Summary
Kan oksijen-düzey-bağımlı tarafından fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (kalın fMRI) (S1BF denir) karşılık gelen somatosensor varil alan korteks alanı doğru olan aktif, ana kontrol ettikten sonra bu çalışmanın hedeftir laktat içeriği ölçmek için 7 T., yerelleştirilmiş proton manyetik rezonans spektroskopi (1H-Bayan) tarafından aktif sıçan beyin dalgalanmalar
Abstract
Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi serebral metaboliti içeriği vivo ölçmek için fırsat bir teklifi ve noninvazif. Son on yılda ve manyetik alan şiddeti artış teknolojik gelişmeler sayesinde, şimdi iyi bir çözünürlük spectra vivo içinde sıçan beyin elde etmek mümkündür. Neuroenergetics (yani, beyin metabolizma çalışma) ve, özellikle, farklı hücre tipleri arasındaki metabolik etkileşimler son yıllarda daha fazla ilgi çekmiştir. Bu metabolik etkileşimler arasında laktat Servisi neurons ve astrocytes arasında varlığını hala tartışılıyor. Böylece, işlevsel proton manyetik rezonans spektroskopi (1H-Bayan) bir beyin harekete geçirmek ve monitör laktat sıçan modelinde gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Ancak, metil laktat tepe lipid rezonans zirveleri ile çakışıyor ve ölçmek zordur. Aşağıda açıklanan protokol metabolik sağlar ve bir aktif beyin alanında izlenecek dalgalanmaları laktat. Serebral harekete geçirmek bıyık stimülasyon tarafından alınır ve 1H-Bayan olan alanı kan oksijen düzeyi bağlı fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (kalın fMRI) kullanarak algılanır karşılık gelen aktif varil korteks içinde gerçekleştirilir. Tam olarak açıklanan tüm adımları: anestezi, bobinler ve sıraları, verimli bıyık stimülasyon mıknatıs ve veri işleme içinde doğrudan ulaşma seçimi.
Introduction
Beyin, büyük substrat (yani, glikoz), düzenleme izin iç mekanizmaları katkılarını ve yerel serebral etkinlik değişimler bağlı olarak kendi kullanımı için hem de sahip olur. Glikoz beynin ana enerji substrat olsa da, son yıllarda gerçekleştirilen deneyler astrocytes tarafından üretilen bu laktat, verimli enerji substrat nöronlar için olabilir göstermiştir. Bu hipotezi laktat Servisi1astrocytes ve nöronlar arasında gündeme getiriyor. Astrocyte-nöron laktat Servisi2için ANLS bilinen teorisi hala çok tartışılan ama önerisi şu glikoz açmıştır, nerede içine metabolize astrocytes doğrudan neurons, içine girmek yerine laktat, değil bir metaboliti , sonra verimli enerji substrat kullanmak nöronlar için transfer. Böyle bir mekik vivo içindevarsa, birkaç önemli sonuçları, fonksiyonel beyin görüntüleme (pozitron emisyon tomografisi [PET]) temel teknikleri anlamak için ve gözlenen metabolik değişiklikler deşifre için olurdu beyin patolojiler.
Beyin metabolizma çalışmaya ve özellikle, sinir hücreleri ve astrocytes, dört ana teknikleri arasındaki metabolik etkileşimler mevcuttur (mikro - hariç / nanosensors): autoradiography, evde beslenen hayvan, iki fotonlu floresan confocal mikroskobu ve Bayan. Autoradiography önerilen ilk yöntemlerden birini ve radyoaktif 14C-2-deoxyglucose Beyin dilimleri, evde beslenen hayvan verimleri vivo içinde görüntüleri radyoaktif 18 bölgesel alım sırasında bölgesel birikimi görüntülerini sağlar F-deoxyglucose. İrradiative molekülleri düşük uzamsal çözünürlük fotoğraf üretirken kullanmanın olumsuz yanı zorundalar. İki fotonlu mikroskobu floresan problar hücresel çözümleme sağlayan, ancak doku tarafından ışık saçılma görüntüleme derinliğini sınırlar. Bu üç teknikler daha önce neuroenergetics Rodents bıyık stimülasyon3,4,5,6sırasında eğitim için kullanılmaktadır. Vivo MRS noninvaziv ve nonradioactive çift avantajı vardır ve herhangi bir beyin yapısı araştırdı. Ayrıca, MRS nöronal etkinleştirme, çok yakın zamanda kemirgenler7' de geliştirilen fonksiyonel MRS (fMRS) adında bir teknik sırasında gerçekleştirilir. Bu nedenle, 1H-Bayan vivo içinde ve noninvazif beyin aktivite sırasında beyin metabolizma izlemek için bir protokol önerilmiştir. Yordam yetişkin sıhhatli rats doğrudan bir 7 T manyetik rezonans (MR) Imager içinde gerçekleştirilen bir hava-puf bıyık stimülasyon tarafından elde edilen beyin aktivasyonu ile açıklanan ancak herhangi bir patolojik durumu yanı sıra genetiği değiştirilmiş hayvanlar adapte olabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) hayvan deney kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. Protokol Fransız tarım ve orman etik kurallar bir araya geldi ve yerel etik komiteleri tarafından kabul edildi (Comite d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).
