Summary
यह लेख एक पारंपरिक, दो आयाम (2d) electrospun nanofiber चटाई एक तीन आयाम (3d) पाड़ उपमहत्वपूर्ण CO2 द्रव के depressurization के माध्यम से विस्तार करने की तकनीक को दर्शाता है । इन संवर्धित पाड़ 3 डी, बारीकी से सेलुलर nanotopographic cues नकल कर रहे हैं, और जीवविज्ञान nanofibers के भीतर encapsulated अणुओं के कार्यों की रक्षा ।
Abstract
Electrospinning एक सिंथेटिक, कार्यात्मक extracellular मैट्रिक्स के लिए नकल करने के लिए कारण पाड़ और संरचना, संरचना, और फाइबर के व्यास का नियंत्रण आसानी उत्पादन में पसंदीदा प्रौद्योगिकी किया गया है । हालांकि, इन फायदों के बावजूद, पारंपरिक electrospun nanofiber पाड़ों अव्यवस्थित nanofiber उंमुखीकरण, कम porosity, छोटे ताकना आकार, और मुख्य रूप से दो आयामी मैट सहित सीमाओं के साथ आते हैं । जैसे, वहां electrospun nanofiber पाड़ों कि उपर्युक्त सीमाओं को दूर कर सकते है निर्माण के लिए एक नई प्रक्रिया के विकास के लिए एक बड़ी जरूरत है । साथ ही, एक उपन्यास और सरल विधि हँ । एक पारंपरिक 2d nanofiber चटाई वांछित मोटाई, गैप दूरी, porosity, और nanotopographic cues के साथ एक 3 डी पाड़ में तब्दील हो कोशिका बोने और उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव के depressurization के माध्यम से प्रसार के लिए अनुमति देते हैं । ऊतक पुनर्जनन के लिए एक पाड़ प्रदान करने के लिए होने के अलावा, इस विधि भी इस तरह के स्थानीय दवा वितरण के लिए रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के रूप में सक्रिय अणुओं encapsulate करने का अवसर प्रदान करता है । सीओ2 विस्तारित nanofiber पाड़ ऊतक पुनर्जनन, घाव भरने, 3 डी ऊतक मॉडलिंग, और सामयिक दवा वितरण में महान क्षमता पकड़ ।
Introduction
एक कृत्रिम पाड़ है कि रोगियों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन में सहायता के विकास की अवधारणा है कि दशकों के लिए एक अपक्षयी दवा क्षेत्र रिस चुका है । आदर्श सिंथेटिक पाड़ के लिए स्वस्थ ऊतक आसपास से सेल प्रवास के लिए प्रेरित करता है, कोशिका बोने के लिए एक वास्तुकला प्रदान करता है, आसंजन, संकेत, प्रसार, और भेदभाव, vascularization का समर्थन करता है, पर्याप्त ऑक्सीजन के लिए अनुमति देता है और पोषण वितरण, और मेजबान प्रतिरक्षा गतिविधि को बढ़ावा1आरोपण के बाद सफलता सुनिश्चित करने के लिए । इसके अतिरिक्त, यह रोगाणुरोधी अणुओं embedding घाव भरने में सहायता करने के लिए एक वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता1,3,6,7,8,9. सिंथेटिक पाड़ से इन जीवविज्ञान अणुओं के लौकिक रिहाई को नियंत्रित करने की क्षमता एक और वांछनीय विशेषता है कि माना जाता है जब इंजीनियरिंग पाड़1है ।
Electrospinning nanofiber पाड़1,2,3,4,5,6के उत्पादन के लिए एक अच्छी तरह से उपयोग तकनीक किया गया है । पिछले जैसे एक nanofiber पाड़ बनाने के प्रयास यहां चर्चा की सफलता की डिग्री बदलती के लिए किया गया है के रूप में एक । हालांकि, पारंपरिक nanofiber पाड़ों सीमित क्षमता है इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए । पारंपरिक nanofiber पाड़ों गया है ज्यादातर दो आयामी मैट1,3। इन विविस्तारित पाड़ घनी छोटे ताकना आकार के साथ पैक कर रहे हैं; यह सीमा सेल घुसपैठ, प्रवास, और भेदभाव के रूप में यह एक ऐसे वातावरण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं है vivo1,7,8,9में पाया । इस कारण से, 3 डी electrospun nanofiber पाड़ तैयारी की नई तकनीक