Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.

Abstract

Neurale stam-en voorlopercellen (Nspc's) zijn de cellulaire basis voor de complexe structuren en functies van de hersenen. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches in vivo en kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in vitro, dienen als een belangrijke bron voor celtransplantatie om hersenbeschadiging te herstellen. Nspc's zijn echter heterogene en niet duidelijk gedefinieerd op moleculair niveau of gezuiverd als gevolg van een gebrek aan specifieke celoppervlak markeringen. Het gepresenteerde protocol, dat eerder is gerapporteerd, combineert een neurale-endothelial co-cultuur systeem met een metabole ontwikkelen-etiketterings methode om het oppervlak sialoglycoproteome van primaire nspc's te identificeren. Het NSPC-endotheliale co-cultuur systeem maakt zelf vernieuwing en uitbreiding van primaire Nspc's in vitromogelijk, waardoor een voldoende aantal nspc's worden gegenereerd. Sialoglycans in gekweekte nspc's zijn gelabeld met behulp van een onnatuurlijke sialic acid metabole reporter met bioorthogonale functionele groepen. Door het sialoglycoproteome te vergelijken met zelfverlengde Nspc's die in een endotheliale co-cultuur met differentiërende neurale cultuur zijn uitgebreid, identificeren we een lijst van membraan eiwitten die verrijkt zijn met Nspc's. In detail omvat het Protocol: 1) het opzetten van een NSPC-endotheliale co-cultuur en NSPC-differentiërende cultuur; 2) etikettering met azidosugar per-O-geacetoneerde N-azidoacetylmannosamine (AC4Mannaz); en 3) Biotine conjugatie aan gemodificeerde sialoglycan voorbeeld vorming na fixatie van neurale cultuur of EiwitExtractie uit neurale cultuur voor massaspectrometrie analyse. Vervolgens worden de NSPC-verrijkte oppervlak marker kandidaten geselecteerd door vergelijkende analyse van massaspectrometrie gegevens uit zowel de uitgebreide NSPC en gedifferentieerde neurale culturen. Dit protocol is zeer gevoelig voor het identificeren van membraan eiwitten van geringe overvloed in de uitgangsmaterialen, en het kan worden toegepast op marker ontdekking in andere systemen met passende modificaties

Introduction

Neurale stamcellen worden gedefinieerd als een multipotente celpopulatie die zichzelf kan verlengen om een stamcel zwembad te behouden en zich te differentiëren in neuronen en gliacellen. Ze zijn de belangrijkste celtypen in het zenuwstelsel en kunnen een groot therapeutisch potentieel bieden in regeneratieve geneeskunde door middel van celtransplantatie in zieke en gewonde hersenen1,2. Naarmate de ontwikkeling vordert, wordt de neurale stamcel populatie heterogene3,4, en het aandeel van neurale stamcellen in de hersenen neemt geleidelijk af5. Over het algemeen bevinden embryonale stamcellen en andere neurale voorlopercellen, gezamenlijk neurale stam-en voorlopercellen (Nspc's), zich in de Germinal zones, de ventriculaire zone en de subventriculaire zone bij muizen6. In het embryonale brein genereren neurale stamcellen direct of indirect neuronen via tussenliggende voorlopercellen (ipc's), en in sommige soorten door de buitenste subventriculaire zone-voor ouders (orgs)7,8. De specifieke moleculaire handtekening, morfologie, locatie in de stamcel niche en differentiatie potentieel bepalen allemaal de rol van elk subtype in hersen organogenese en klinische toepassingen9. De momenteel beschikbare celoppervlak markeringen kunnen echter niet ondubbelzinnig verschillende subtypen van Nspc's discrimineren en zuiveren, waardoor het begrip en het gebruik van deze subtypen worden beperkt.

De identificatie van primaire NSPCs-oppervlak markeringen wordt beperkt door drie grote hindernissen. De eerste is het beperkte celnummer van Nspc's in het weefsel, waardoor het moeilijk is om celoppervlakte proteïne monsters voor te bereiden voor gemeenschappelijke massaspectrometrie analyse. De tweede beperking is de moeilijkheid bij het produceren van zuivere celsubtypen voor het genereren van subtype-specifieke membraan proteïne gegevens. Ten slotte is de derde uitdaging de lage ratio van celoppervlakte eiwitten in hele celeiwitten, wat hun detectie gevoeligheden belemmert door massaspectrometrie analyse.

Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we een chemoproteomische benadering om celoppervlakte eiwitten in primaire Nspc's selectief te verrijken en te identificeren door de sialoglycoproteïnen10metabolisch te labelen. Om een voldoende aantal Nspc's te genereren, maakten we gebruik van een vastgesteld protocol om de primaire embryonale Nabc's in ongedifferentieerde toestanden uit te breiden en te handhaven in vitro, door het coculeren van Nspc's met muizen hersen endotheliale cellijnen met behulp van een permeabele ondersteuning matrix insert (bijv. trans well) systeem11. In tegenstelling, npscs gekweekt alleen zonder endotheel cellen genereren gedifferentieerde nageslacht11,12. Zo kunnen eiwit monsters van deze twee kweeksystemen relatief worden geanalyseerd om eiwitten te identificeren die differentieel uitgedrukt zijn in Nspc's en gedifferentieerde neuronen. Aangezien de meeste celoppervlakte eiwitten worden gemodificeerd door sialic acid13, onnatuurlijke sialic acid precursor analoge N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC4Mannaz) werd gebruikt om de intrinsieke metabole route te kapen, zodat endogene, nieuw gesynthetiseerde sialoglycans zijn gelabeld met meer groepen, het genereren van een chemische handvat14. Via azido-alkyne-gemedieerde bioorthogonale reacties, die biotine aan sialoglycans Conjugeren, kunnen celoppervlakte eiwitten worden gevisualiseerd en verrijkt voor proteomische identificatie door middel van een streptavidine-gekoppelde de of matrix14.

Hier voeren we kleuring van SDS-PAGE gel analyse van het oppervlak sialoglycoproteome uit Nspc's uitgebreid in een endotheliale co-cultuur en differentiërende cellen in een niet-co-cultuur systeem. We zuiveren ook selectief oppervlak sialoglycoproteome in de twee kweeksystemen voor proteomische vergelijking. Ons protocol, in vergelijking met de traditionele centrifugatie-based cel oppervlakte zuivering protocollen15, verhoogt de extractie werkzaamheid door het verminderen van de oppervlakte-EiwitExtractie procedures door middel van specifieke tag conjugatie en affiniteit Zuivering. Ondertussen, het verhoogt de extractie zuiverheid van celoppervlakte eiwitten op basis van de veronderstelling dat verminderde gebeurt meestal op het celoppervlak eiwitten. Hoewel endotheliale factoren de differentiatie van uitgebreide Nspc's niet volledig kunnen blokkeren, biedt de vergelijkende studie tussen een co-cultuur en gedifferentieerde cultuur een handige methode om stamcel verrijkte oppervlakte eiwitten te lokaliseren zonder de noodzaak om Analyseer eiwitten uit Npc's gezuiverd door FACS16. Wij zijn van mening dat deze aanpak kan worden toegepast op onderzoek van oppervlakte eiwitten in andere systemen met de juiste aanpassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in deze studie gebruikte dier protocollen zijn goedgekeurd door het IACUC (institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité) van de Tsinghua-Universiteit en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het IACUC. De laboratorium dierenfaciliteit van Tsinghua University is geaccrediteerd door de AAALAC (vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International). Voor het klaarzetten van embryo's werd halverwege de dag van de geïdentificeerde vaginale plug berekend als embryonale dag 0,5 (E 0.5).

Opmerking: Alle cellen worden gekweekt in de celincubator onder voorwaarden van 37 °C en 5% CO2.

1. bereiding van de muis endotheliale cultuur in permeabele ondersteuning inserts

Opmerking: BEND3 cellen worden bijgehouden volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Bereid BEND3 cel medium (BM) voor door toevoeging van 50 mL FBS en 5 mL penicilinestreptomycine in 500 mL DMEM en meng goed.
  2. Aspireren het medium uit de schaal en was de BEND3 Cells-cultuur met 1 mL PBS eenmaal. Voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de cellen en inincuberen de cellen gedurende 4 minuten bij 37 °C.
  3. Voeg 1 mL BM toe aan de cellen om trypsine-EDTA te neutraliseren en zachtjes op en neer te pipetteren om de cellen volledig te ontkoppelen. Breng de celsuspensie in een nieuwe conische buis en pellet van 15 mL door centrifugeren bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min bij 400 x g.
  4. Aspireren de supernatant uit de buis en rediëren van de cellen met 9 mL verse BM, voeg vervolgens 1 mL celsuspensie in één permeabele steun invoegen. Voeg nog eens 2 mL verse BM per put toe aan de onderste kamer van de matrix. Blijf de cellen voor één dag cultuur.