Not: Bay ölçümler sırasında anestezi ve fizyolojik izleme (vücut ısısı, solunum hızı) yeterli düzeyde vazgeçilmez şartları vardır.
1. hayvanlar
- Erkek Wistar rats arasında 350 ve 450 g ağırlığında kullanın.
- Bir s açık: koyu döngüsü ve yiyecek sağlamak ve ad libitumsu 1212: üzerinde tutun.
2. anestezi
- Anestezi için gerekli ekipman hazırlamak (Şekil 1A, B, Tablo malzemelerigörmek): medetomidine (240 µg/kg/h, perfüzyon oranı 20 µL/dk), fizyolojik serum çözümde içeren bir 5 mL şırınga içeren bir 0.5 mL şırınga Atipamezole (0.5 mL tuzlu su çözeltisi içinde 20 μL) ve göz merhem.
Not: tüm ekipman dışında medetomidine, Bay alımları sırasında yerleştirilen mıknatıs yakınındaki şırınga pompa anestezi için içeren 5 mL şırınga extractor başlık altında tutun. - İndüksiyon odasında fare yerleştirin, anestezi % 4 isoflurane sunarak başlamak ve oksijen debi 1.5 L/dk ayarlayın.
- Anestezi derinliği pençe refleksleri çekilmesi değerlendirmek tarafından değerlendirmek.
- Sıçan uyarmaya vermezse, anestezi kutudan çıkar, onun burnuna isoflurane maskesi ile tezgah yerleştirin ve anestezi %2.5 1, 5 L/dk oksijen sunarak korumak.
- Yavaşça masaj kuyruğu ve turnike (Şekil 1 c) yerleştirin.
Not: Bir sıcaklık arasında 38 ve 42 ° C daha iyi vazodilatasyon damar elde etmek için sıcak suda masaj yapılabilir. - Periferik damar içi kateter (22 G), daha önce heparinized, sağa sola kuyruk damarda yerleştirin. Venöz dönüş görülmektedir unutmayın (bir damla kan iğne distal kısmında görülür) kateter ne zaman doğru bir şekilde (Şekil 1 d) eklenmiş.
- Fizyolojik serum çözüm ve heparin içeren 2 mL şırınga kullanarak kateter ölü boşluk hacmindeki varsa hava kabarcıkları dışarı darbe.
- Göz merhem uygulamak ve deneme sonunda fare uyandırmak için atipamezole (17 µg/mL) içeren şırınga hazırla.
3. fare yerleşim içinde mıknatıs bıyık uyarılması için
- Bir nefes sensör mıknatıs yatağa yerleştirin ve ardından kürsüye mıknatıs yatağa fare aktarın. Göğüs kafesi ve mıknatıs yatak arasında yer alan nefes sensörlü isoflurane maskesi, yüzükoyun sígara burnu ile yerleştirin.
Not: MRI odaya girdiği tüm ekipman MRI için güvenli olmalıdır. - Sıçan yerleştirme sırasında isoflurane (üzerinden % 1.5-%2 için % 4) azaltmak ve anestezi medetomidine, bu yordamın sonundaki geçin. Doğru bıyık ücretsiz, sıçan MRI yatak önceden bıyık hareketi sağlamak için ön sağ kenar kesim olduğundan emin olun.
- Fareyi bant ile pozisyonda tutun ve 60 ve 80 nefes / dakika arasında olması gereken onun nefes izlemek.
- İyi misin bıyık kâğıt şerit (Şekil 2) yakalar bir yelken yapmak. Esnek çıkış boru sıçan MRI yatak boyunca hava-puf sisteminin tüp çıkmadan bölümü dik olması ve yelken yaklaşık 1.5 cm hizalayın. Kâğıt şerit ile düzeltebilirim.
4. bıyık stimülasyon
- Esnek giriş borusu solenoid kontrol vana giriş ve çıkış boru solenoid kontrol Vana çıkış (Şekil 3) basınçlı hava kaynağından (1 bar) bağlayın. Solenoid kontrol vanası mıknatıs odasının dışında kalmasını sağlamak.
- Solenoid vana ve transistör transistör mantık (TTL) kullanarak mıknatıs içine nabız gibi atan aygıtı takın-bağlantı noktası. Yapılandırmak böylece nabız gibi atan frekans 8 Hz, nabız gibi atan saat = 20 = s ve dinlenme saati = 10 s.
Not: Bu parametreler, küçük sıvı kristal üzerinde görüntülenir (LCD) perde göstermek, ayarlanabilir üzerinden üç özel analog Potansiyometreler vardır. Paradigma denetler, elektronik nabız gibi atan aygıt (için doğru Post-Processing) zaman parametrelerinde herhangi bir drift önlemek için yüksek kaliteli Elektronik komponentleri oluşmalı.