अंतर्निहित खामियों कि 2d nanofiber मैट के साथ आने में संशोधन करने के लिए स्थापित किया गया है । ये तकनीक 3 डी पाड़ में परिणाम; हालांकि, वे जलीय समाधान और फ्रीज-सुखाने प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है उत्पादन तरीकों के कारण लागू सीमित है । प्रतिबंधित संगठन के बिना nanofibers के यादृच्छिक वितरण में यह संसाधन परिणाम, उचित मोटाई, और/या वांछित porosity पर्याप्त nanotopographic cues कि सेल प्रवास और प्रसार के लिए आवश्यक है प्रदान करने के लिए । इन कारकों पिछले 3 डी electrospun nanofiber पाड़ में परिणाम है कि रहने वाले ऊतकों की पर्याप्त नकल की कमी1,7,8,9।
extracellular मैट्रिक्स (ECM) के बेहतर नकल के साथ एक विस्तारित, 3 डी पाड़ विकसित करने के बारे में हाल ही में प्रयास किया गया है एक जलीय सोडियम borohydride (नभ4) समाधान उपचार और के बेहतर नियंत्रण में सहायता करने के लिए डिज़ाइन किए गए मोल्ड का उपयोग कर परिणामस्वरूप पाड़7,8की आकृति । हालांकि, इस विधि के रूप में यह जलीय समाधान, रासायनिक प्रतिक्रियाओं के उपयोग की आवश्यकता है आदर्श नहीं है, और फ्रीज-सुखाने कि पॉलिमर और किसी भी encapsulated जैव अणुओं है कि पानी में घुलनशील है के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । इस्तेमाल किया additives भी ऊतक पुनर्जनन8,9के दौरान साइड इफेक्ट का कारण हो सकता है । सीओ2 विस्तार इस लेख में उल्लिखित विधि बहुत प्रसंस्करण समय कम कर देता है, जलीय समाधान के लिए की आवश्यकता समाप्त, और मात्रा और जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की कार्यक्षमता को बरकरार रखता है पहले की तुलना में एक बड़ी हद तक स्थापित विधियां9.
पिछले अध्ययनों में, एंटीबायोटिक दवाओं, चांदी, 1α, 25 dihydroxyvitamin डी3, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड LL-३७ nanofiber पाड़ों में व्यक्तिगत रूप से लोड किए गए थे और संयोजन में इन पाड़ों की क्षमता की जांच करने के लिए एजेंटों को रिहा करने के लिए घाव भरने में अतिरिक्त सहायता9,10,12,13। nanofiber पाड़ विस्तार, Coumarine 6, एक फ्लोरोसेंट डाई की इस विधि का प्रदर्शन करने के प्रयोजन के लिए, पाड़ में विभिन्न वांछित यौगिकों के साथ पाड़ embedding की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लोड किया जाएगा । encapsulated सक्रिय अणुओं के साथ संयोजन के रूप में विस्तारित nanofiber पाड़ निर्माण का यह तरीका ऊतक पुनर्जनन, घाव भरने, 3 डी ऊतक मॉडल के निर्माण में महान क्षमता रखती है, और दवाओं के सामयिक वितरण ।
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Protocol
vivo नीचे उल्लिखित प्रक्रियाओं में सभी नेब्रास्का चिकित्सा केंद्र के विश्वविद्यालय में IACUC समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. मानक Electrospinning के लिए समाधान तैयार करें
- में एक 20 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब, पाली के 2 जी भंग (ε-caprolactone) (PCL, मेगावाट = ८० केडीए) के एक विलायक मिश्रण में dichloromethane (डीसीएम) और एन, एन dimethylformamide (DMF) के साथ एक 4:1 राशन (वी/वी) की एकाग्रता पर 10% (w/
चेतावनी: धुएं के जोखिम से बचने के लिए एक अच्छी तरह हवादार डाकू में डीसीएम और DMF संभाल । प्लास्टिक सामग्री को लेकर डीसीएम का पर्दाफाश न करें । - एक लैब रोटेटर में ग्लास ट्यूब प्लेस जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है । समाधान रातोंरात मिश्रण हो सकता है ।
