Summary
我々 は開発し、ティッシュ エンジニア リングのアプリケーションに使用されるゼラチン ベースの生体材料の構築のため、湿式紡糸概念に基づくプロトコルを記述します。
Abstract
この記事は、モノフィラメント繊維または他の適切な形態に天然高分子としてゼラチンを製造するための安価な方法を示します。湿式紡糸法をゼラチン繊維は適切な凝固中のスムーズな押し出しによって生成されます。、これらのゼラチン繊維の組織の特徴を模倣する能力を機能面を向上させるため、ゼラチンは、この概念を参照して管形状に成形できます。ゼラチン チューブ, in vitro および in vivo 検査を受け、組織工学の適用のための大きな可能性を示しています。ゼラチンに (例えば、緊張または心血管系システム)、被災地域の組織を置き換えると同様幹細胞と神経回路の直接の代替を提供することによって再生を促進するためにチューブを使用ことができます適切な詰め物ギャップ材料として機能します。このプロトコルに基づいて天然高分子生体材料を作成する詳細な手順について説明し、その実装は、大きな組織再生の戦略を実現する相関の天然高分子開発メリットを得る予定です。
Introduction
組織再生における最新の開発には、医療における新たな治療戦略の改善のための挑戦を表す組織工学」のアプリケーションが含まれます。たとえば、神経系の再生、次の傷害または病気の限られた可能性は世界的に重大な健康問題を生じます。神経系に関連する病態生理学的プロセスの複雑さのためまたは伝統的な自家の使用安定化手術の実装機能の成果に利点を提供する示されているのための強力な証拠がないです。脊柱固定手術1,2の効果。被災地で組織が失われた、hypertrophically によるアストロ サイト3、最終的に密集したグリア瘢痕4,5を形成に置き換え。この行列は、ブロック神経の回復は6、7の機能し、は、このように、大きく再生の妨げのバリアとして機能します。組織の損失を防ぐために、破損した領域の整合性を維持することによってだけでなく、神経細胞の直接の代替を提供することにより瘢痕関連結合組織の形成を減らす適切な充填のギャップを期待すると軸索の再生を促進するための回路。
高分子生体材料として自然な細胞外マトリックス (ECM) のサポートを通じて、細胞または軸索行動と組織進行の規程に基づき、組織再生療法の足場として推奨されています。繊維の形式は、その一次元構造8により、様々 な材料のためのビルディング ブロックとして一般的と見なされます。繊維は、溶融押出成形や湿式紡糸法によって一般に得ることがただし、大きいサイズとコスト、装置およびこれらのメソッドを実行する難しさの挑戦しています。さらに、高分子繊維に関連する仕事の大半は合成または複合材料に集中しています。天然の高分子生体材料の源としては、人間の体の良い生体適合性プロパティを提供しています。それにもかかわらず、天然高分子繊維の配置を得るに比較的合成高分子ソース9のよりも難しいです。したがって、良質なたんぱく源としての天然高分子生体材料繊維への変換が重要な戦略 — だけでなく生体材料の繊維は、直接モノマーに不要な変換を回避するため、原料から分離されたが、見た目と良好な特性10またタンパク質繊維があります。
この点では、湿式紡糸、組織工学のための実験室規模で実装できるの基本的な概念を自然なポリマー繊維の生産のための安価な処理法について述べる。湿式紡糸は、押出、適したポリマー無溶剤に高分子溶液の凝固によって実行されます。適切な粘性ソリューション凝固中にドープした溶解するポリマー分子が発生します。相転移によるフィラメントの溶解度を失うし、固体高分子相11の形で沈殿します。組織再生アプリケーションのために適切考慮される成形プロセスによって管形状にゼラチンの開発を拡大してこの概念を参照します。さらに、本質的に、我々 開発することもゼラチン繊維からの材料の任意の形状 (例えば、ゼラチン コンジットを重ねいくつかのゼラチン繊維)、他のアプリケーションを必要に応じて。