5. kalın fMRI edinme
- Böylece dik bir pozisyonda sıçan beyin yerleştirin ve onu korumak için kulak çubuklarını kullanın. Birim dizi bobin sıçan baş (Şekil 4A) yukarıda yer ve bant kullanarak bunu düzeltin. Yelken (hastanın hareketi, hiç dönme ve yelken yok sürtünme) doğru hareket ediyor kontrol ne zaman hava-puf sistem üzerinde; o zaman, kapatın.
- Yatak ve bobin mıknatıs ortasına yerleştirin. Hava-puf sistem açıkkenyatağın içinde mıknatıs bir kez yelken doğru hala hareket ediyor kontrol edin; o zaman, kapatın. Geçiş tamamen isoflurane medetomidine için (perfüzyon oranı: 20 µL/dk).
- Kontrol fare iyi bir yerelleştirme sırası kullanılarak bulunan (TE 2.5 ms; = TR 100 ms; = Ortalama = 1; tekrarlama = 1; dilim = 1 mm; görüntü boyutu 256 x 256; = görüş alanı (FOV) = 50 x 50 mm; zaman inceden inceye gözden geçirmek = 12 s 800 ms). Öğretim adı Localizer sıra sekmesini sürükleyin ve devamet'i tıklatın.
- Yönergesi adı, Merkezi orta beyin, FOV T2_Star_FID_EPI sıra sekmesini sürükleyin ve düzenlenmiş tarama öğretim açmak için ayarlama platformu sekmesini tıklatın. Kayıt bir B0 Haritası ve bir tarama dolgu devam edin.
Not: bir B0 harita için aşağıdaki parametreleri kullanın: = ilk yankı zaman 1.65 ms; TR 20 ms, ortalama = = 1; açı çevirmek = 30 °; Echo aralığı 3.805 ms; = dilim 58 mm; = görüntü boyutu = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; zaman inceden inceye gözden geçirmek = 1 m 24 s 920 Bayan tarama dolgu için aşağıdaki parametreleri kullanın: Voksel seçici uyarma Buhar Gauss darbesi; = TE 5 ms; = karıştırma zamanı 10 ms; = satın alma süresi 204.8 ms; = bant genişliği = 10.000 Hz; Işınma Zamanı 50 μs =). - T2 Star_FID_EPI sırası başlatmak (TE 16.096 ms; = TR = 500 ms; Ortalama = 1; tekrarlama = 600; dilim = 1 mm; dört ardışık dilimler; görüntü boyutu 128 x 128; = FOV = 20 x 20 mm; bant genişliği 333,333.3 Hz; = inceden inceye gözden geçirmek zaman 5 dk 00 sn =).
Not: TTL bağlantı noktası nedeniyle, bir dış tetik sinyali aynı anda hava-puf sistem başlayacak. Paradigma = [20 s harekete geçirmek + 10 s dinlenme] 600 tarama, tarama başına 500 ms toplam süresi için x 10. Dilimleri varil alanının ortasına ortalanır. - İlki ile karşılaştırmak ve sıçan T2_Star_FID_EPI dizisi sırasında taşınmış olup olmadığını kontrol etmek için başka bir yerelleştirme sıra (aynı aynı derecede bir açıklandığı adım 5.3) edinin.
- Yatakta ilk konumuna getirmek, birim dizi bobin kaldırma ve yüzey bobin bağlanmak.
6. kalın işleme
- T2 Star_FID_EPI dosyasını açın ve T2 Star_FID_EPI görüntü görüntüsüokuyun. FunControlleradlı fonksiyonel denetleyicisi, başlangıç penceresini açın.
- Bu işleme sekmesinde fonksiyonel görüntüleme penceresi seçin ve stimülasyon protokolü tanımlar (süre ve münavebe on/ paradigma için karşılık gelenOff süreleri, kullanılan).
- İletişim kuralı pencere (600 kare ile veri kümesi) seçin ve değeri olan 40 Üzerinde süresi sekmesini ve 20 dakika süre sekmesini Ters çevir'i atıf sekmesini tıklatın sonra yerleştirin ve seçmek için soldaki Stimülasyon Birleşik kaydırıcısını sürükleyin değer 1.
- Önişleme penceresinde ön işleme için Medyan filtresi düzlemde ve post-processing Medyan filtresi (2D, 3D) tıklayın.
- Yürüt sekmesini ve imleçler bindirme arama tablosu ayarlamak için sürükleyin. Aktif beyin alan (Şekil 4B) görselleştirmek.
7. proton Bayan satın almalar
- Düzgün yüzey bobin konumlandırmak için fare kafa konumunu değiştirin. Yüzey bobin (Şekil 5A) yatay ve bulunduğu zaman mıknatıs içinde mıknatıs Merkezi'nde olurken sadece sol varil korteks üzerinde yerleştirilebilir başından (yaklaşık 30 ° saat yönünde) döndürür.