- यदि सुपाड़ा में पेप्टाइड्स या दवाओं के रूप में सक्रिय सामग्री एंबेड करने के लिए इच्छुक है, एक अलग समाधान बनाने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए तैयार का उपयोग करें ।
- फ्लोरोसेंट डाई समाधान (५० मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग कर तैयार PCL समाधान के 20 मिलीलीटर ।
2. Electrospinning उपकरण सेट अप (आंकड़ा 1a)
- एक 21 गेज कुंद सुई संलग्न के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज के लिए PCL समाधान जोड़ें । सुनिश्चित करें कि वहां सिरिंज और एसोसिएटेड टयूबिंग में कोई हवा है ।
- सुई टिप से जमीन कलेक्टर 12 सेमी के साथ एक घूर्णन इस्पात ड्रम प्लेस ।
- मगरमच्छ क्लिप का प्रयोग, सीधे मौजूदा (डीसी) सुई के लिए उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति कनेक्ट और सुनिश्चित करें कि कलेक्टर जमीन है ।
चेतावनी: हमेशा किसी भी कनेक्टेड सामग्री को संभालने से पहले बिजली की आपूर्ति बंद कर दें ।
3. Electrospinning
- PCL समाधान के 20 मिलीलीटर के लिए, इस प्रकार के रूप में सिरिंज पंप के मापदंडों सेट: व्यास = २०.२७ मिमी, प्रवाह दर = ०.५ मिलीलीटर/चेक अगर बूंदों सुई की नोक पर गठन कर रहे हैं ।
- यदि सक्रिय अणुओं का शामिल करना वांछित है, उपकरण की स्थापना के लिए सह के लिए अनुमति देने के सलए electrospinning (आंकड़ा 1b)। hypodermic सुई का उपयोग कर एक स्वनिर्धारित समाक्षीय नोजल बनाएँ ।
नोट: इस तरह के नोजल भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । ध्यान दें कि डाई का एक समाधान इस तरह के अणुओं को जोड़ने अनुकरण करने के लिए तैयार है ।- पानी में फ्लोरोसेंट डाई अनंतमूलि 6 का 1% समाधान तैयार करें । एक छोटे सिरिंज के लिए 1% डाई के 3 मिलीलीटर जोड़ें । PCL समाधान के रूप में एक ही समाक्षीय नोजल को सिरिंज कनेक्ट । एक बार फिर, यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले हैं ।
- इस 3 मिलीलीटर समाधान के लिए, इस प्रकार के रूप में सिरिंज पंप के मापदंडों सेट: व्यास = ९.४९ मिमी, प्रवाह दर = ०.०२ मिलीलीटर/यदि बूंदों सुई की नोक पर बनाने की जांच करें ।
- spinneret (22 गेज सुई) और spinneret से 20 सेमी दूर स्थित एक जमीन कलेक्टर के बीच 20 केवी की एक बिजली की क्षमता लागू करें । एक ड्रम में २,००० rpm पर घूर्णन में गठबंधन nanofiber मैट ले लीजिए । एक बार वे ~ 1 मिमी की मोटाई तक पहुंचने के PCL nanofiber मैट लीजिए ।
4. सरणी छेद के साथ PCL Nanofiber मैट की पीढ़ी ।
- किर PCL nanofiber मैट ।
- एक विलायक के एक अनुपात के साथ डीसीएम और DMF से मिलकर मिश्रण में PCL मोती भंग 4:1 (v/v) 10% की एकाग्रता (PCL) (डब्ल्यू/ एक सिरिंज पंप का उपयोग कर ०.७ एमएल/एच की एक प्रवाह दर पर PCL समाधान पंप जबकि 20 केवी की एक क्षमता spinneret (एक 22-पण सुई) और spinneret के अलावा 12 सेमी स्थित एक जमीन कलेक्टर के बीच लागू किया जाता है ।
- एक घूर्णन ५०० rpm से बड़ा गति के साथ एक घूर्णन ड्रम का उपयोग कर nanofiber झिल्ली ले लीजिए ।
- 5 मिनट (यानी, कड़ा हो) के लिए तरल एन2 में PCL nanofiber मैट विसर्जित कर दिया । एक ०.५ mm-व्यास पंच के साथ तरल एन2 और पंच pcl nanofiber मैट में pcl nanofiber मैट रखें ।
5. के साथ 2 डी Nanofiber मैट का विस्तार/बिना सरणी छेद के द्वारा उपमहत्वपूर्ण CO2 तरल (चित्रा 2) ।
- 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में PCL nanofiber मैट प्लेस और 1 सेमी x 1 सेमी तेज शल्य कैंची का उपयोग कर चौकों में कटौती करते हुए तरल नाइट्रोजन में डूबे किनारों के विरूपण से बचने के लिए ।
