、蛍光標識技術を比較.伝統的な放射能技術と NBD コレステロール手法が高い相関していることがわかった (ピアソンの r = 0.97; p < 0.001) ABDS (1-8% の濃度の異なるを使用して図 5)。全体的にみて、これは私たちの蛍光法は放射性の方法よりもより安全な代替こと示唆しています。
最後に、蛍光プローブ NBD とは異なる手法を比較しました。細胞内コレステロールの排出を決定することを目的商業高スループット セルベースのアッセイ キットに本手法を比較した (コレステロール排出アッセイ キット; 細胞ベース)。私たちのグループで開発した方法は、アクセプタ濃度 (%abds) CE 値は 5 ~ 15% の増加に敏感だった。しかし、市販キット、実行製造元の指示に従って結果試金; ABDS の範囲に沿って 5% 以下 CE 対策したがって、結果として得られる CE 本質的に影響されなかったとき ABDS が増加した (図 6)。
図 1: 自然コレステロール (A)、22 NBD コレステロール (B) と (C) 25-NBD-コレステロールの分子構造。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: エタノール無色 RPMI 1640 中小の異なる比率で NBD コレステロール蛍光強度 (FI).NBD コレステロールは 0、3:1、1:1、1:3、1:0 で希釈した: 1 エタノール: 0.5 と 50 μ M. FI 間 NBD コレステロール濃度水溶液中比信号感度パラメーター蛍光ソフトウェアで 70 に設定して、ルミノ メーターで検出されました。メディアや細胞ライセートの FI 信号は、白の 96 ウェル プレートを用いて測定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: THP-1 由来マクロファージの時間進行 NBD コレステロール排出。DmTHP 1 が 5 μ M と読み込まれた NBD コレステロール 5 %abds と孵化させると。携帯メディアは、異なる縦長 (1-24 h) で白 96 ウェル プレートで測定しました。値は、平均 ± 標準偏差, 井戸として掲載されています。蛍光ソフトウェアで 70 に設定感度パラメーターで、ルミノ メーターで FI 信号が検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 96 ウェル ABDS の異なる濃度のプレートで THP-1 由来マクロファージの NBD コレステロール排出。DmTHP 1 セルを施した 5 μ M、NBD コレステロール ABDS、割合が異なると孵化し、エタノールと分離します。メディアや細胞ライセートの FI 信号は、1:1 (エタノール: 溶解液 1) 蛍光の白 96 ウェル プレートを用いて測定しました。ネガティブ コントロール (ABDS 未処理メディア) の対策は、提供されるレベルで引かれています。値は、帳票の井戸の平均 ± 標準偏差として掲載されています。蛍光ソフトウェアで 50 に設定感度パラメーターで、ルミノ メーターで FI 信号が検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 相関 NBD コレステロールの [3H]-THP-1 由来マクロファージにおけるコレステロール排出。次の 6 時間の対応するラベル コレステロールと dmTHP 1。コレステロールの排出は 1-8 %abds を用いて測定しました。NBD コレステロール サンプルの 1:1 エタノール: 換散解決策 1 で蛍光の白 96 ウェルのプレートを使用して蛍光シグナルが検出されました。蛍光ソフトウェアで 50 に設定感度パラメーターで、ルミノ メーターで FI 信号が検出されました。[3H]-コレステロールのサンプル、放射性の信号中の 100 μ L を使用して検出されたおよび細胞ライセート シンチレーション カクテルと低ら17.によって記述されたプロトコルに従う、シンチレーション カウンターの赤を混ぜてピアソンの相関係数を用いて相関効率だった。ネガティブ コントロール (ABDS 未処理メディア) の対策は、蛍光と提供される放射性レベルの両方から引かれています。値は、帳票の井戸の平均 ± 標準偏差として掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 高スループット NBD コレステロール排出アッセイと製品化蛍光細胞ベースのアッセイ キット比較します。溶解溶媒エタノール (50%) と Tween 80 (1%) を使用して、記載されているプロトコルに従う ABDS からコレステロール排出が評価されました。蛍光細胞ベースのアッセイ キットはキットの製造元のプロトコルに従って評価されました。値は、帳票の井戸の平均 ± 標準偏差として掲載されています。FI 信号感度パラメーター蛍光ソフトウェアで 50 に設定して、ルミノ メーターで検出されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: ワークフロー ダイアグラム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: HIV 感染患者および標準的な肯定的な制御 (C +) からの血清サンプルの NBD コレステロール排出。HIV 感染患者のセットに適用される NBD コレステロール排出方法の個体間の変動が表示されます。肯定的な内部制御 (C +) は、8 の健康な患者の血清サンプルのプールからデ NBD コレステロール排出を表します。エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