2. bereiding van de primaire corticale NSPCs-cultuur van de muis

  1. Bereiding van cultuur plaat, papaïne vergistings medium en corticale hecht kweekmedium (AM)
    1. Jas 6-well platen met poly-L-lysine (PLL) door toevoeging van 1 mL PLL oplossing per put in 6-well platen. Inbroed de platen vervolgens gedurende 30 minuten bij RT.
    2. Breng de PLL-oplossing over in een conische buis van 15 mL. Was de platen 3 keer met dubbel gedestilleerd water. Lucht drogen de platen en leg ze opzij tot gebruik.
    3. Bereid het gistings medium van papaïne voor door toevoeging van 50 U papaïne, 50 μL L-glutamine en 50 μL van 100 mg/mL acetyl-L-cysteïne in 5 mL DMEM. Meng het medium kort en verwarm het tot 37 °C gedurende 30 minuten voor enzymactivering.
    4. Bereid de corticale cel aanhandig kweekmedium (AM): Voeg 500 μL L-glutamine, 500 μL natrium pyruvate, 500 μL van 100 mg/mL N-acetyl-L-cysteïne, 500 μL N2, 1 mL B27 en 5 μL van 100 μg/mL bFGF in 50 mL van de DMEM. Meng het medium goed en verwarm het tot 37 °C voor gebruik.
  2. Bereiding van primaire cerebrale corticale cellen en daaropvolgende plating
    1. Offer een E 10.5 getimede zwangere muis door cervicale dislocatie.
      Opmerking: Bij E 10.5 zijn de meeste cellen prolifererende Nspc's in de hersenschors, wat leidt tot grote klonen van nakomelingen in vitro.
    2. Steriliseren de buik met 75% ethanol. Gebruik een fijne schaar en een micro-geserrated tang om de buik te openen door de huid en de onderliggende spier aan de rechterkant van de middelste lijn te snijden. Verwijder de baarmoeder voorzichtig uit de buikholte met geserreerde Tang en snijd deze uit de buikholte met een fijne schaar.
    3. Was de baarmoeder met 40 mL voorgekoelde HBSS in 10 cm Petri schaaltje. Breng vervolgens de baarmoeder over in een nieuwe 10 cm Petri schaaltje en was het opnieuw met 40 mL voorgekoelde HBSS.
    4. Breng de baarmoeder over in een nieuwe 10 cm Petri schaal met 40 mL voorgekoelde HBSS. Verwijder de embryo's uit de baarmoeder en het vrucht vlies, snijd vervolgens de hoofden van de embryo's af van de boomstammen met juweliers microforceps.
    5. Was de koppen met 40 mL voorgekoelde HBSS en breng de koppen over naar een nieuwe 10 cm Petri schaal met 40 mL voorgekoelde HBSS. Gebruik juweliers microforceps om huid en kraakbeen die de hersenen bedekken weg te pellen, snijd vervolgens de cerebrale cortices af en Verzamel ze in een conische buis van 15 mL met voorgekoelde HBSS.
    6. Pellet de cortices door centrifugeren gedurende 3 min bij 4 °C en 300 x g. Aspireren de supernatant uit de buis, vervolgens toe te voegen geactiveerde papaïne digestie medium en 15 μL 4 mg/mL DNase I in de weefsel pellet.
    7. Rebreng de weefsel pellet kort door met zachte vortexing. Inincuberen van het weefsel bij 37 °C gedurende 30 minuten. Gedurende deze tijd, maak het weefsel met een korte grondig elke 10 min.
      Opmerking: Aan het einde van de spijsvertering, mogen er geen zichtbare weefsel stukken in de buis.
    8. Pellet de corticale cellen door centrifugeren gedurende 10 min bij 4 °C en 450 x g. Aspireren de supernatant uit de buis en was de celpellet met voorgekoelde DMEM. Herhaal deze stap één keer.
      Opmerking: Let er tijdens de spijsvertering en het wassen op dat u de weefsels en de celpellet niet ruwweg pipetteren om beschadiging van de cellen met een sterke Afschuifkracht te voorkomen.
    9. Zuig de supernatant uit de buis en voeg vervolgens 1,5 mL voorgekoelde HBSS toe aan de buis. Dissocieren de corticale celpellet in afzonderlijke cellen met zachte pipetteren. Tel het celnummer met een hemocytometer.
    10. Voeg 2 mL AM en 2 x 104 corticale cellen per put toe aan 6-well platen. Incuberen de plaat bij 37 °C en 5% CO2 voor 3 uur om de cellen aan de plaat te laten hechten.