- सूखी बर्फ के ~ 1 जी के साथ एक 30 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कटौती चटाई रखें । कसकर ढक्कन टोपी और सूखी बर्फ के लिए अनुमति देने के लिए तरल CO2में बदल जाते हैं ।
- एक बार तरल ट्यूब में गठन किया है, जल्दी से टोपी खोलने के दबाव जारी ।
चेतावनी: तरल नाइट्रोजन और सूखी बर्फ के साथ काम करते समय उचित थर्मल सुरक्षात्मक गियर का प्रयोग करें । चेहरे के प्रति दबाव ट्यूब न खोलें । इस केंद्रापसारक ट्यूब बार इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । - निकालें और ट्यूब से फूला हुआ पाड़ का निरीक्षण । सूखी बर्फ और दोहराने के साथ एक नया केंद्रापसारक ट्यूब में पाड़ प्लेस जब तक वांछित मोटाई हासिल की है । ईथीलीन ऑक्साइड में विस्तारित nanofiber पाड़ कोशिकाओं के साथ गर्मी से पहले निष्फल ।
6. विस्तारित Nanofiber पाड़ों का लक्षण वर्णन
- स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर विस्तारित nanofiber पाड़ों की आकृति विज्ञान और संरचना की विशेषता ।
- ४० एस के लिए प्लैटिनम के साथ धातुई स्टड और कोट करने के लिए डबल पक्षीय प्रवाहकीय टेप के साथ नमूनों प्लेस ४० mA में एक धूम कोट का उपयोग कर ।
- पिछले अध्ययन9के अनुसार SEM का उपयोग कर फाइबर की जांच करें । 15 केवी के एक त्वरित वोल्टेज पर छवियों को इकट्ठा ।
- इन विट्रो जारी प्रोफाइल और जारी पेप्टाइड्स की एक गतिविधि में विशेषताएं ।
- वजन 10 nanofiber झिल्ली की मिलीग्राम से पहले और सह2में विस्तार के बाद ।
- पंजाबियों बफर में नमूने विसर्जित और अलग समय अंक (0-28 दिन) पर supernatant के 10 μL इकट्ठा ।
- एंजाइम से जुड़े इंयूनो Sorbent परख (एलिसा) किट का प्रयोग करें LL-३७ पेप्टाइड एकाग्रता मात्रा में एकत्र supernatant में ।
- vivo और होस्ट रिस्पांस में सेलुलर घुसपैठ की जांच करें ।
- एक संज्ञाहरण चैंबर में 9 सप्ताह पुराने Sprague-Dawley (एसडी) चूहों रखो, isoflurane भाप से कनेक्ट और चूहों anesthetize । चूहों एक ऑपरेटिंग टेबल के लिए स्थानांतरण के बाद चूहे भावनाओं के बिना पूरा संज्ञाहरण हो गया है । सर्जरी के दौरान vaporizer के साथ एक isoflurane-नाक शंकु का उपयोग करते हुए चूहों को लगातार anesthetize । एक जानवर की शेविंग द्वारा चूहे की पीठ के बाल दाढ़ी और आयोडीन और शराब त्वचा सफ़ाई के साथ यह निष्फल । एक स्केलपेल का उपयोग dorsum पर supraspinal साइटों पर १.५ सेमी चीरा के माध्यम से चमड़े के नीचे जेब बनाएं ।
- प्रत्येक चीरा के लिए चिमटी का उपयोग कर चमड़े के नीचे जेब में एक विस्तारित nanofiber पाड़ (१.५ mm-मोटी) डालें । एक स्टेपलर का उपयोग कर चीरा बंद करें ।
- 1, 2, और 4 सप्ताह में, ९५% CO2के साथ चूहों euthanize । धीरे explant और आसपास के ऊतक सर्जिकल कैंची का उपयोग कर काटना । ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण करने से पहले, formalin में ऊतक विसर्जित करने के लिए कम से 3 दिनों के लिए, और फिर तेल के साथ एंबेड । एक microtome के साथ ऊतक अनुभाग, तो प्रदर्शन hematoxylin और eosin (एच & ई), Masson के trichrome धुंधला ।
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Representative Results