蛍光標識されたコレステロールは、分析してプロパティおよび自然なコレステロールの体外代謝を調べる有望な戦略です。その主な利点は、それは、細胞内では、細胞によってとることができる膜分布研究科このプロトコル (図 7) のようにこのようなコレステロール排出アッセイを適用ことができます。いくつかの蛍光標識ステロールは、BODIPY コレステロール、ダンシル コレステロール、dehydroegrosterol、22 と 25 NBD コレステロール12を含む体外コレステロールの追跡を許可します。特に、22 NBD コレステロールは、異なる種類の細胞、コレステロールの標識18の代用品としてコレステロール動態を勉強に適しています。コンセンサス コレステロール排出アッセイ、蛍光信号を評価する方法はありません。歌ら14収穫 FI を個別に測定する媒体およびセル lysates劉ら14媒体を他のプレートに転送され、細胞内蛍光シグナルを培養プレート; 直接測定しました。張ら15換散バッファー純粋なエタノールで希釈し、蛍光強度信号19を検出する蛍光コレステロールの精製に続いて、細胞を溶解するために使用します。我々 のコレステロール排出分析メディア、携帯メディアの均質化とライセートの測定を効率的に許可されて細胞の同じ最終溶媒組成物の使用します。
本研究で時間をかけて NBD コレステロール排出をプロファイルし、アクセプタ ABDS、歌ら14と劉ら14と 1 h の潜伏期間を使用した張ら. とは異なり類似の孵化の 6 h までの時間依存進行を発見脂質受容体19。我々 が見つかりました後 6 時間、effluxed コレステロール失った直線性;したがって、それは 6 時間を超えないように重要です。コレステロールの排出の私達の最適範囲は内容を追加した後 3 〜 6 時間の間だった。4 h コレステロール受容体の細胞を培養をお勧めします。追加の重要なステップは、背景、シード半合流細胞文化層とプレートにそれらの適切な遵守を確保するを避けるために、受容体を適用する無色のメディアの使用です。それは、白いプレートの透明な底、逆光顕微鏡下で細胞を追うに便利注意してください。
ほとんどのコレステロール排出アッセイは、コレステロール排出テストで精製された脂質受容体を使用して実行されます。本手法は、血清または血漿サンプルからコレステロール排出容量を取得する開発されました。本質的なコレステロール受容体血清の存在が、アポリポ蛋白コレステロール分子細胞20,21内部に循環させると B を含む粒子を除去することが重要。変更として浄化された ApoAI および HDL も使用できますアクセプタとして。また、人間 THP 1 以外の細胞蛍光コレステロール排出アッセイ、未加工 264.7 または J774A1 マクロファージなどで正常に使用されていると私たち法15,22可能性が高い仕事。
このメソッドの主な制限無細胞メソッドは、バイオ マーカーとして使用に有利であろう結果特定のセル行、スタンダードセル ラインに依存するということです。また、この方法を標準化するために使用する血清は凍っていた。コレステロールの NBD 部は標識の 1 つよりより少なく生理とその摂取異なる内因性コレステロール;我々 は一連のプロセス (すなわち,を含む血清粒子細胞、コレステロールの可能なエステル、コレステロールや同時流出と流入プロセスの可能な限り拡散) の最終結果をテストします。ただし、利点として蛍光ベースの手法が示されている可能性が高い [3H] の代替、伝統的な放射能標識技術の代替として-を監視する蛍光標識分子によるコレステロールコレステロール排出14をの試金します。
それが将来の心血管イベント24,25と相関コレステロール排出23、アテローム性動脈硬化バイオ マーカーとして動作可能性があります。動脈硬化におけるマクロファージの役割を研究する可能性が Hdl を精製してその組成;ただし、Hdl の浄化は困難、時間のかかるプロセスです。その上、浄化、動脈硬化作用を持つ他の血清成分過小評価または失われました。そのため、ABDS 脂質受容体として選ばれました。高スループット スケールと時間の短縮は、プレート リーダーのシンチレーション カウンターを使って、(の場合、細胞ライセート)、同じ培養プレートの蛍光信号の測定を 2 日間プロトコルを減らすことによって可能に作られました。さらに、この手法は、細胞が血中コレステロール排出を評価する実用化キットから得られた対策の異なる濃度にさらされる感受性を示しています。
結論としては、従来の放射性方法と相関 NBD コレステロール排出分析が記載されています。ABDS の形で人間のサンプル (血清または血漿) から脂質受容体をインキュベートする最適な時間を決定しました。私たちは細胞、分化、ダイナミック レンジとテクニックの飽和点を最適化されています。その主な目新しさは、高強度と改善された線形範囲を取得するための測定で使用される溶媒の組み合わせを最適化されています。
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Disclosures
著者が権利特許出願 (EPO; 18382337.6 1118 2018 年 5 月 17 日) の発明者であることを宣言する「コレステロール排出法」は、この法に基づきます。
Acknowledgments
この作品は、部分的に支えられてきた研究は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、マドリード、スペインから FIS (PS12/00866) を付与フォンド Europeo パラ エル開発地域 (フェダー);レッド ・ デ ・危惧アン SIDA (RIS) ISCIII 主任 (RD16/0025/0002)、CERCA プログラム/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ。レトロ ウイルス免疫病理学講座研究所 d'Investigacions Biomèdiques 8 月 Pi 私スニェ (IDIBAPS) を著者に感謝します。発明を保護する上で彼女の指導のため彼らの支援と知識と技術移転オフィスから s. Cufí、t. Escribà、C. Rovira と C. フルタドに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
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