3. set-up van neurale-endotheliale co-cultuur en AC4Mannaz labeling systeem

  1. Een dag na het bekleden BEND3 cellen in de inserts, zachtjes aspireren het medium in de onderste kamer eerst, dan de inserts. Was de enface van de inserts 3 keer met vooraf opgewarmd DMEM. Was het buitenoppervlak van de wisselplaten doorspoelen met voorverwarmde DMEM.
  2. Voeg 1 mL voorverwarmde AM in één wisselplaat toe en breng de wisselplaten vervolgens over in de putjes met primaire corticale cellen. Incuberen de co-cultuur bij 37 °C en 5% CO2 voor 12 uur.
  3. Los AC4Mannaz op in DMSO om een voorraad concentratie van 200 mm te bereiken. 12 h na het opzetten van de neurale-endotheliale co-cultuur, voeg 1 μL AC4Mannaz-kolf per onderste kamer en 0,5 μL voorraad per wisselplaat toe aan de co-cultuur. Schud de platen onmiddellijk en zachtjes om het medium goed te mengen. Voor de controle cellen, voeg gelijk volume van DMSO.
  4. Kweek de cellen nog eens 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Bereid de AM met 10x bFGF als refeeding medium (RM). Gedurende deze tijd voegt u 100 μL RM per INSERT en 200 μL RM per onderste kamer toe om de endotheliale en neurale cellen om de andere dag opnieuw te voeden. Tijdens het opnieuw voeden, niet AC4Mannaz of DMSO in de cultuur te leveren.

4. immunofluorescentie kleuring van Sialoglycoproteïnen in uitgebreide primaire Nspc's en gedifferentieerde neuronen

  1. Bereid BTTAA-CuSO4 complex 1 30x kolf met 1,5 mm CuSO4 en 9 mm bttaa in dubbel gedestilleerd water. Bereid vers Biotine-geconjugeerde buffer 1 met 50 μM Biotine-alkyne, 2,5 mM natrium ascorbaat en 1x BTTAA-CuSO4 complex in PBS.
  2. Verwijder de inserts van de co-cultuur platen. Aspireren het kweekmedium van de bodemputten en was de neurale cellen één keer met pre-warmed PBS.
  3. Zuig de PBS uit de putjes. Voeg 1 mL voorgekoelde 4% Paraformaldehyde PBS oplossing per put in de cellen toe en fixeer de cellen bij RT gedurende 10 minuten. Was vervolgens 3 keer de cellen met voorgekoelde PBS.
  4. Aspirate PBS uit de putjes en voeg 1 mL vers bereide Biotine-geconjugeerde buffer 1 per put in de cellen toe. Incuberen de cellen op RT gedurende 10 minuten.
  5. Zuig de reactiebuffer van de putjes op. Was de cellen 3 keer met PBS. Bereid de kleurings buffer met 1% FBS en 1 μg/mL Alexa Fluor 647-streptavidin. Voeg 1 mL kleurings buffer per put in de cellen toe en inincuberen de cellen op RT gedurende 30 minuten.
  6. Aspireren de kleurings buffer uit de putten en gewassen cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Bereid de blokkerende buffer met 5% BSA en 0,3% niet-ionische reinigingsmiddel-100 in PBS. Voeg 1 mL blokkerende buffer per put in de cellen toe en inincuberen op RT gedurende 10 minuten.
  7. Bereid een primaire antilichaam oplossing door de anti-nestin-en anti-β-tubulineiii-antilichamen samen in de blokkerende buffer in verhoudingen van respectievelijk 1:20 en 1:1000 te verdunen. Verwijder de blokkerende buffer uit de putjes en voeg per put 1 mL primaire antilichaam oplossing toe aan de cellen. Incuberen de cellen bij 4 °C 's nachts.
  8. Verwijder de primaire antilichaam oplossing uit de putjes. Was de cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Bereid een secundaire antilichaam oplossing voor door het verdunnen van Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 546 Goat anti-Mouse IgG2b en DAPI samen in blokkerende buffer bij een verdunning van 1:1000. Aspireren van de PBS uit de putten en voeg 1 mL secundaire antilichaam oplossing per put in cellen. Incuberen de cellen op RT gedurende 2 uur.
  9. Aspireren de antilichaam oplossing uit de putjes en was de cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Daarna zijn de cellen klaar voor het vastleggen van foto's.