ゼラチン、生分解性天然高分子は、変性、加水分解コラーゲン、コラーゲン12の結晶、非晶質、またはトリプル ヘリカル状態などから形成されます。そのコラーゲンは脊椎動物と無脊椎動物13,14神経の成長を誘導する主要な ECM の蛋白質の構造に類似しているすべての結合組織の重要な構造蛋白質をよく知られていると、同時に脊髄損傷の中に分泌するグリコサミノグリカンの大量に置き換えられます。したがって、ソースとしてゼラチンの使用は任意の医療車両に最適になります。ゼラチンは生分解性も安価なソースばかりかと cytocompatible と一時的な欠陥フィラー15に臨床的に実証済み。管形成,を in vitro および in vivo のテストここで説明は、ゼラチンは、優れた生体適合性と今後組織エンジニア リング アプリケーションの適合性を示しています。ひと脂肪幹細胞を培養、ゼラチン チューブは、神経細胞マーカーとして肯定的な特異染色による神経前駆細胞に分化を向上します。さらに、この研究では、定められた方法によって生成されるギャップ材料を充填としてゼラチンが期待されている管理しやすく安全にする組織の強化のため相関自然なポリマーの開発が現在組織の技術者が大いに再生戦略。
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Protocol
脂肪組織は、認定機関のレビュー ボードの三サービス総合病院、整形外科手術から得られた、動物を対象とする台北、台湾 (中華民国) 手続きは、国立で動物ケア委員会によって承認されています。国防医学院、台湾 (中興)。
1 湿式紡糸
-
ソリューションの準備
- 5% (w/v) 濃度を取得する二重蒸留水 100 ml ゼラチン パウダー 5 g を溶かします。
- 任意の気泡なし完全に同質な分散を達成するために 60-70 ° C を一晩でゆっくり混合物をかき混ぜます。
-
湿式紡糸
- 繊維の形成
注:方法の模式図を図 1に示します。回転セットアップが蠕動性ポンプ機装備 (材料の表を参照) には高精度速度を提供し、流れのスムーズな配信を制御します。- 透明なビニール チューブにソリューション インジェクターとして 26 x 1/2 インチ (0.45 mm × 12 mm) 注射器を差し込みます。
- 凝固浴として使用するビーカー ガラスで 99.5% アセトン溶液の 100 mL を準備します。
- 21 rpm (3.25 mL/分) で蠕動運動型ポンプのマシンを実行し、ゼラチン溶液展開する前にアセトン溶液に数秒間スタンドします。
- アセトン溶液からのゼラチン繊維を取り出し、1:20 (w/w)/ジクロロ メタン ポリカプロラクトン (PCL/DCM) ソリューションの 2.5% (w/v) にそれらを浸します。
- 室温でボンネットの下、一夜に PCL/DCM ソリューション乾燥繊維ゼラチンをしましょう。
- 管形成
注:方法の模式図を図 1Bに示します。- チューブ金型として 24 x 3/4 インチ (0.7 mm × 19 mm) の末梢静脈カテーテルを使用します。
- ゼラチン溶液にカテーテルを読み込むし、3 のそこにそれを保持する s。
- アセトン溶液にカテーテルを読み込むし、1 分間保持します。
- ゼラチン溶液にカテーテルを再度読み込むし、3 のそこにそれを保持する s。
- この代替手順 20 倍を繰り返します。
- アセトン溶液からカテーテルを取り出し、5 分間室温で乾燥成形チューブをしましょう。
- 優しく、止血を使用してカテーテルからゼラチン チューブを取り出し、慎重に PCL/DCM ソリューションの 2.5% (w/v) の浸漬とパスツール ピペット グラスにゼラチン チューブを転送します。
- ゼラチン チューブと PCL/DCM ソリューション乾燥一晩、室温でボンネットの下を含むパスツール ピペットをしましょう。
- 繊維の形成
2. ゼラチン チューブの形態
- 炭素スタブに乾燥ゼラチン チューブの部分をマウントします。
- イオン スパッタ コーター機にサンプルを入れて (材料の表を参照してください)、60 のための金でサンプルをコート s;それから、その形態を走査型電子顕微鏡による観察 (材料の表を参照してください)。
3. ひと脂肪幹細胞の培養
- 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 0.1% のブドウ糖から成る転送溶液 10 mL を含むペトリ皿に (臨床外科によって口腔の脂肪組織から得られた) 脂肪組織を配置します。
- 小さな断片 (1 mm2未満) に組織をメスの刃でカットします。
- 15 mL プラスチック チューブに 500 x gで 5 分間遠心する組織を転送します。
- 上澄みを除去し、加湿雰囲気の中で、37 ° C で 0.1% コラゲナーゼ ダルベッコ変法イーグル培地 (フェノールレッド 15 mg/L、1 mM ピルビン酸ナトリウム、4 mM L グルタミンから成る DMEM) 10 mL を含むプラスチック管の堆積物を孵化させなさい1 日の 95% 空気と 5% CO2を含みます。