- Yüzey bobin yerleştirin, bant (Şekil 5B) kullanarak sıçan beyin tamir ve yelken (hastanın hareketi, hiç dönme ve yelken yok sürtünme) doğru hareket ediyor kontrol ne zaman hava-puf sistem üzerinde; daha sonra ana geçiş de kapatın.
- Hava-puf sistem açıkkenyatağın içinde mıknatıs bir kez yelken doğru hareket kontrol edin. O zaman, kapatın.
- Kontrol fare düzgün bir yerelleştirme sırası kullanılarak yerleştirilir. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: TE 2.5 ms; = TR 100 ms; = Ortalama = 1; tekrarlama = 1; dilim = 1 mm; görüntü boyutu 256 x 256; = FOV = 50 x 50 mm; zaman inceden inceye gözden geçirmek = 12 s 800 ms.
- Localizer sıra sekmesini yönergesi adı penceresine sürükleyin ve tarama programını yürütmek için devam et sekmesini tıklatın.
- Beyin yerelleştirme doğru olduğunda, öğretim adı penceresinde T2_TurboRARE sıra sekmesini sürükleyin ve tarama programını yürütmek için devam et'i tıklatın. Önceki kalın fMRI satın alma, birlikte bu anatomik görüntüleri Voksel doğru lokalizasyonu için MRS S1BF izin verir.
Not: T2_TurboRARE parametreleridir 14 dilimleri, dilim, FOV başına 2 mm 2.5 x 2, 5 cm, TE = 100 ms, TR = 5000 ms = matris = 128 x 128, sıra zaman 2 dk 40 sn =. - Lazer sıra sekmesini yönergesi adı penceresine sürükleyin, voxel (2 mm yüksek, 2.5 mm uzunluğunda, 3 mm derin) S1BF alanının merkezinde yer.
- Bir sıçan beyin atlas ve kalın fMRI Geliştirme Bölgesi T2 görüntülerde (Şekil 6) yerelleştirmek için kullanın. Düzenlenmiş tarama öğretim açmak için ayarlama platformu sekmesini tıklatın. Wobble sekmesinde tıklatın ve biraz ayarlamak için alma bobin Empedans (elektronik yükleme) değiştirin. Ayarlama öğretim Düzenleyicisi'ni kapatın ve düzenlenmiş öğretim değişiklikleri uygulamak için sona erdiğinde Uygula sekmesini tıklatın.
- Kayıt bir B0 Haritası ve dolgu inceden inceye gözden geçirmek ve daha sonra yerel bir shim gerçekleştirmek için devam edin.
Not: B0 harita için aşağıdaki parametreleri kullanın: = ilk yankı zaman 1.65 ms; TR 20 ms, ortalama = = 1; açı çevirmek = 30 °; Echo aralığı 3.805 ms; = dilim 58 mm; = görüntü boyutu = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; zaman inceden inceye gözden geçirmek = 1 m 24 s 920 Bayan tarama dolgu için aşağıdaki parametreleri kullanın: Voksel seçici uyarma Buhar Gauss darbesi; TE 5 ms; = karıştırma zamanı 10 ms; = satın alma süresi 204.8 ms; = bant genişliği = 10.000 Hz; Işınma Zamanı 50 μs =. Yerel dolgu için aşağıdaki parametreleri kullanın: su bastırma, buhar satın alma süresi 1,363.15 ms; = puan 4.096; = bant genişliği Hz 3,004.81 Hz; = ppm bant genişliği = 10 ppm; Işınma Zamanı 166.40 μs; = Spektral Çözünürlük = 0.37 Hz/puan. Lazer parametreler şunlardır: echo zaman 19.26 ms; = TR = 2500 ms; Ortalama = 128 veya 32; zaman inceden inceye gözden geçirmek = 5 dk 20 sn veya 1 dk 20 sn; toplama noktaları 4096 =. - 1H-Bayan gerçekleştirin.
- 1H-Bayan edinme dinlenme döneminde ilk başlayın (4 x 32 lazer taramaları + 128 lazer inceden inceye gözden geçirmek; başına 2.500 ms tarama).
- Kaydedilen ilki ile karşılaştırmak ve fare lazer satın alma sırasında hareket etmemiştir emin olmak için başka bir yerelleştirme sıra (aynı aynı derecede bir açıklandığı adım 5.3) edinin.
- 1H-Bayan lazer sırası kullanılarak bıyık etkinleştirme sırasında gerçekleştirin (4 x 32 lazer taramaları + 128 lazer inceden inceye gözden geçirmek; başına 2.500 ms inceden inceye gözden geçirmek) üstünde belgili tanımlık hava-puf sistem ile (paradigma = 20 s harekete geçirmek ve 10 s dinlenme).