5. zuivering van Sialoglycoproteïnen van uitgebreide primaire Nspc's en gedifferentieerde neuronen

  1. Bereid BTTAA-CuSO4 complex 2 15x voorraad met 1,5 mm CuSO4 en 3 mm bttaa in dubbel gedestilleerd water. Bereid de proteïne resuspensie buffer A met 4% SDS en 10 mM EDTA in dubbel gedestilleerd water; proteïne resuspensie buffer B met 150 mM NaCl, 50 mM Triethanolamine, en 1% polyoxyethyleenoleyl ether (bijv. Brij97) in dubbel gedestilleerd water met pH 7,4. Meng buffer A:buffer B = 1:8 (vol/vol) voor gebruik, om de volledige proteïne-resuspensie buffer voor te bereiden. Bereid de proteïne-wasbuffer 1 met 2% SDS in PBS; proteïne-wasbuffer 2 met 8 M ureum in 250 mM Ammoniumbicarbonaat (ABC); en proteïne washing buffer 3 met 2,5 M NaCl in PBS.
  2. Verwijder de inserts van de co-cultuur platen. Aspireren het kweekmedium van de bodemputten en was de neurale cellen eenmaal met voorgekoelde PBS.
  3. Zuig de PBS uit de putjes en voeg 200 μL vooraf gekoelde RIPA-Buffer per put in de platen toe. Inbroed de platen op ijs gedurende 5 min. Verzamel de eiwit lysis in 1,5 mL tubes. Pellet het celpuin door centrifugeren gedurende 10 min bij 4 °C en 12.000 x g.
  4. Breng het supernatant over in nieuwe 1,5 mL tubes. Bepaal de eiwitconcentratie met de BCA-Kit volgens de instructies van de fabrikant. Stel de eiwitconcentratie in op 1 mg/mL.
  5. Voeg 100 μM alkyne-biotine, 2,5 mM Natriumascorbaat en 1x BTTAA-CuSO4 complex 2 tot 1 ml eiwit lysis toe en meng de oplossing goed. Incuberen de mix bij RT gedurende 1 uur.
  6. Breng de reactie oplossing over in 20 mL voorgekoelde methanol in een conische buis van 50 mL. Meng goed en incuberen bij-30 °C 's nachts om de eiwitten neer te slaan.
  7. Pellet het eiwit precipiteert door centrifugeren voor 15 min bij 4 °C en 4.500 x g. Was de proteïne pellet tweemaal met 20 mL voorgekoelde methanol. Aspireren de supernatant uit de buis. Hervat de proteïne pellet met 4 mL proteïne resuspensie buffer en breng de proteïne resuspensie over in een nieuwe 15 mL conische buis.
  8. Neem 50 μL streptavidine kralen en was ze 3 keer met PBS. Voeg de gewassen kralen toe aan de proteïne resuspensie. Inincuberen de oplossing bij 4 °C gedurende 3 uur op een verticale Rotator bij een rotatiesnelheid van 20 rpm.
  9. Was de kralen opeenvolgend met 6 soorten buffers: proteïne washing buffer 1, proteïne washing buffer 2, proteïne washing buffer 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC en 0,05 M ABC.
  10. Na het wassen, hervat de kralen met 20 μL PBS en breng de kralen over in een nieuwe 1,5 mL Tube. Voeg 20 μL van 2x eiwit laad buffer toe aan de kralen en behandel bij 95 °C gedurende 10 minuten. De eiwit monsters moeten dan worden onderworpen aan SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 volgens de instructies van de fabrikant. Snijd de eiwitten in de gel zoals aangegeven door Coomassie Brilliant Blue R-250 voor massaspectrometrie analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hele procedure voor in-vitro expansie en metabole labeling van primaire embryonale Nspc's duurt 6 dagen (Figuur 1a). Kwaliteit van de BEND3 cellijn en vers geïsoleerde primaire Nspc's zijn essentieel voor een succesvol experiment. BEND3 cellen zijn de bron van oplosbare factoren die zelf vernieuwing en proliferatie van Nspc's stimuleren. Er moet voor worden gezorgd dat de BEND3 cellen vrij zijn van verontreiniging en actief worden gesplitst met minimale celdood voordat ze samen met neurale cellen worden gekweekt. De primaire Nspc's moeten zorgvuldig worden voorbereid om overmatige schade tijdens dissociatie te voorkomen. Beschadigde Nspc's kunnen nog steeds groeien en differentiëren; echter, ze zijn niet in staat om te reageren op endotheliale stimuli goed te behouden van de stemdheid en uit te breiden. Extra voorzichtigheid moet worden betracht om aseptisch te zijn tijdens celkweek, aangezien het protocol geen toevoeging van antibiotica aan het primaire kweekmedium suggereert.