उपमहत्वपूर्ण CO2 द्रव के depressurization के माध्यम से 3 डी पाड़ों में पारंपरिक 2d electrospun nanofiber मैट के विस्तार की प्रभावकारिता अलग क्षमताओं में प्रदर्शन किया गया था: पाड़ों की मोटाई 1 मिमी जब अनुपचारित २.५ mm से वृद्धि हुई है और एक और दो सह2 उपचार के साथ १९.२ mm, क्रमशः (3ए आंकड़ा-सी) । porosity-कोशिका बोने के लिए महत्वपूर्ण वास्तुकला की एक विशेषता-भी वृद्धि की मोटाई (आंकड़ा 3सी) के अनुरूप एक तरह से वृद्धि हुई । पाड़ों की porosity अनुपचारित मैट के लिए ७९.५% से ९२.१ और ९९.०% के लिए पहले और दूसरे उपचार के बाद, क्रमशः (चित्रा 3 डी) वृद्धि हुई । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि एक पाड़ में सेल पैठ की डिग्री और इस प्रकार अपनी प्रभावकारिता पुनर्जनन प्रेरित करने के लिए काफी हद तक porosity1पर निर्भर है ।
SEM छवियां से पता चला कि घनी पैक, अनुपचारित 2 डी मैट के fibrillar संरचना का आदेश दिया,2 सह के साथ विस्तार के बाद गठबंधन nanofibers के साथ स्तरित संरचनाओं में तब्दील हो गए (चित्रा 3E-एच) । पिछले अध्ययनों से निष्कर्ष निकाला है कि इसी तरह के संगठित तंतुओं के साथ स्तरित संरचनाओं ऐसे पट्टा, मांसपेशी के रूप में ऊतकों के उत्थान के लिए nanotopographic cues के संरक्षण में महत्वपूर्ण हो सकता है, और7तंत्रिका,8। हालांकि, इन अध्ययनों से जांच पाड़47,8नभ के साथ विस्तार किया । इस विधि अतिरिक्त प्रसंस्करण समय और सॉल्वैंट्स कि पाड़7,8से सक्रिय अणु नमकीन पानी हो सकता है की आवश्यकता है । 4नभ, एक मजबूत एजेंट को कम करने, encapsulated सक्रिय अणुओं के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है । इसके विपरीत, विस्तार के लिए उपमहत्वपूर्ण सीओ 2 तरल पदार्थ का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त अणुओं पूर्व की है, जब पाड़ के साथ तुलना में बोने की क्रिया को बचाने के लिए दिखाया गया था नभ4 विधि (चित्रा 4) का उपयोग विस्तारित । यह अनंतमूलि 6 डाई का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया; डाई के हरे रंग बेहतर सीओ2 (चित्रा 4) के साथ विस्तार पाड़ों में बनाए रखा गया था, यह दर्शाता है कि उपमहत्वपूर्ण अणुओं की अखंडता के बेहतर प्रतिधारण में विस्तार परिणामों के लिए2 द्रव का उपयोग encapsulated PCL पाड़ों में ।
रोगाणुरोधी पेप्टाइड LL के रिलीज कैनेटीक्स-३७ पाड़ों से पहले और विस्तार के बाद vitrovia में एक एलिसा किट निर्माता के निर्देश के अनुसार मापा गया (आंकड़ा 5 ए) । LL-३७ पेप्टाइड की रोगाणुरोधी प्रभावकारिता-nanofiber पाड़ों से पहले और2 CO के साथ विस्तार के बाद लोड Pseudomonas aeruginosa (पी aeruginosa) के साथ गर्मी के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था । कालोनियों के रहने वाले की संख्या पाड़ों के साथ मशीन पोस्ट quantified था । परिणाम से पता चला कि रोगाणुरोधी गतिविधि के सह2-विस्तारित, LL-३७-भरी पाड़ों के समान था कि विस्तार ll-३७-भरी मचान, यह दर्शाता है कि विस्तार की प्रक्रिया encapsulated ll की गैर गतिविधि की रक्षा कर सकते हैं-३७ पेप्टाइड्स (चित्रा 5B) ।
इसके अलावा vivo में अध्ययन किया गया सह2के चमड़े के नीचे आरोपण-वर्ग के साथ nanofiber पाड़ों का विस्तार चूहों को छेद सरणी । यह सेलुलर प्रवास और प्रसार के लिए अनुमति देता है छेद के भीतर और साथ ही आगे घुसपैठ nanofiber परतों है कि विस्तार के दौरान बनाए गए (चित्रा 6) के भीतर । विस्तारित पाड़ रक्त वाहिकाओं की संख्या में एक उल्लेखनीय वृद्धि (चित्रा 6C, ई) और multinucleated विशाल कोशिकाओं (चित्रा 6D, एफ) सप्ताह से 1 से 4 पोस्ट आरोपण का गठन दिखाया । इसके अलावा immunohistological धुंधला परिणाम सी की संख्या की कमी का संकेत-सी chemokine रिसेप्टर प्रकार 7 (CCR7)-सकारात्मक घुसपैठ मैक्रोफेज और विभेद के क्लस्टर की संख्या की वृद्धि 206 (CD206)-सकारात्मक घुसपैठ मैक्रोफेज 1 सप्ताह से 4 सप्ताह के लिए प्रत्यारोपण के बाद ।