- Bir kez daha, fareyi taşınmış olup olmadığını kontrol etmek için bir yerelleştirme sırası gerçekleştirmek.
Not: İnceden inceye gözden geçirmek ve dinlenme/harekete geçirmek dönem sayısı olabilir uyarlanmış ve modifiye, ama her zaman fareyi bir yerelleştirme sıra düzenli olarak gerçekleştirerek hareketli olmadığından emin olun.
- Yatakta ilk konumuna getirmek, yüzey bobin kaldırma ve fare geri tezgah için hareket. Atipamezole anestezi tersine çevirmek ve onu uyandırmak için sıçan arkada yapılan bir cilt kapağı içine enjekte.
8. proton Bayan işleme
- LCModel yazılımını açın ve doğru veri türünü ( Ücretsiz indüksiyon çürüme dosyası) seçin ve seçmek belgili tanımlık doğru eğe için ilgili sekmeyi tıklatın. Bu iş bittiğinde Tamam sekmesinde tıklatın.
- Miktar kontrol parametreleri adım adım optimize edin.
- Başlık bölümünde, el ile bir başlık girin ve el ile ilgili alanlardaki gerekli değer yazarak bir yeterli ppm aralığı (Örneğin, 0.2-4.0 ppm) tanımlayın.
- Temel dosya bölümünde seçin ve doğru makromolekül temel sığdırmak için gerekli dosya indirmek (Bu yazılım sağlayıcısı tarafından sağlanan).
- Tanımlamak ve giriş kontrol parametreleri yüklenemedi. Kayıt hazırlamak, tüm yararlı dosya türleri önceden işlem (tablo = kompakt masalar; PS = gerekli PostScript çıktısını; CSV biçimi için elektronik tablolar; = Koord araziler için koordinatları =). LCModel miktar başlatmak için RunLCModel sekmesini tıklatın.
- İstatistikler oluşturmak için seçili metabolitleri tanımlayın.
Not: LCModel metaboliti miktar sağlar ve hataları Cramér Rao alt sınır (mal) olarak adlandırdığı bir değeri tarafından tahmin ediyor. Bir değer bir mal ile < 15 en iyi bir miktar kabul edilir. Bir mal > 25 güvenilmez bir değeri gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı metaboliti dalgalanmaları miktar doğru bıyık stimülasyon doğrudan içinde mıknatıs tarafından elde edilen beyin etkinleştirme sırasında sağlar.
Bu çalışmada, kalın fMRI genel amacı bıyık stimülasyon verimli, etkin S1BF alan görselleştirmek ve doğru Voksel 1H-fMRS için bulmak için kontrol etmek oldu. Bıyık harekete geçirmek için inşa verimli cihazdır. Doğru bıyık ev yapımı hava-puf sistemini kullanarak uyardığında, gerçekten de, olumlu bir kalın sinyal somatosensor varil alanı için S1BF olarak da adlandırılır sol varil korteks (Şekil 4B), tespit edildi (n = 8). Sadece arka plan sağ hemisfer algılandı, ancak bir olumlu sinyal geliştirmesi sol varil kortekste 8 dışarı-in sekiz sıçanlarda algılandı. KALIN fMRI bıyık stimülasyon gerçekleştirildiğinde, hiçbir sinyal geliştirme ya sol ya da sağ S1BF gözlendi.
Anatomik Bay görüntüleri ve sıçan beyin atlas düzenleri8arasında karşılaştırma, kalın fMRI tarafından görüntülenmiştir aktif beyin alan bıyık stimülasyon sırasında aktif S1BF alanında yerleştirilmesini Voksel sağlar. Varil korteks 3 mm uzun olduğundan bu Voksel üç ardışık slayt (1 mm kalınlığında) üzerinde yer almaktadır. Beyin slayt hemen hemen dört dört eşit parçaya ayrıldığında, voxel quarter adlı sol üst yer alır bir yaklaşık 45° açı (Şekil 6).
Paradigma bıyık uyarılması için açıldığında, sol S1BF laktat içeriği bir artış gözlendi (Şekil 6, bir sıçan elde edilen tipik spectra). Arasında metabolik dalgalanmaları daha iyi görmek için dinlenme ve dönemleri, aktif bir spektral çıkarma gerçekleştirildi (Şekil 6). Subtracted Bu yelpazenin beyin aktivasyonu ile laktat içeriği artış çok daha kolay, görselleştirildiği, bu fare iken, N-Asetilaspartat (NAA) sinyal biraz azalmış. Nöronal stimülasyon sırasında laktat artışı da spektral deconvolution (Şekil 7AB) gözlenmiştir. Laktat tepe pek rahat vivo spektrum üzerinde tespit edildi LCModel bunun (Şekil 7A) doğruluk ve iyi mal değerleri ile ölçmek mümkün oldu. Gerçekten de, 23 fareler dışında tek bir spektrum laktat miktar için 24 eşit için verdiğim değer vardı. > 25 değildi. Diğer spectra için değerleri 3 ve 19 arasında değişiyordu.
Tüm 23 sıçanlarda laktat içeriğindeki varyasyonlar Şekil 8' de sunulmaktadır. 23 fareler dışında içinde sadece bir sıçan laktat içeriği bir düşüş gözlenmiştir. Orada laktat istatistiksel olarak anlamlı bir fark içerik dinlenme arasında ve harekete geçirmek dönem (0,132 0.012 ve 0.163 ± ± 0.011, sırasıyla, yakınları değerleri PCr + Cr içerik için teşleştirilmiş-testi, p 0.0005 [parametrik, iki kuyruklu] = n = 23). Bu nedenle, laktat içeriği % 31,6 ± % 7.8 artış nöronal stimülasyon sırasında ölçüldü.
Bir hayvan elde edilen tipik spectra temsil eden Şekil 6, NAA içerik hafif bir düşüş görülebilir. Ancak, bu NAA varyasyon önemli değildi (%1,2 ± %1.2 azalma ölçüldü, n = 23).
Şekil 1: ekipman ve anestezi için adımları. Anestezi başlamadan önce hazırlanacak(a)resmi ekipman. (B) Isoflurane pompa ve indüksiyon odası. (C) turnike yerleştirme. (D) resim kateter doğru takıldığını gösterir; ven doğru bir konumda olumlu bir işaret kateter iğne kan damlasını unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: bıyık stimülasyon. İyi misin bıyık Kağıt Kasedi ile bir yelken içinde sıkışıp kalırlar. Yelken Tamam bıyık hava-puf sistemi ile aynı anda uyarılmış sağlar ve bu nedenle, varil korteks nöronal aktivasyonu en üst düzeye çıkarır. Hava-puf sistemi (siyah tüp) çıkış 1,5 cm ve yelken dik çevresinde yer almalıdır. Onay yelken emin olmak için mıknatıs dışında doğru hava-puf sistem çevirerek hareket ediyor. Yelkeni 8 Hz de hastanın yönde (Rotasyon) taşımanız gerekir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hava-puf sistem bıyık uyarılması için. (A) A esnek boru (B) solenoid kontrol vanası basınçlı hava bağlanır. İkinci bir boru darbeli AIR yelken solenoid kontrol Vana çıktısı getiriyor. Solenoid kontrol vanası paradigma denetler nabız gibi atan aygıt takılı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kalın fMRI. (A)ses dizi bobin yerleştirme. Fare kafa yatay konumda ve kulak çubuklarıyla bloke. Yelken serbestçe hareket ediyor ve bobin veya MRI yatak tarafından bloke değildir emin olun. (B) tipik bir kalın sinyal aktif sol varil korteks (kırmızı ok). Sinyal yok kontralateral sağ hemisfer (mavi ok) tespit edilmiştir. Eşik % 76.5 en fazla yoğunluk değeri olarak ayarlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: yüzey bobin. Bu çalışmada kullanılan yüzey bobin(a)resmi. (B) yüzey bobin yerleştirme. Böylece sol varil korteks ve bu nedenle, yüzey bobin (baş yaklaşık 30 °, surfa için sol varil korteksin doğru konuma arasında iyi bir uzlaşma bir açıyla açık MRI yatak merkezinde bulunan fare kafa biraz açık olmalıdır CE bobin ve MRI yatağın engellenmelidir değil doğru bıyık, yelken ücretsiz hareketleri). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: tipik lokalize 1H-Bayan (mavi spectrum) istirahat ve bıyık etkinleştirme (kırmızı spektrum) sırasında. Voksel (yeşil kare) sol S1BF sıçan beyin atlas düzenleri ve sinyal geliştirme kalın fMRI görüntüleri kullanarak anatomik T2_TurboRARE görüntüleri üzerinde yer alır. Spektral çıkarma siyah çizilir. Laktat ve N-Asetilaspartat (NAA) doruklarına 1.32 ve 2.02 ppm sırasıyla belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: MRS spectra ürününün Tipik spektral deconvolution. 128-tarama dinlenme spektrumunun(a)Deconvolution. (B) Deconvolution 128-taramanın spektrum aktif. Kalıntı, çıkarma deneysel spektrum (ham veri) ve LCModel arasında uygun; MM makromolekül; = CR = kreatin + phosphocreatine; PCho + GPC = phosphocholine + glycerophosphocholine; NAA = N-Asetilaspartat; Lac laktat; = GABA γ-aminobütirik asit; = Gln glutamin; = Glu glutamat =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: laktat değişimler içerik sırasında beyin stimülasyonu. Mavi nokta: içerik LCModel ve kreatin + phosphocreatine içerik göre belirlenen istirahat, laktat. Kırmızı nokta: bıyık stimülasyon, LCModel ve kreatin + phosphocreatine içerik göre belirlenen sırasında içerik laktat. Harekete geçirmek ve dinlenme, p arasındaki fark 0.0005, = eşleştirilmiş t-testi (parametrik, iki uçlu), n = 23. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Somatosensor korteks veya varil alan, için S1BF olarak da bilinir varil korteks kortikal katman sitokrom c oksidaz boyama9kullanarak gözlenen IV içinde bir bölgedir ve büyük ölçüde açıklanan beri organizasyonu iyi bilinmektedir 10,11. Bir vibrissa bir varil civarında 19.000 nöronlar içinde sütun12düzenlenir, bağlıdır. Bıyık varil korteks yolu birçok avantajı vardır. İlk olarak, o içinde mıknatıs (S1BF alanının en büyük kısmında hangi yaklaşık MRS yapıldığı Voksel tüm bıyık boyutuna uygun olmasını sağlamak amacıyla kolayca ev yapımı olabilir bir MRI uyumlu hava-puf sistemi kullanılarak etkinleştirilebilir en çok vibrissa uyarılması sağlar bir yelken sıkılmış). İkinci olarak, sağ bıyık harekete geçirmek yol sol varil korteks harekete geçirmek ve bir yüksek-duyarlı yüzey bobini kullanımını sağlayan somatosensor korteks, bu beyin bölgesinde yer almaktadır. Üçüncü olarak, somatosensor korteks aktive Bu elektrik pençe stimülasyon, ikinci bazı sağ hemisfer13' te dahil olmak üzere diğer beyin yapıları uyarıcı dezavantajı sahip göre noninvaziv yöntemdir. Bu nedenle, burada kullanılan serebral etkinleştirme altında beyin metabolizmasının bir içinde vivo, invaziv olmayan ve boyuna gerçekleştirmek en uygun çalışma iletişim kuralıdır.
Anestezi birçoğu değişiklikleri nörovasküler kaplin, beyin metabolizma ve/veya beyin etkinliği14,15neden anestezi seçimi, çok önemlidir. Örneğin, isoflurane, en sık kullanılan anestezik MRI için kullanılan, bir üç-beyin laktat içerik15,16 sixfold artışa yol açar ve bu nedenle, beyin metabolik çalışmalarda kullanılmamalıdır. Medetomidine güvenilir sedasyon, analjezi, kas gevşemesi ve anxiolysis17indükler bir α2-adrenoreceptor agonist var. Bu etkileri atipamezole, α2 antagonisti kullanarak hızlı bir şekilde ters kaydedilebilir. Medetomidine beyin metaboliti içindekiler içinde kalın sinyal ve en düşük fiyat değişiklikleri üzerinde çok düşük bir etkisi vardır bu yana kemirgenler18 ' fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için iyi bir adaydır.
Bıyık harekete geçirmek paradigma doğru takip etmek önemlidir. NMR satın almalar son birkaç dakika, art arda gelen aktivasyon/dinlenme nokta kullanımı aktif beyin bölgede sinirlerde duyarsızlaştırma sınırlamak için gereklidir. Bu paradigma parametrelerinin (20 s etkinleştirme takip 10 bir dinlenme süresi tarafından s) karşılık gelen varil kortekste en yüksek kalın fMRI sinyal almak için seçilmiştir. TTL bağlantı noktası tarafından kontrol edilir olsa bile kalın tedavisinde aktif/dinlenme süresi belirlemek için çok önemli olduğundan bu zaman pencereleri saygı kadar bakım alınması gerekir. Varil korteks harekete geçirmek, yelken yüksek düzeyde elde etmek için bu grupları bıyık birlikte da önemli S1BF alanını uyarılmış olacak şekilde en büyük bölümünü sağlar beri. Böylece bir hastanın uçakta taşıyabilirsiniz bu yelken önünde çıkış hava tüpü yerleştirmek için çok bakım alınması gerekir. Frekans bıyık stimülasyon frekans 5 ve 15 Hz19arasında olduğunda varil korteks nöronların aktive gösterilmiştir beri dikkatle kalibre edilmesi gerekiyor. Bir daha düşük veya daha yüksek frekans kullanarak S1BF alan harekete geçirmek yol değil.
Bu çalışmada kullanılan iletişim kuralı, aynı beyin alanında istirahat ve beyin stimülasyonu sırasında edinilen spectra karşılaştırmak olanak verir ve bu nedenle, metabolik izlemek için bağlı beyin için harekete geçirmek değiştirir. Bir yerelleştirme sırası başında ve NMR spektroskopisi iletişim kuralı hayvan değil taşındı ve metabolik içeriği dinlenme ve harekete geçirmek durum arasında ölçülen farklılıkları nedeniyle beyin olduğunu emin olmak için sonunda gerçekleştirmek önemlidir stimülasyon ve hareket eserler için değil.
Burada açıklanan protokolünü kullanarak, bir artış laktat içerik dinlenme arasında ölçüldü ve dönemleri harekete geçirmek. Vivo NMR spektroskopi kullanarak beyin etkinleştirme sırasında laktat artışı ilk erken 1990'larda20,21insanlarda gözlendi. Ancak, kemirgenler, sinyal-gürültü oranı çok daha düşük olduğu yerine insanlar çoğu ölçümleri yapıldı. İçinde sıçan, laktat ex vivo NMR miktar sıçan beyin etkinleştirme sırasında Mazuel vd tarafından gerçekleştirildi içerik nöronal harekete geçirmek ile laktat beyin artış gözlenen 22. Burada sunulan sonuçlar o laktat bıyık etkinleştirme sırasında artış gösterir. Yerelleştirilmiş MRS hücresel çözünürlüğü izin vermez, ancak, hangi hücresel yuvası laktat (nöronlar veya astrocytes) geliyor dan hala bilinmemektedir. ANLSH (astrocyte-nöron laktat Servisi hipotez) hala tartışılan gibi daha da serebral metabolik değişimleri, anlayış, bu iletişim kuralı bu Servisi, anahtar bileşenler için genetik olarak değiştirilmiş hayvanlar gibi uygulanmak üzere gitmeli monocarboxylate nakliyat.
Burada anlatılan çalışmada, NAA içerik istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlendi. NAA içerik görsel stimülasyon sırasında bir düşüş daha önce insanlar23,24,25buldum ama Mangia ve Tkac26tarafından doğrulandı değil. Mevcut çalışmada, biz bir artış NAA fareler % 50'si beyin aktivasyonu ve diğer yarısı bir düşüş sırasında içerik gözlendi. Bu nedenle, NAA fonksiyonel Bayan Hayır diğer varyasyon metaboliti içerik tespit edildi sırasında miktar için iç başvuru olarak kaçınılmalıdır.
Her ikisi de laktat ve NAA varyasyonları nöronal etkinleştirme sırasında tartışmalar23,26,27,28,29için açmıştır. Beyin aktivitesi için bağlantılı bu metabolik dalgalanmalar bilgimizi ilerletmek için bu protokolü transjenik hayvanlar için uygulamak ilginç olabilir. Bu daha fazla temel işlemi hakkında bilgi sağlar. Genel olarak, yerelleştirilmiş 1H-Bayan sırasında bir görev veya fonksiyonel MRS29, kemirgenler, metabolitleri, normal veya patolojik beynindeki bölgesel dinamik değişiklikleri çalışma ile ilgili ortaya çıkan bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe başvuru ANR-10-LABX-57 ve bir Fransız ve İsviçreli ANR-FNS başvuru ANR-15-CE37-0012 LabEx iz grant tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Aurélien Trotier onun teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL syringe with needle | Becton, Dickinson and Company, USA | 2020-10 | 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm |
| 1H spectroscopy surface coil | Bruker, Ettlingen, Germany | T116344 | |
| 7T Bruker Biospec system | Bruker, Ettlingen, Germany | 70/20 USR | |
| Arduino Uno based pulsing device | custom made | ||
| Atipamezole | Vétoquinol, S.A., France | V8335602 | Antisedan, 4.28 mg |
| Breathing mask | custom made | ||
| Eye ointment | TVM laboratoire, France | 40365 | Ocry gel 10 g |
| Induction chamber | custom made | 30x17x15 cm | |
| Inlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 3m long |
| Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 | Surgivet, Harvard Apparatus | WWV90TT | from OH 43017, U.S.A |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Vertflurane, Virbac, France | QN01AB06 | 1000 mg/mL |
| KD Scientific syringe pump | KD sientific, Holliston, USA | Legato 110 | |
| LCModel software | LCModel Inc., Ontario, Canada | 6.2 | |
| Medetomidine hydrochloride | Vétoquinol, S.A., France | QN05CM91 | Domitor, 1 mg/mL |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI912 | |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI925 | |
| Monitoring system of physiologic parameter | SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA | Model 1025 | |
| NaCl | Fresenius Kabi, Germany | B05XA03 | 0.9 % 250 mL |
| Outlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 4m long |
| Paravision software | Bruker, Ettlingen, Germany | 6.0.1 | |
| Peripheral intravenous catheter | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SP500930S | 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min |
| Rat head coil | Bruker, Ettlingen, Germany | ||
| Sodic heparin, injectable solution | Choai, Sanofi, Paris, France | B01AB01 | 5000 IU/mL |
| Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting | Burkert, Germany | 3099939 | Model type 6013 |
| Terumo 2 ml syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SY243 | with 21 g x 5/8" needle |
| Terumo 5 mL syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | 05SE1 | |
| Wistar RJ-Han rats | Janvier Laboratories, France |
References
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
- Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
- Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
- Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
- Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20 (3), 393-395 (2017).
- Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. , (2009).
- Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
- Rat Brain Atlas. , Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
- Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
- Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
- Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
- Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
- Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
- Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
- Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
- Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
- Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
- Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
- Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
- Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
- Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
- Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
- Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
- Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
- Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
- Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
- Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
- Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).