De succesvolle endotheliale co-cultuur zal Nspc's leiden tot het vormen van grote, bladachtige klonen. Dergelijke aanbevolen kloon vormen worden duidelijk op dag 4 en zijn zeer typerend op dag 6. Binnen de klonen onderhouden de cellen nauw contact met elkaar. Immunokleuring met antilichamen tegen de NSPC marker Nestin en de neuronale marker β-tubulin III moet onthullen dat in de kloon, de meeste van de cellen zijn Nestin+ nspc's en zeer weinig zijn β-tubulin III+ neuronale cellen. In tegenstelling, het percentage van Nestin + cellen en β-tubulin III+ neuronale cellen in kloon gevormd in niet-co-cultuur systeem zijn bijna hetzelfde (Figuur 1b, 1d, en 1e).

De chemische Reporter, AC4Mannaz, is een metabole analoge en kan worden opgenomen in de intrinsieke eiwit verminderde traject. Hoge doses AC4Mannaz zijn giftig voor cellen. Voor elk specifiek type cel moet de etiketterings concentratie van AC4Mannaz vooraf worden getest om de hoogste etiketterings efficiëntie te bereiken zonder significante cytotoxiciteit. Hier is de geoptimaliseerde etiketterings concentratie van AC4Mannaz voor primaire nspc 100 μM. combinatoire evaluatie van celdood aangegeven door cellulaire en kernen morfologie suggereert dat deze etiketterings concentratie geen duidelijke cytotoxische effecten veroorzaakt en in staat zijn om Nspc's efficiënt te labelen (figuur 1c en 1d). De van klonen morfologie, het zelfvernieuwings-en differentiatie potentieel van nspc's in zowel het endotheliale co-cultuur-als het niet-co-cultuur systeem worden niet aangetast (figuur 1c, 1den 1e).

De succesvolle labeling van Nspc's door AC4Mannaz kan worden onderzocht na het Conjugeren van Biotine in een door een bioorthogonale reactie tussen natriumazide en alkyne gemedieerde cultuur. Elke cel in de AC4Mannaz-gelabelde cultuur wordt gekleurd en gevisualiseerd met Alexa Fluor 647-streptavidin. Geen enkele cel is positief voor Alexa Fluor 647-streptavidin kleuring in de DMSO controlegroep. Bovendien, eiwit monsters bereid uit de AC4Mannaz-gelabelde cultuur door Biotine conjugatie en streptavidine kralen zuivering Toon sterke Coomassie briljant blauw kleurings signaal in SDS-page gels. Ondertussen waren er alleen kleuring achtergrond en niet-specifieke bindende signalen in de rijstroken geladen met eiwit monsters van de DMSO controlegroep. Dit duidt ook op de efficiënte labeling van Nspc's door AC4Mannaz (Figuur 1f).