- 500 x gで 5 分でプラスチック製のチューブを遠心、上清を慎重に破棄 (堆積物が接触していない)、10% 牛胎児血清 (FBS) を含む DMEM の 10 mL を追加することによってゆっくり堆積物を中断し、37 ° C で 1 日放置、95% 空気と 5% CO2を含む加湿雰囲気の中。
- 500 x gで 5 分でプラスチック製のチューブを遠心し、上清を慎重に破棄その後、文化の T25 フラスコ 4 mL を含む (表皮細胞無血清培地 (K SFM)、アムホテリシン、N アセチル L システイン、アスコルビン酸-2-リン酸、ストレプトマイシン、FBS の 5% の構成) を土砂を中断、それを転送幹細胞培地 1 mL を追加します。幹細胞の培地、95% 空気と 5% CO2を含む加湿雰囲気の中で、37 ° C で 3 日間放置します。
- 上澄みを廃棄、0.25% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加し、37 ° c で培養用フラスコの底から細胞をデタッチするのには 95% の空気と、3.5 分間 5% CO2を含む加湿雰囲気の中でインキュベートします。
- FBS の 1 mL を追加し、混合物を中断、微量遠心チューブに転送。
- 500 x g 3.5 分の懸濁液を遠心分離機、幹細胞培地 1 mL で土砂を中断および幹細胞用培地; 5 mL を含む培養用フラスコに転送その後、95% 空気と 5% CO2を含む加湿雰囲気で 37 ° C でそれを維持します。
- 幹細胞培地ごとに 3 日間を変更することによって、サブカルチャーを維持します。
4. ゼラチン管の細胞の培養
- 2 h の UV ライトとゼラチン チューブを滅菌します。エタノール 75% (v/v) に没頭し、それを洗って残留エタノールを削除する幹細胞培地で 2 倍。
-
培養用フラスコからひと脂肪幹細胞 (hASCs) を収集します。
- 培養用フラスコからメディアを削除します。
- 0.25% トリプシン-EDTA の 1 つの mL を追加し、, 95% の空気と 5% CO2培養用フラスコの底から hASCs をデタッチするのには、3.5 分を含む加湿雰囲気で 37 ° C で。
- FBS の 1 mL を追加し、混合物を中断、微量遠心チューブに転送。
- 3.5 分; 500 × gで遠心チューブを遠心分離します。慎重に、上澄みを廃棄し、幹細胞用培地 1 mL で土砂を中断します。
- 幹細胞培地 3 mL を含む 6 ウェル プレートでゼラチン チューブを置き、4 × 10 の4管; hASCs の種子95% 空気と 5% CO2を含む加湿雰囲気の中で、37 ° C で 2 週間それらを孵化させなさい。
- 細胞の成長のための十分な栄養を提供するために、幹細胞用培地 3 日ごとに変更します。
5. 免疫細胞化学
- 幹細胞の培地を外し、PBS でよく洗います。
- 0.1% 室温で 30 分間氷酢酸でセルとチューブを固定します。
- PBS で洗浄も 2 倍。
- 界面活性剤 (NP-40、0.05%) を追加します。室温で 10 分間インキュベートします。
- PBS で洗浄も 3 倍。
- 2% ヤギ血清を追加し、30 分間室温でインキュベートします。
- ソリューションをデカント一次抗体ネスチン (神経前駆細胞マーカー) を追加して、4 ° C で一晩インキュベート
- PBS で洗浄も 3 倍。
- 二次抗体ロバ アンチ mouse フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) を追加、2 h の暗闇の中でサンプルを保ちます。
- PBS で洗浄も 3 倍。
- 核を染色し、室温で 10 分間インキュベート ヘキスト 33342 の 1 mL を追加します。
- 井戸を洗って軽く蛍光顕微鏡下で観察して。
6. 生体生体適合性テストで
注:201-225 g の間で重量とラットは、このプロトコルを使用して正常にテストされています。
-
麻酔
- 誘導し、維持麻酔;好ましくは、ラット (8 週齢ラット スプレイグ ・女)を介してチレタミンとチレタミンの筋肉内注射の麻酔 (25 mg/kg + 25 mg/kg、それぞれ)、キシラジン (5 mg/kg)。痛み刺激テストを実行するには、anesthetization を確認するラットの指を押します。
-
手術部位の消毒
- ひげをそるし、(首の後ろ) をラットの僧帽筋部皮膚をきれい肌 (100 mg/mL) の無菌状態を準備するポビドン ヨード ローションで拭き取ってください。
- 細菌の転送と手術部位の後の汚染を削減する滅菌外科用ドレープとラットをカバーします。
-
ゼラチン チューブの注入
- 手術用ハサミでラットの僧帽筋エリアの皮膚を優しくカットします。
- 2 cm の創を作成し、筋と筋の間のレイヤーに直接ゼラチン チューブを置きます。
-
体外手術
- ナイロン縫合糸で傷口を閉じて、ポビドン ヨード溶液 (100 mg/mL) で拭いてください。
- ケトプロフェン (2.5 mg/kg)、セファゾリン 15 mg/kg の筋肉内注射によるラットを誘発します。
- 7 日間の無菌条件下でのラットを維持します。
-
安楽死
- ラットは安楽死の AVMA のガイドラインに従って CO2窒息で安楽死させた。胸にハートビートを確実に触れることによって続いてつま先と尾のピンチによってラットの死を確認します。
- メス刃を持つラットを優しくカット、移植組織を削除および観察のための写真を撮る。
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Representative Results
本研究では、正常に繊維 (図 2A) にゼラチンとユーザーフレンドリーな湿式紡糸概念を介して管 (図 2B, C) を開発しました。これらのゼラチン ベースの材料は、その形状に応じて、任意の医療ツールとして利用できます。機能表面とそのような材料のフレームがより組織再生に適しているを考えると、in vitro および in vivo のテストを実行することによってゼラチン チューブの生体適合性を検討しました。
まず、ゼラチン管の概要を得るためには、我々 は走査電子顕微鏡観察 (図 3) を使用して形態学的観察を実施しました。結果ゼラチン管の表面が非常に滑らかでなかったことを示した (図 3A)、その内径は以上 200 μ m (図 3B) とその厚さは約 20 μ m (図 3C) であった。
その後、ゼラチン管体外 (図 4) の生体適合性を調べる免疫細胞化学を行った。当初、ゼラチン チューブ 2 週間ひと脂肪幹細胞を培養した、神経細胞マーカー (図 4A) としてネスチンで染まっていた。蛍光顕微鏡下で染色を示した正ネスチン染色、細胞浸透性しゼラチン チューブによく付着し、分化が示唆された検出された核 (青の色) の束と一緒にマーカー (緑色)神経前駆細胞 (図 4B)。さらに、ゼラチンの管体内生体適合性試験は類似の結果を示した。ゼラチン チューブは、7 日間のラットの僧帽筋領域の筋膜層に挿入されました。この結果から, ゼラチン管の筋層への注入がその安全性と優れた生体適合性、局所組織の赤み、腫れ、その他炎症症状の徴候を示さなかったを示すし、に囲まれていたよく発達した結合組織 (図 5A, B)。
図 1: 湿式紡糸セットアップのスキーム。(A) ゼラチン繊維。(B) ゼラチンをチューブします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 湿式紡糸法によるゼラチン ベース素材の明るい映像が得られる。(A) ゼラチン繊維。(B) ゼラチンをチューブします。(C) ゼラチンは、PBS 溶液チューブします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 走査型電子顕微鏡による観察、ゼラチン チューブの形態。(A) A ゼラチン管の表面の表面的な眺め (スケールバー = 50 μ m)。(B) 傾斜平面図 (スケール バー = 200 μ m)。(C) 垂直ビュー (スケールバー = 25 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ゼラチン チューブにひと脂肪幹細胞 (hASC) 成長の観察します。ゼラチン管 hASCs の (A) 明るいビュー イメージです。(B) 蛍光顕微鏡下で染色のヘキスト 33342.The ゼラチン管正ネスチン核の束と一緒にマーカーを染色染色を示した hASCs 付着し、チューブ (スケール バーの内部成長に最適な環境を提供= 200 μ m;青色 = 核;緑色 = ネスチン)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ゼラチン チューブの生体内での生体適合性テストします。(A) ゼラチン管の筋層への注入。(B) 7 日後ゼラチン チューブ (赤の四角形の領域) 注入局所組織環境の観察。ない赤み、腫れ、または他の炎症の徴候が観察された, とチューブは留置後 7 日よく発達した結合組織に囲まれています。これはローカル組織環境とゼラチン管の優れた生体適合性を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 は単純な湿式紡績天然高分子組織再生の研究に適用できる技術を使ってゼラチン ベースの生体材料の開発を紹介しました。この作品は、ゼラチン ゼラチン自体のプロパティを最適化する目的で、他のソースの追加なしの素晴らしいたんぱく源として作製の可能性を示した。完全にゼラチン ベースの生体材料の開発を部屋の温度 (22-26 ° C) で行った。穏やかなソリューションの準備は、正確な濃度を維持し、任意の気泡を避けるために非常にスムーズに液を攪拌に、プロトコルの中で重要なステップです。ソリューションでは、泡の外観、注射器に読み込まれるときに特にゼラチン凝固中のフォームに影響します。
ゼラチン ベースの生体材料は、ポリマー分子の溶媒が発生し、固体高分子相11にゼラチン溶液を沈殿させる適切な凝固中のゼラチン溶液の相転移により得られました。湿式紡糸法の基本的な概念を採用し、チューブ形その表面の機能を増強して成形プロセスを通じて生体の機能を模倣するためにゼラチン状を利用しました。この場合、読み込むには、十分な時間保持し、手順が正確な管フォームを構築する必要を繰り返します。このプロトコルでは、プロセス中にチューブ形状の均一性制御できない考慮した、チューブの上の部分に下からの移行期の非同期的にします。さらに、この材料の保存・消毒方法は、蛋白質内容により制限されています。
生体外でそして生体内で検査を受け、現在の結果はこのプロトコルで作成されたゼラチン チューブ優れた生体適合性を示すし、ティッシュ エンジニア リングの素晴らしい潜在的な適用があることを示した。この研究で得られたゼラチン管の内部の直径は以上 200 μ m (図 3B) を通過し、チューブの内側表面の16に付着し細胞を可能にします。さらに、厚さと管の軽度ザラザラした表面細胞接着 (図 3A、C) の適切なテンプレートを提供します。一貫して、各種結果細胞が侵入し、ゼラチン チューブ-特に神経に付着した幹細胞、神経細胞マーカー ネスチン (図 4B との肯定的な染色を通してみた).特異マーカーは、軸索伸展の段階で成長円錐の地帯で発見されたとのネスチン陽性、円錐成長17を示す。最終的には、神経系の再生の治療にこの肯定的なゼラチン hASCs の組み合わせを実装できます。脊髄は神経細胞軸索のグループおよび脊髄脊椎に沿って神経線維の束から成ってください。したがって、ゼラチン チューブは可能性があります適切な充填のギャップを提供するだけでなく、ガイド神経線維の成長や管を通して再生。また、優れた生体適合性が観測筋膜にゼラチン チューブの注入による層は有害な実証していないと、ローカル組織と管に炎症効果がよく発達した結合組織 (図 5 に囲まれていた A, B)。
結論としては、見通しの組織工学アプリケーションなどの緊張で使用できる優れた生体適合性と細胞の環境による生体材料のゼラチン ベースの建設のためのシンプルで便利なプロトコル開発に成功尿路再建、血管置換システムの再生と器官の部品の再構築します。このプロトコルは、現在任意の合成高分子添加せず相関自然ポリマーを開発している組織の技術者によって実装できます。プロトコルに簡単に拡張することができます、特定の生体材料のデザインのカスタマイズに使用できます。将来は、このプロトコルは量産規模、組織再生を実現することでたんぱく質系生体材料の生産に適応することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究によって、国防の大臣 (MAB-105-070; をサポートされていましたMAB-106-077;MAB-107-032;MAB-107-065)、科学技術 (ほとんど 107-2320-B016-016)、三サービス総合病院、国立省防衛医療センター、台湾 (TSGH-C106-046;TSGH-C106-115。TSGH-C107-041)、鄭新総合病院と国立防衛医療センター協力 (CH-NDMC-107-8)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
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