चित्रा 1: ठेठ electrospinning सेटअप । एक ठेठ समाक्षीय electrospinning तंत्र दिखाया गया है । Electrospinning तीन प्रमुख घटकों की आवश्यकता है: एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति, एक spinneret, और एक विद्युत प्रवाहकीय कलेक्टर. समाक्षीय कताई एक nanofiber पाड़ स्पिन करने के लिए दो तरल पदार्थ का उपयोग करता है; यह अंय अणुओं के encapsulation के लिए अनुमति देता है । Nanofiber संरेखण और विधानसभाओं घूर्णन ड्रम के रोटेशन की गति अलग से कलेक्टर के माध्यम से संवर्धित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, एक स्वनिर्धारित नोजल दो hypodermic सुई का उपयोग कर बनाया गया था । इसी तरह की नोक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । यह आंकड़ा Xie, एट अल14से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: पाड़ विस्तार के कदम उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव का उपयोग कर । (क) एक कंटेनर है कि सील और दबाव का सामना कर सकते हैं, जैसे एक 30 मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूब का उपयोग करें । (ख) 2 डी PCL nanofiber चटाई का 1 सेमी x 1 सेमी टुकड़ा जोड़ें । (ग) सूखी बर्फ के ~ 1 जी जोड़ें । (घ) कंटेनर को सील करना. (ङ) ट्यूब में निर्माण करने के लिए दबाव की अनुमति दें । यह तरल सह2में ठोस सह2 बंद हो जाएगा । जब तरल इकट्ठा किया है, जल्दी से ट्यूब की सील जारी । इस तरल सह2 कारण जल्दी गैसीय सह 2 बन जाएगा,सह2 permeating 2d nanofiber चटाई में जिसके परिणामस्वरूप । (च) 3d पाड़ का निरीक्षण । जब तक वांछित मोटाई हासिल की है इन चरणों दोहराया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3:2 उपमहत्वपूर्ण द्रव सह के साथ पहले और विस्तार के बाद 2d मैट के दृश्य । (एक) तस्वीर उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव (सही) और पहले उपचार के बाद (बाएं) के उपचार से पहले PCL nanofiber मैट से पता चलता है । (ख) फोटोग्राफ सह2 उपगंभीर द्रव के साथ पहले उपचार से पहले PCL nanofiber चटाई से पता चलता है (सही) और दूसरा उपचार के बाद (बाएं) । (ग) ग्राफ से पहले और एक के बाद PCL फाइबर मैट की मोटाई से पता चलता है और उपमहत्वपूर्ण सह2 तरल पदार्थ के साथ दो उपचार । (घ) ग्राफ से पहले और एक के बाद और उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव के साथ दो उपचार PCL फाइबर मैट के सापेक्ष porosity से पता चलता है । (ई एच) छवि पार से पता चलता है-pcl मैट के अनुभागीय उपस्थिति sem के माध्यम से कब्जा कर लिया (ई एफ) के उपचार से पहले pcl फाइबर मैट की छवि sem । (जी-एच) उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव के साथ दो उपचार के बाद PCL फाइबर मैट की SEM छवि । यह आंकड़ा जियांग, एट अल9से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: अनंतमूलि 6 डाई भरी हुई PCL nanofiber मैट से पहले और उपमहत्वपूर्ण CO2 द्रव और नभ4 जलीय समाधान के साथ विस्तार के बाद । (क) छवियों को सकल Coumarine 6 सह2 (दाएं) और नभ4 (बाएं) के साथ विस्तार के बाद PCL पाड़ों में शेष डाई की राशि दिखा । (ख) छवियों pcl पाड़ और उनके इसी प्रतिदीप्ति के निंनलिखित क्रम में सकल शीर्ष विचारों को दिखाने के लिए: कच्चे पाड़ (नीचे सही), 2 डी Coumarine 6 डाई (ऊपर सही) के साथ भरी हुई चटाई, PCL पाड़ Coumarine 6 सह के साथ विस्तारित डाई के साथ भरी हुई2 ( ऊपर बाएं), नभ4 (नीचे बाएं) । (ग) ग्राफ अनंतमूलि 6 डाई के प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है के बाद PCL मैट अनुपचारित थे, उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव के माध्यम से विस्तार, और नभ4 उपचार के माध्यम से विस्तार किया । प्रतिदीप्ति को इमेज J software द्वारा quantified गया था । यह आंकड़ा जियांग, एट अल9से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: सक्रिय PCL पाड़ों में encapsulated अणुओं। (क) ग्राफ में रोगाणुरोधी पेप्टाइड LL के सापेक्ष रिहाई-३७ 2d झिल्ली और उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव विस्तारित 3 डी पाड़ (ख) रेखांकन अलग PCL nanofiber मैट के रोगाणुरोधी प्रभावकारिता को चित्रित जब पी के संपर्क में दिखाया . aeruginosa। यह आंकड़ा जियांग, एट अल9से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: के साथ और dorsum चूहों के चमड़े के नीचे साइटों में उपमहत्वपूर्ण CO2 के द्वारा विस्तार के बिना PCL nanofiber पाड़ के vivo प्रतिक्रियाओं में । (क) एच & ई दाग. ग्रीन डॉट्स सेल घुसपैठ की सीमाओं को नामित । (ख) Masson के trichrome दाग । हरे तीर कोलेजन जमाव निर्दिष्ट । (ग) एच & ई दाग की अत्यधिक बढ़ाया छवि । हरे तीर रक्त वाहिकाओं निर्दिष्ट । (घ) एच & ई दाग के अत्यधिक बढ़ाया छवियां । हरे तीर विशाल कोशिकाओं को निर्दिष्ट । (ङ) ग्राफ2मिमी प्रति रक्त वाहिकाओं के विकास को दर्शाया गया है । (च) ग्राफ quantifies है कि पारंपरिक 2d pcl मैट में घुसपैठ की विशाल कोशिकाओं की संख्या pcl मैट के साथ उपमहत्वपूर्ण CO2के साथ विस्तारित की तुलना में । यह आंकड़ा जियांग, एट अल9से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
सह2 depressurization के माध्यम से विस्तारित 3 डी पाड़ में पारंपरिक 2d electrospun nanofiber मैट बदलने की जांच की गई । पारंपरिक 2d nanofiber मैट सफलतापूर्वक उपमहत्वपूर्ण सह2 द्रव के माध्यम से विस्तार कर रहे हैं । महत्वपूर्ण कदम के लिए एक अनुकूलित शर्त के तहत 2d nanofiber मैट बनाना है और किनारों को विकृत (जैसे, तेज शल्य कैंची का उपयोग कर के बिना मैट काट) । इस सह2-विस्तारित nanofiber पाड़ों स्तरित संरचनाओं (आंकड़ा3बी), कम पैकिंग घनत्व (चित्रा3d), और उच्च porosity (चित्रा3डी) सहित पारंपरिक 2 डी मैट पर कई लाभ है । इस विस्तार विधि भी है कि यह प्रक्रिया को जल्दी है और encapsulated सक्रिय जीवविज्ञान जलीय समाधान के इस तकनीक अपवर्जन के कारण अणुओं के समग्र नुकसान कम कर देता है में विस्तार के मौजूदा तरीकों के सापेक्ष लाभप्रद है और फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया8,9. हालांकि, इस तकनीक की सीमा है कि बहुलक nanofibers की आकृति विज्ञान उपमहत्वपूर्ण सह में भंग नहीं किया जाना चाहिए2 तरल पदार्थ । उदाहरण के लिए, PLGA (50:50) nanofiber मैट इस तकनीक का उपयोग कर विस्तारित नहीं किया जा सकता है । इस तरह के nanofiber मैट अंय गैस तरल पदार्थ का उपयोग कर विस्तारित किया जा सकता है ।
हमारे पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि कोशिकाओं को विस्तारित nanofiber पाड़ के भीतर एक और अधिक समान तरीके से वरीयता प्राप्त जब 2d8मैट के साथ तुलना में । इस काम में, रक्त वाहिका गठन की एक काफी वृद्धि की दर हुई (चित्रा 6C, ई), और मेजबान प्रतिरक्षा सेल में घुसपैठ के बाद सह2-विस्तारित nanofiber पाड़ के भीतर देखा गया था वर्ग-सरणी के बाद छेद चूहों में चमड़े के नीचे आरोपण (चित्रा 6D, एफ). Angiogenesis और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ संकेत मिलता है कि पाड़ मेजबान ऊतक और संभवतः क्षतिग्रस्त ऊतकों के उत्थान के लिए आवश्यक होमिंग कोशिकाओं के साथ आकर्षक है; यह सफलता के बाद एक उच्च दर-9मेजबान में आरोपण का तात्पर्य है ।
सीओ2विस्तार पाड़ भी पेप्टाइड्स और अंय अणुओं है कि वांछित प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सहायता कर सकते है की एक किस्म के साथ शामिल होने की क्षमता है । यहां, वांछित प्रभाव ऊतक पुनर्जनन के लिए एक पाड़ के साथ ही शामिल LL-३७ पेप्टाइड के माध्यम से रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदान किया जा रहा है. पाड़ों उपमहत्वपूर्ण CO2 द्रव के साथ विस्तारित भी शामिल अणुओं की बेहतर प्रतिधारण दिखाया जब पाड़ के साथ तुलना में4नभ के साथ विस्तार किया । डाई PCL पाड़ों के भीतर समझाया अणुओं बेहतर बनाए रखा (4 चित्रा) थे । इसके अतिरिक्त, रोगाणुरोधी पेप्टाइड LL-३७ encapsulated के एक थोड़ा अधिक से अधिक अनुपात 3 डी सह2 विस्तारित मचान से जारी किया गया था जब 2d मैट (चित्रा 5) की तुलना में । LL-३७ की सी गतिविधि सीओ2 के रूप में बनाए रखा था विस्तार पाड़ों एक समान रोगाणुरोधी प्रभावकारिता दिखाया जब 2d पाड़ों (चित्रा 5B) की तुलना में ।
3 डी विस्तार का प्रतीक है कि सिंथेटिक पाड़ उत्पादन का यह नई विधि अब 2d nanofiber मैट के उपयोग तक ही सीमित है । प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि इस विस्तार विधि बेहतर मात्रा और विस्तारित nanofiber पाड़ के भीतर encapsulated के लिए सक्रिय सामग्री की प्रतिक्रियाशीलता बनाए रखने के । इसके साथ ही, विस्तारित nanofiber पाड़ों vivo9में पाया उन के nanotopographic वातावरण की नकल, एक विशेषता है कि बहुत ऊतक पुनर्जनन1उत्प्रेरण में सहायता । भविष्य में, इन सह2-विस्तारित पाड़ों घाव भरने और ऊतक पुनर्जनन की सहायता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 डी ऊतक मॉडल के निर्माण और स्थानीय रूप से नियंत्रित दवा वितरण में संभावित अनुप्रयोगों हो सकता है ।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम NIH (2P20 GM103480-06 और 1R01GM123081 को J.X.), ओटिस मिट्टी मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, NE LB606, और स्टार्टअप फंड के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंस (NIGMS) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया नेब्रास्का चिकित्सा विश्वविद्यालय से केंद्र.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-199-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Rotating Steel Drum | customized | This serves as a collector during electrospinning. | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Coaxial spinning requires two single syringe pumps. |
| Revolver | Lab Net International | H5600 | Adjustable lab rotator for mixing solutions |
| Hypodermic Needle (27G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26426 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| Hypodermic Needle (21G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26416 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| LL 37 ELISA Kit | Hycult Biotech | HK321-02 |
References
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