Figure 1
Figuur 1 : Identificatie van celoppervlak markeringen voor primaire Nspc's bijgestaan door endotheliale co-cultuur systeem en metabole sialoglycan-labeling. (A) Schematische voorstelling van de workflow voor het protocol. Dit cijfer is gewijzigd van Bai et al. 10. de BEND3 cellen worden onderverdeeld in matrix inserts op D0. De bereiding van primaire corticale Nspc's en het opzetten van een co-cultuur systeem worden uitgevoerd op D1. Metabole labeling van cultuur duurt van D2 tot D6. Cultuur hervoederen wordt uitgevoerd op D3 en D5. B) de immunofluorescentie beelden voor klonen die worden gevormd door primaire Nspc's na een 5-daagse cultuur met of zonder endotheel cellen. Schaalbalk geeft 20 μm aan. (C) helder-veld beelden voor klonen gevormd door primaire Nspc's na een 5-daagse cultuur met AC4Mannaz of DMSO. De kernen werden tegen de DAPI. De schaalbalk geeft 20 μm aan. De foutbalk geeft SEM aan (n.s. = niet significant). D) de immunofluorescentie beelden voor NSPC vormde klonen in de endotheliale co-cultuur met AC4Mannaz of DMSO. Onderbroken cirkel wordt een enkele neurale kloon afgebakend. De schaalbalk geeft 50 μm aan. (E) kwantificering van Nspc's en gedifferentieerde neuronen in klonen gevormd door Nspc's in de endotheliale co-cultuur en het niet-co-cultuur systeem met AC4Mannaz-labeling of DMSO-controle. De foutbalk geeft SEM aan (* * * p < 0,0005; n.s. = niet significant). F) Coomassie briljante blauwe kleuring van eiwitten gezuiverd door streptavidine kralen uit neurale cellen gelabeld met AC4Mannaz of DMSO in endotheliale co-cultuur en niet-co-cultuur systeem. De 55 kD-band in controle-etiketterings groepen representeert niet-specifieke bindende eiwitten. (B, C, E en F) die overeenstemmen met dit protocol zijn aangepast van Bai et al. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oppervlakte markeringen worden vaak gebruikt om specifieke celtypen in vitro en in vivo17,18te labelen en te zuiveren. De ontdekking van oppervlakte markers levert een grote bijdrage aan regeneratieve geneeskunde en onderzoek door stamcel door moleculaire hulpmiddelen te bieden om een stamcel populatie selectief te verrijken van normale of pathologische weefsels en cultuur gerechten, met een gezuiverde cel bron voor klinisch gebruik of studie van biologische eigenschappen. Echter, vooruitgang in het ontwikkelen van oppervlak markers voor neurale stamcelonderzoek is traag als gevolg van de moeilijkheid in het isoleren van stamcellen van primaire weefsels. Het hier beschreven protocol is gebaseerd op een vereenvoudigd in-vitro-platform. Door het vergelijken van primaire Nspc's die door een endotheliale co-cultuur worden uitgebreid tot een differentiërende neurale cultuur, worden eiwitten die in uitgebreide Nspc's worden uitgedrukt, gemarkeerd en kunnen ze verder worden geïdentificeerd. Ons protocol biedt ook een alternatieve strategie om celoppervlakte eiwitten te zuiveren door de intrinsieke metabolische weg te kapen om sialoglycan te labelen met bioorthogonale groepen. Vergeleken met traditionele protocollen voor het zuiveren van celoppervlakte eiwitten, worden de voordelen van dit protocol ondersteund door twee specifieke kenmerken: 1) de prevalentie van sialylering op celoppervlak eiwitten zorgt voor maximale dekking van het celoppervlak proteome, en 2) de reactie specificiteit tussen de bioorthogonale groep en haar liganden geeft de zuiverheid van het verworven oppervlak proteome. Ons protocol resulteert dus in een gevoeliger Proteomic analyse in het geval van minder uitgangsmaterialen. We hebben aangetoond dat dit protocol haalbaar is in primaire NSPCs-oppervlakte markeringen. Met de gepaste wijzigingen in de uitbreidende stamcellen in vitro, kan deze chemoproteomic-benadering compatibel zijn met het identificeren van oppervlakte markeringen van andere stamcel typen. Het is opmerkelijk dat als Ac4ManNAz per-O-geacetseerd is het kan leiden tot kunstmatige S-glycosylation. Het gebruik van ongeacetonnatuurlijke suikers kan de artefact vorming voorkomen en de specificiteit en geldigheid van metabole ontwikkelen labeling in levende cellen19verbeteren.

De bereiding van primaire corticale neurale voorlopercellen en endotheelcellen zijn cruciale stappen van het protocol. Eerste, bij het verteren van embryonale corticale weefsels, de spijsvertering tijd, hoeveelheid enzym, en de sterkte van de behandeling moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Overmatige spijsvertering en mechanische afschuifkrachten beschadigen de integriteit van plasma membraan en celoppervlak receptoren die signaaltransductie bemiddelen voor overleving en groei van cellen, en ze zullen ook de responsiviteit van Nspc's verstoren voor het stimuleren van endotheliale cellen en hun zelfvernieuwings vermogen. Om een goede spijsvertering te bereiken, moeten onderzoekers de papaïne volledig activeren en de spijsvertering stoppen zodra de weefsel blokken verdwijnen. Ten tweede moeten BEND3 cellen in een gezonde staat worden gehandhaafd om de secretie te ondersteunen. Het is aanbevolen om te gebruiken BEND3 cel batches met minder passages en passage van de cellen voordat ze bereiken 100% samenloop. Dit voorkomt arrestatie van de celcyclus en senescentie veroorzaakt door DNA-schade opgelopen tijdens het doorgangen of overbevolkt contact tussen cellen.

De technologie voor sequentiëren van hoge doorvoer verhoogt de identificatie van celoppervlak markeringen door het analyseren van RNA-expressie, vooral voor celtypen, waaronder weefsel stamcellen, die vaak in vivo aanwezig zijn in hoeveelheden die te klein zijn om een Proteoom analyse uit te voeren door Massaspectrometrie. Hoewel RNA-SEQ-analyse genen kan identificeren die specifiek in Nspc's zijn uitgedrukt, weerspiegelt het mogelijk niet echt de eiwit expressieniveaus, omdat RNA-expressie niet altijd consistent is met eiwit expressie20. Bovendien kunnen niet-eiwit biomoleules die kunnen werken als oppervlakte markeringen niet worden gedetecteerd door transcriptomische studies. Bijvoorbeeld, oligosaccharide Lewis X is een bekende oppervlakte-Maker op grote schaal gebruikt om menselijke embryonale stamcellen en Nspc's te labelen, hoewel het kan worden geassocieerd met meerdere eiwitten21. Daarom is directe massaspectrometrie analyse nog niet substitueerbaar, en de ontwikkeling van methoden die massaspectrometrie analyse meer haalbaar en handig kunnen maken is van groot belang voor toekomstige studies.

Naast sialylation, andere vormen van post-translationele eiwit modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van functies van gemodificeerde eiwitten. Deze wijzigingen beïnvloeden eiwit eigenschappen zoals de conformatie, Half-Life, en subcellulaire lokalisatie22,23. Verschillende eiwit modificaties hebben celtype specificiteit24,25,26. Met de groeiende inhoud van de chemische Toolbox zijn meer modificatie types vatbaar voor metabole etikettering met chemische verslaggevers27. Vandaar dat de hier beschreven chemische benadering kan worden gebruikt voor het bestuderen van andere verschillen in eiwit modificatie tussen stamcellen en gedifferentieerde cellen, ter illustratie van de moleculaire mechanismen achter het onderhoud van stamcel eigenschappen en differentiatie Verordening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verstrekken.

Acknowledgments

Figuur 1b, 1C, 1e en 1f zijn overgenomen van Bai et al . 10 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. We bedanken Yi Hao in X. C. 's Lab voor het bewerken van figuren. Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 91753206 tot Q. S. en X. C., nr. 31371093 naar Q. S., en nrs. 21425204 en 21672013 naar X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

Neuroscience probleem 151 metabole ontwikkelen-labeling sialic-zuren bioorthogonale reactie neurale stamcellen voorlopercellen oppervlakte markers endotheel cellen proteome chemische labeling cerebrale cortex
Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter