Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sialoglycan के मेटाबोलिक लेबलिंग द्वारा प्राथमिक तंत्रिका स्टेम और संतति कोशिकाओं के सेल सतह मार्करों की पहचान

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है कि एक इन विट्रो तंत्रिका-एंडोथेलियल सह संस्कृति प्रणाली और bioorthogonal कार्यात्मक समूहों के साथ sialoglycan के चयापचय निगमन को जोड़ती है प्राथमिक तंत्रिका स्टेम और संतति कोशिकाओं का विस्तार और उनकी सतह लेबल कोशिका सतह मार्करों के इमेजिंग या मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए sialoglycoप्रोटीन.

Abstract

तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं (NSPCs) जटिल संरचनाओं और मस्तिष्क के कार्यों के लिए सेलुलर आधार हैं. वे विवो में विशेष niches में स्थित हैं और अलग किया जा सकता है और इन विट्रो मेंविस्तार, सेल प्रत्यारोपण के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में सेवा करने के लिए मस्तिष्क क्षति की मरम्मत. तथापि, एनएसपीसी विषमांगी होती है और विशिष्ट कोशिका सतह मार्करों की कमी के कारण आण्विक स्तर पर स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं होती है अथवा शुद्ध नहीं होती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल, जो पहले से सूचित किया गया है, प्राथमिक NSPCs की सतह sialoglycoproteome की पहचान करने के लिए एक चयापचय ग्लिकन लेबलिंग विधि के साथ एक तंत्रिका-endothelial सह संस्कृति प्रणाली को जोड़ती है. एनएसपीसी-एंडोथेलियल सह-संस्कृति प्रणाली इन विट्रो मेंप्राथमिक एनएसपीसी के आत्म-नवीकरण और विस्तार की अनुमति देती है, जिससे पर्याप्त संख्या में एनएसपीसी पैदा होती है। सुसंस्कृत एनएसपीसी में सियालोग्लीकनों को एक अप्राकृतिक सियालिक एसिड चयापचय रिपोर्टर के साथ लेबल किया जाता है जैव-ऑर्थोगोनल कार्यात्मक समूह। स्वयं नवीनीकरण NSPCs से sialoglycoproteome की तुलना करके एक endothelial सह संस्कृति में अलग तंत्रिका संस्कृति के साथ विस्तार, हम झिल्ली प्रोटीन है कि NSPCs में समृद्ध कर रहे हैं की एक सूची की पहचान. विस्तार से, प्रोटोकॉल शामिल है: 1) एक NSPC-endothelial सह संस्कृति और NSPC अलग संस्कृति की स्थापना; 2) अजीडोसुगर प्रति-ओ-ऐसीटाइलित एन-अजीडोऐसीटिलमैनोसामाइन (एसी4मैनाज़) के साथ लेबलिंग; और 3) जैव विवर्तन न्यूरल कल्चर या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तंत्रिका संस्कृति से प्रोटीन निष्कर्षण के निर्धारण के बाद इमेजिंग के लिए संशोधित sialoglycan करने के लिए। फिर, NSPC समृद्ध सतह मार्कर उम्मीदवारों दोनों विस्तारित NSPC और विभेदित तंत्रिका संस्कृतियों से मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण द्वारा चुना जाता है. इस प्रोटोकॉल शुरू सामग्री में कम बहुतायत की झिल्ली प्रोटीन की पहचान करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है, और यह उचित संशोधनों के साथ अन्य प्रणालियों में मार्कर खोज करने के लिए लागू किया जा सकता है

Introduction

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एक बहुशक्तिशाली कोशिका जनसंख्या है कि स्वयं को एक स्टेम सेल पूल बनाए रखने और न्यूरॉन्स और glia में अंतर करने के लिए नवीनीकरण कर सकते हैं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. ये तंत्रिका तंत्र में प्रमुख कोशिका प्रकार हैं और कोशिका प्रतिरोपण के माध्यम से रोगग्रस्त और घायलमस्तिष्कोंमें पुनर्योजी चिकित्सा में महान चिकित्सीय क्षमता प्रदान कर सकते हैं 1,2. जैसे-जैसे विकास होता है, तंत्रिका तना कोशिका जनसंख्या विषमजात3,4हो जाती है और मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का अनुपात धीरे- धीरे5कम हो जाता है . आम तौर पर बोल रहा हूँ, भ्रूण तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और अन्य तंत्रिका संतति कोशिकाओं, सामूहिक रूप से तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं (NSPCs) कहा जाता है, germinal क्षेत्रमें स्थित हैं, वेंट्रिकुलर क्षेत्र, और चूहों में subventricular क्षेत्र6. भ्रूणीय मस्तिष्क में, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं मध्यवर्ती संतति कोशिकाओं (IPCs) के माध्यम से सीधे या परोक्ष रूप से न्यूरॉन्स उत्पन्न करते हैं, और बाहरी subventricular क्षेत्र संतति (oRGs)7,8के माध्यम से कुछ प्रजातियों में. विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर, आकृति विज्ञान, स्टेम सेल आला में स्थान, और भेदभाव क्षमता सभी मस्तिष्क organogenesis और नैदानिक अनुप्रयोगों 9 में प्रत्येक उपप्रकार की भूमिका का निर्धारण. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध सेल सतह मार्करों स्पष्ट रूप से भेदभाव और NSPCs के विभिन्न उपप्रकारों को शुद्ध नहीं कर सकते, समझ और इन उपप्रकारों के उपयोग को सीमित.

प्राथमिक NSPCs सतह मार्करों की पहचान तीन प्रमुख बाधाओं द्वारा सीमित है. पहले एक ऊतक में NSPCs की सीमित सेल संख्या है, यह मुश्किल आम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए सेल सतह प्रोटीन नमूने तैयार करने के लिए कर रही है. दूसरी सीमा उपप्रकार-विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन डेटा उत्पन्न करने के लिए शुद्ध सेल उपप्रकारों के उत्पादन में कठिनाई है. अंत में, तीसरी चुनौती पूरे सेल प्रोटीन में सेल सतह प्रोटीन के कम अनुपात है, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा उनकी पहचान संवेदनशीलता में बाधा.

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने प्राथमिक एनएसपीसी में कोशिका सतह प्रोटीनों को चुनिंदा रूप से समृद्ध करने और उनकी पहचान करने के लिए एक रसोप्रोटोमिक दृष्टिकोण विकसित किया है जो सियालोग्लीकोप्रोटीन10को चयापचयी रूप से लेबल करके किया जाता है। NSPCs की एक पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए, हम विस्तार और इन विट्रो में अलग अलग राज्यों में प्राथमिक भ्रूण NSPCs बनाए रखने के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल का लाभ उठाया, माउस मस्तिष्क endothelial सेल लाइनों के साथ सह-कुलीकरण NSPCs द्वारा एक पारगम्य समर्थन का उपयोग कर मैट्रिक्स डालने(उदा., ट्रांसवेल) प्रणाली11| इसके विपरीत, एनपीएससी अकेले ही एंडोथेलियल कोशिकाओं के बिना सुसंस्कृत विभेदित संतति11,12उत्पन्न करते हैं । इस प्रकार, इन दो संस्कृति प्रणालियों से प्रोटीन के नमूने तुलनात्मक रूप से प्रोटीन है कि अंतर NSPCs और विभेदित न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. के रूप में सबसे सेल सतह प्रोटीन sialic एसिड द्वारा संशोधित कर रहे हैं13, अप्राकृतिक sialic एसिड अग्रदूत अनुरूप एन-azidoacetylmannosamine tetraacylated (Ac4ManNAz) आंतरिक चयापचय मार्ग अपहरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ताकि अंतर्जात, नव संश्लेषित sialoglycans azido समूहों के साथ लेबल कर रहे हैं, एक रासायनिक संभाल पैदा14. अजीडो-ऐल्किने-मध्यस्थ जैव-विषमजनीय प्रतिक्रियाओं के माध्यम से, जो सिलोग्लाइकन के लिए समंजक बायोटिन, सेल सतह प्रोटीन कल्पना की जा सकती है और एक स्ट्रेप्टाविडिन-युग्मित फ्लोरोफोर या मैट्रिक्स14के माध्यम से प्रोटीओमिक पहचान के लिए समृद्ध किया जा सकता है।

यहाँ, हम एक गैर-सह-संस्कृति प्रणाली में एक endothelial सह संस्कृति और differentiating कोशिकाओं में विस्तार NSPCs से सतह sialoglycoproteome की एसडीएस-पेज जेल विश्लेषण के धुंधला प्रदर्शन करते हैं। हम भी चुनिंदा proteomic तुलना के लिए दो संस्कृति प्रणालियों में सतह sialoglycoproteome शुद्ध. हमारे प्रोटोकॉल, पारंपरिक centrifugation आधारित सेल सतह शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ तुलना में15, विशिष्ट टैग संयोजन और आत्मीयता के माध्यम से सतह प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं को कम करने से निष्कर्षण प्रभावकारिता बढ़ जाती है शोधन. इस बीच, यह आधार है कि sialylation ज्यादातर सेल सतह प्रोटीन पर होता है के आधार पर सेल सतह प्रोटीन की निष्कर्षण शुद्धता बढ़ जाती है. हालांकि endothelial कारकों पूरी तरह से विस्तारित NSPCs के भेदभाव ब्लॉक नहीं कर सकते, एक सह संस्कृति और विभेदित संस्कृति के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यकता के बिना स्टेम सेल समृद्ध सतह प्रोटीन इंगित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है FACS16द्वारा शुद्ध NPCs से प्रोटीन का विश्लेषण | हमारा मानना है कि इस दृष्टिकोण उचित संशोधनों के साथ अन्य प्रणालियों में सतह प्रोटीन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी पशु प्रोटोकॉल को टीएसिंगुआ विश्वविद्यालय के आईएसयूसी (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) द्वारा अनुमोदित किया गया था और आईएसयूसी के दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। सिंघुआ विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु सुविधा को एएएलएसी (एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड प्रत्यायन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल) द्वारा मान्यता प्रदान की गई है। भ्रूण के मंचन के लिए, पहचान े गए योनि प्लग के मिड-डे की गणना भ्रूण दिवस 0.5 (ई0.5) के रूप में की गई थी।

नोट: सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2की शर्तों के तहत सेल इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जाता है।

1. Permeable समर्थन सम्मिलित करता है में माउस Endothelial संस्कृति की तैयारी

नोट: BEND3 कोशिकाओं निर्माता के निर्देशों के अनुसार बनाए रखा जाता है.

  1. बीईडीएमईएम के 500 एमएल में एफबीएस के 50 एमएल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 एमएल को जोड़कर बीईडी3 सेल मीडियम (बीएम) को अच्छी तरह मिला लें।
  2. पकवान से माध्यम aspirate और एक बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ BEND3 कोशिकाओं संस्कृति धो लो. कोशिकाओं में 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA का 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए ट्रिप्सिन-EDTA और पिपेट को धीरे-धीरे बेअसर करने के लिए कोशिकाओं में 1 एमएल बीएल जोड़ें। सेल निलंबन को एक नए 15 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा सेल निलंबन को स्थानांतरित करें।
  4. ट्यूब से supernatant aspirate और ताजा बीएम के 9 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित, तो एक पारगम्य समर्थन डालने में सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें. मैट्रिक्स के नीचे कक्ष में अच्छी तरह से प्रति ताजा बीएम की एक और 2 एमएल जोड़ें. एक दिन के लिए कोशिकाओं को संस्कृति के लिए जारी रखें.

2. माउस प्राथमिक Cortical NSPCs संस्कृति की तैयारी

  1. संस्कृति की थाली, papain पाचन माध्यम की तैयारी, और cortical अनुयायी संस्कृति माध्यम (AM)
    1. 6-वेल प्लेट्स में प्रति अच्छी तरह से 1 एमएलएल घोल जोड़कर पॉली-एल-लीसिन (PLL) के साथ 6-वेल प्लेट्स को 6-वेल प्लेट्स में जोड़कर। फिर, 30 मिनट के लिए आरटी पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    2. PLL समाधान को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। प्लेटों को डबल आसुत पानी से 3 बार धोएं। प्लेटों को एयरड्रा इन करके उपयोग होने तक अलग रख दें।
    3. पैपेन पाचन माध्यम को 50 यू पापिन, 50 डिग्री सेल्सियस एल-ग्लूटामाइन, और 100 मिलीग्राम/एमएल एसिटाइल-एल-सिस्टीन को 5 एमएल DMEM में जोड़कर तैयार करें। माध्यम को संक्षेप में मिलाएं और एंजाइम सक्रियण के लिए 30 मिनट के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. cortical सेल अनुलग्न संस्कृति माध्यम (ए एम) तैयार करें: एल-ग्लूटामाइन के 500 डिग्री एल, सोडियम पाइरुटेट के 500 डिग्री एल, 100 मिलीग्राम/एमएल एन-ऐसीटिल-एल-साइस्टीन, 500 एल एन 2, बी 27 के 1 एमएल, और 100 ग्राम/एमएल बीजीएफ के 5 डिग्री एल को 500 ग्राम/एमएल बीजीएफ में जोड़ें। मध्यम को अच्छी तरह मिला लें और उपयोग करने से पहले इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. प्राथमिक मस्तिष्क cortical कोशिकाओं और बाद में चढ़ाना की तैयारी
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक E10.5 समय पर गर्भवती माउस बलिदान.
      नोट: E10.5 में, कोशिकाओं के बहुमत सेरेब्रल कॉर्टेक्स में NSPCs बढ़ रहे हैं, इन विट्रो में संतति के बड़े क्लोन को जन्म दे.
    2. 75% इथेनॉल द्वारा पेट को बाँझ। मध्य रेखा के दाईं ओर त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों को काटने से पेट को खोलने के लिए ठीक कैंची और माइक्रो-सेरेटेड संदंश का उपयोग करें। गर्भाशय को पेट की गुहा से धीरे से serated संदंश के साथ निकालें और इसे ठीक कैंची से पेट की गुहा से काट दें।
    3. गर्भाशय को 10 सेमी पेट्री डिश में 40 एमएल से धो लें। फिर, गर्भाशय को एक नए 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और इसे 40 एमएल पूर्व-चिल्ड एचबीएस के साथ फिर से धो लें।
    4. गर्भाशय को एक नए 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 40 एमएल प्री-चिल्ड एचबीएसएस होते हैं। गर्भाशय और एमनियोटिक झिल्ली से भ्रूण निकालें, फिर जेवर माइक्रोफोर्स के साथ चड्डी से भ्रूण के सिर काट दें।
    5. पूर्व ठंडा HBSS के 40 एमएल के साथ सिर धो लें और पूर्व ठंडा HBSS के 40 एमएल के साथ एक नया 10 सेमी पेट्री डिश के लिए सिर हस्तांतरण। दूर त्वचा और उपास्थि दिमाग को कवर छील करने के लिए ज्वेलर्स microforceps का प्रयोग करें, तो मस्तिष्क cortices काट और उन्हें पूर्व ठंडा HBSS के साथ एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में इकट्ठा.
    6. कॉर्टिस को 4 डिग्री सेल्सियस और 300 ग छपर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रण द्वारा गोली मारें . ट्यूब से supernatant aspirate, तो सक्रिय papain पाचन माध्यम और 15 डिग्री सेल्सियस 4 mg/mL DNase मैं ऊतक गोली में जोड़ें.
    7. कोमल भंवर द्वारा ऊतक गोली संक्षेप में पुन: निलंबित करें. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक इनक्यूबेट करें। इस समय के दौरान, हर 10 मिनट संक्षिप्त भंवर द्वारा ऊतक ढीला.
      नोट: पाचन के अंत में, ट्यूब में कोई दिखाई ऊतक टुकड़े नहीं होना चाहिए।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस और 450 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कॉर्टिकल कोशिकाओं को गोली मारें . ट्यूब से supernatant प्रेरित और पूर्व chilled DMEM के साथ सेल गोली धो लो. इस चरण को एक बार दोहराएँ.
      नोट: पाचन और धोने के दौरान, एक मजबूत कतरनी बल के साथ कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए मोटे तौर पर ऊतकों और सेल गोली को पिपेट न करने के लिए सावधानी बरतें।
    9. ट्यूब से सुपरनेंट को प्रेरित करें फिर ट्यूब में प्री-चिल्ड एचबीएसएस के 1.5 एमएल जोड़ें। cortical सेल गोली कोमल pipeting के साथ एकल कोशिकाओं में अलग. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल नंबर की गणना करें।
    10. 6-वेल प्लेट्स में 2 एमएल ए एम और 2 x 104 कॉर्टिकल कोशिकाओं को अच्छी तरह से जोड़ें। 3 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर प्लेट को इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को प्लेट से जोड़ दें।

3. तंत्रिका-अंत:संस् कार और एसी4मैनाज लेबलिंग प्रणाली का सेट-अप

  1. सम्मिलित करता है में BEND3 कोशिकाओं चढ़ाना के बाद एक दिन, धीरे पहले नीचे कक्ष में माध्यम aspirate, तो आवेषण. प्री-वार्म्ड DMEM के साथ 3 बार सम्मिलित करता है के enface धो लें। पूर्व-वार्म्ड DMEM के साथ rinsing द्वारा आवेषण की बाहरी सतह धो लें।
  2. एक डालने में पूर्व-वार्म्ड AM का 1 एमएल जोड़ें, फिर प्राथमिक cortical कोशिकाओं के साथ कुओं में सम्मिलित करता है स्थानांतरित करें। सह-संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस और 12 ज के लिए 5% सीओ2 को इनक्यूबेट करें।
  3. 200 एमएम के स्टॉक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए DMSO में Ac4ManNAz भंग करें। 12 ज तंत्रिका-endothelial सह संस्कृति की स्थापना के बाद, एसी4ManNAz शेयर प्रति नीचे कक्ष के 1 $L और सह संस्कृति में डालने के प्रति शेयर की 0.5 $L जोड़ें. प्लेट्स को तुरंत हिलाएं और धीरे-धीरे मध्यम को अच्छी तरह मिला लें। नियंत्रण कक्षों के लिए, DMSO के बराबर वॉल्यूम जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक और 5 दिनों के लिए कोशिकाओं संस्कृति . REfeeding माध्यम (RM) के रूप में 10x bFGF के साथ AM तैयार करें. इस समय के दौरान, प्रत्येक दूसरे दिन एंडोथेलियल और तंत्रिका कोशिकाओं को पुन: फीड करने के लिए प्रति सम्मिलित करने के लिए 100 $L और आरएम प्रति आरएम का 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। refeeding के दौरान, संस्कृति में एसी4ManNAz या DMSO की आपूर्ति नहीं है.

4. विस्तारित प्राथमिक NSPCs और विभेदित न्यूरॉन्स में Sialoglycoप्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंट दाग

  1. डबल-डिस्टिल्ड पानी में 1.5 एमएम क्यूएसओ4 और 9 एमएम BTTAA युक्त BTTAA-CuSO4 जटिल 1 30x स्टॉक तैयार करें। पीबीएस में 50 डिग्री सेल्सियस बायोटिन-एल्कीन, 2.5 एमएम सोडियम एसकॉर्बेट, और 1x BTTAA-CuSO4 जटिल युक्त ताजा बायोटिन-कन्जुगेट्ड बफर 1 तैयार करें।
  2. सह-संस्कृति प्लेट्स से सम्मिलित करता है निकालें। नीचे कुओं से संस्कृति माध्यम aspirate और पूर्व गर्म पीबीएस के साथ एक बार तंत्रिका कोशिकाओं को धो लें.
  3. कुओं से पीबीएस को प्रेरित करें। कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रति पूर्व ठंडा 4% paraformaldehyde पीबीएस समाधान के 1 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं को ठीक. फिर, कोशिकाओं को 3 बार पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ धो लें।
  4. कुओं से पीबीएस को एस्पेरेट करें और कोशिकाओं में 1 एमएल ताजा तैयार बायोटिन-कंजुरेटेड बफर 1 को अच्छी तरह से जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. कुओं से प्रतिक्रिया बफर प्रेरित. कोशिकाओं को 3 बार पीबीएस से धोएं। 1% FBS और 1 $g/एमएल एलेक्सा फ्लोर 647-स्ट्रेप्टाविडिन युक्त धुंधला बफर तैयार करें। कोशिकाओं में प्रति अच्छी तरह से धुंधला बफर के 1 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. कुओं और धोया कोशिकाओं से धुंधला बफर पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ 3 बार प्रेरित. पीबीएस में 5% बीएसए और 0.3% गैर-आयनिक डिटर्जेंट-100 युक्त अवरुद्ध बफर तैयार करें। कोशिकाओं में अच्छी तरह से बफर अवरुद्ध और 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट के 1 एमएल जोड़ें।
  7. एंटी-नेस्टिन और एंटी-जेड-टूबुलिन III एंटीबॉडी को क्रमशः 1:20 और 1:1,000 के अनुपात में अवरुद्ध बफर में एक साथ कम करके एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। कुओं से अवरुद्ध बफर निकालें और कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रति प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. कुओं से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें. कोशिकाओं को 3 बार पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ धो एंकिया जाता है। एलेक्सा फ्लोर 488 बकरी विरोधी माउस IgG1, एलेक्सा फ्लोर 546 बकरी विरोधी माउस IgG2b, और DAPI एक साथ 1:1,000 के एक कमजोर पड़ने पर बफर अवरुद्ध में एक साथ कम करके एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। कुओं से पीबीएस को प्रेरित करें और कोशिकाओं में प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। 2 ज के लिए आरटी में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  9. कुओं से एंटीबॉडी समाधान को प्रेरित करें और कोशिकाओं को 3 बार पूर्व-चिल्ड पीबीएस के साथ धोएं। बाद में, कोशिकाओं छवि पर कब्जा करने के लिए तैयार हैं.

5. विस्तारित प्राथमिक NSPCs और विभेदित न्यूरॉन्स से Sialoglycoप्रोटीन की शुद्धि

  1. डबल आसुत पानी में 1.5 मीटर CuSO4 और 3 mM BTTAA युक्त BTTAA-CuSO4 जटिल 2 15x स्टॉक तैयार करें। प्रोटीन पुन: निलंबन बफर ए जिसमें 4% एसडीएस और डबल आसुत पानी में 10 एमएम EDTA तैयार करें; प्रोटीन पुन: निलंबन बफर बी युक्त 150 एमएम NaCl, 50 m triethanolamine, और 1% polyoxyethylene oleyl ईथर (उदा., बृज97) पीएच 7.4 के साथ डबल आसुत पानी में. उपयोग करने से पहले, पूर्ण प्रोटीन पुन: निलंबन बफर तैयार करने के लिए बफर A:buffer B $ 1:8 (vol/vol) का मिश्रण करें। पीबीएस में 2% एसडीएस युक्त प्रोटीन धोने बफर 1 तैयार करें; प्रोटीन धोने बफर 2 250 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) में 8 एम यूरिया युक्त; और प्रोटीन धोने बफर 3 PBS में 2.5 एम NaCl युक्त.
  2. सह-संस्कृति प्लेट्स से सम्मिलित करता है निकालें। नीचे कुओं से संस्कृति माध्यम aspirate और पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ एक बार तंत्रिका कोशिकाओं को धो लें.
  3. कुओं से पीबीएस को प्रेरित करें और प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से पूर्व-चिल्ड आरआईपीए बफर के 200 डिग्री एल जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। प्रोटीन lysis को 1.5 एमएल ट्यूबों में एकत्र करें। कोशिका के मलबे को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 12,000 x ग्रामपर अपकेंद्रण द्वारा गोली मारें ।
  4. नए 1.5 एमएल ट्यूबों में supernatant स्थानांतरण. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए किट के साथ प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. प्रोटीन सांद्रता को 1 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें।
  5. 100 डिग्री सेल्सियस एल्किन-बायोटिन, 2.5 एमएम सोडियम एसकॉर्बेट, और 1x BTTAA-CuSO4 जटिल 2 से 1 एमएल प्रोटीन lysis जोड़ें और समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं। 1 एच के लिए आरटी में मिश्रण इनक्यूबेट करें।
  6. 50 एमएल शंकुनली नली में पूर्व-चिल्ड मेथनॉल के 20 एमएल में अभिक्रिया विलयन को स्थानांतरित करें। प्रोटीन को वेग देने के लिए रात भर -30 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  7. प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस और 4,500 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा वेग से गोली मार दी जाती है . प्रोटीन गोली को पूर्व-चिल्ड मेथनॉल के 20 एमएल से दो बार धोएं। अतिनैंट को ट्यूब से प्रेरित करें। प्रोटीन गोली के साथ पुन: निलंबित प्रोटीन resuspension बफर और एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब में प्रोटीन resuspension हस्तांतरण.
  8. स्ट्रेप्टविडिन मोती के 50 डिग्री एल लें और उन्हें पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। प्रोटीन resuspension में धोया मोती जोड़ें. 20 उप्र की घूर्णन गति से ऊर्ध्वाधर रोटेटर पर 3 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
  9. 6 प्रकार के बफरके साथ मोतियों को क्रमिक रूप से धोएं: प्रोटीन वॉशिंग बफर 1, प्रोटीन वॉशिंग बफर 2, प्रोटीन वॉशिंग बफर 3, 0.5 एम एबीसी, 0.25 एम एबीसी और 0.05 एम एबीसी।
  10. धोने के बाद, पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ मोती resuspend और एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में मोती हस्तांतरण. मोती में बफर लोड होने वाले 2x प्रोटीन का 20 डिग्री एल जोड़ें और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें। प्रोटीन के नमूने तो एसडीएस-पेज के अधीन किया जाना चाहिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार Coomasie शानदार नीले आर-250 के साथ दाग. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए Coomasie शानदार नीले आर-250 द्वारा संकेत के रूप में जेल में प्रोटीन कट.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्राथमिक भ्रूणीय एनएसपीसी के इन विट्रो विस्तार और चयापचय लेबलिंग के लिए पूरी प्रक्रिया में 6 दिन लगते हैं (चित्र 1क) . BEND3 सेल लाइन और हौसले से अलग प्राथमिक NSPCs की गुणवत्ता एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं. BEND3 कोशिकाओं घुलनशील कारकों है कि आत्म नवीकरण और NSPCs के प्रसार को प्रोत्साहित का स्रोत हैं. यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि BEND3 कोशिकाओं को किसी भी संदूषण से मुक्त कर रहे हैं और तंत्रिका कोशिकाओं के साथ सह-culturing से पहले कम से कम सेल मौत के साथ सक्रिय रूप से विभाजित. प्राथमिक NSPCs सावधानी से वियोजन के दौरान अतिरिक्त क्षति से बचने के लिए तैयार किया जाना चाहिए. क्षतिग्रस्त NSPCs अभी भी बढ़ने और अंतर हो सकता है; हालांकि, वे स्टेमनेस को बनाए रखने और विस्तार करने के लिए एंडोथेलियल उत्तेजनाओं का अच्छी तरह से जवाब देने में सक्षम नहीं हैं। अतिरिक्त सावधानी सेल culturing के दौरान aseptic किया जाना चाहिए, के रूप में प्रोटोकॉल प्राथमिक संस्कृति माध्यम के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा सुझाव नहीं है.

सफल एंडोथेलियल सह-संस्कृति एनएसपीसी को बड़े, शीट की तरह क्लोन बनाने के लिए नेतृत्व करेगी। इस तरह के विशेष रुप से प्रदर्शित क्लोन आकार 4 दिन में स्पष्ट हो जाते हैं और 6 दिन में बहुत विशिष्ट हैं। क्लोन के भीतर, कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ निकट संपर्क बनाए रखने. एनएसपीसी मार्कर नेस्टिन और न्यूरोनल मार्कर - टबुलिन III के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग को यह पता लगाना चाहिए कि क्लोन में अधिकांश कोशिकाएं नेस्टिन+ एनएसपीसी हैं और बहुत कम हैं --ट्यूबुलिन III+ न्यूरोनल कोशिकाएं। इसके विपरीत, गैर-सह-संस्कृति प्रणाली में बने क्लोन में नेस्टिन+ कोशिकाओं और जेड-ट्यूबुलिन III+ न्यूरोनल कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग समान है (चित्र 1ख, 1D, और 1E)।

रासायनिक रिपोर्टर, एसी4ManNAz, एक चयापचय अनुरूप है और आंतरिक प्रोटीन sialylation मार्ग में शामिल किया जा सकता है. एसी4ManNAz की उच्च खुराक कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं. सेल के प्रत्येक विशिष्ट प्रकार के लिए, एसी4ManNAz की लेबलिंग एकाग्रता महत्वपूर्ण cytotoxicity के बिना उच्चतम लेबलिंग दक्षता प्राप्त करने के लिए पूर्व परीक्षण किया जाना चाहिए। यहाँ, प्राथमिक NSPC के लिए Ac4ManNAz की अनुकूलित लेबलिंग एकाग्रता है 100 डिग्री सेल्सियस. सेलुलर और नाभिक आकृति विज्ञान द्वारा संकेत सेल मौत के संयोजन मूल्यांकन से पता चलता है इस लेबलिंग एकाग्रता स्पष्ट cytotoxic प्रभाव का कारण नहीं है और है NSPCs को कुशलतासे लेबल करने में सक्षम (चित्र 1C और 1D)। एनएसपीसी की अंत:भू-संवर्धन और गैर-संस्कृति प्रणाली दोनों में क्लोनल आकारिकी, आत्म-नवीकरण और विभेदन क्षमता प्रभावित नहीं होती है (चित्र 1C, 1D, और 1E)।

एसी4ManNAz द्वारा NSPCs के सफल लेबलिंग azide और alkyne के बीच एक bioorthogonal प्रतिक्रिया द्वारा मध्यस्थता संस्कृति के लिए biotin संयोजन के बाद जांच की जा सकती है. Ac4ManNAz लेबल संस्कृति में हर सेल दाग और एलेक्सा फ्लोर 647-streptavidin के साथ कल्पना की है. कोई सेल एलेक्सा फ्लोर 647-streptavidin DMSO नियंत्रण समूह में धुंधला के लिए सकारात्मक है. इसके अलावा, बायोटिन कंजुगेशन और स्ट्रेपविडिन मोती शुद्धि द्वारा एसी4मैनाज-लेबल संस्कृति से तैयार प्रोटीन के नमूने एसडीएस-पेज जैल में मजबूत कोमासी शानदार नीले दाग संकेत दिखाते हैं। इस बीच, वहाँ केवल धुंधला पृष्ठभूमि और DMSO नियंत्रण समूह से प्रोटीन के नमूने के साथ भरी हुई गलियों में nonspecific बाध्यकारी संकेत थे. यह भी एसी4ManNAz द्वारा NSPCs के कुशल लेबलिंग को इंगित करता है (चित्र 1F) .

Figure 1
चित्र 1 : endothelial सह संस्कृति प्रणाली और चयापचय sialoglycan लेबलिंग द्वारा सहायता प्रदान की प्राथमिक NSPCs के लिए सेल सतह मार्करों की पहचान. (A) प्रोटोकॉल के लिए वर्कफ़्लो का Schematic. यह आंकड़ा बाई एट अल से संशोधित किया गया है. 10. BEND3 कोशिकाओं D0 पर मैट्रिक्स आवेषण में बीज रहे हैं. प्राथमिक cortical NSPCs की तैयारी और सह संस्कृति प्रणाली की स्थापना D1 पर प्रदर्शन कर रहे हैं. संस्कृति की मेटाबोलिक लेबलिंग D2 से D6 तक रहता है। संस्कृति refeeding D3 और D5 पर किया जाता है. (बी) 5 दिन की संस्कृति के साथ या endothelial कोशिकाओं के बिना के बाद प्राथमिक NSPCs द्वारा गठित क्लोन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों। स्केल बार Ac4ManNAz या DMSO के साथ 5 दिन की संस्कृति के बाद प्राथमिक NSPCs द्वारा गठित क्लोन के लिए 20 डिग्री मीटर (सी) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को इंगित करता है। नाभिक DAPI द्वारा मुकाबला किया गया. स्केल बार 20 डिग्री मी इंगित करता है। त्रुटि पट्टी SEM (n.s. $ महत्वपूर्ण नहीं) इंगित करती है. (डी) एनएसपीसी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों ने एसी4मैनाज या डीएमएसओ के साथ एंडोथेलियल सह-संस्कृति में क्लोन बनाए। डैश्ड सर्कल एक एकल तंत्रिका क्लोन demarcates. स्केल बार, एनएसपीसी का परिमाणीकरण और एनएसपीसी में एनएसपीसी द्वारा गठित ए सी4मैनएज़ लेबलिंग या डी एम एस ओ नियंत्रण के साथ गैर-सह-संस्कृति प्रणाली को इंगित करता है। त्रुटि पट्टी SEM (**p andlt; 0.0005; n.s. ] महत्वपूर्ण नहीं) इंगित करती है. (एफ) एंडोथेलियल सह-संस्कृति और गैर-संस्कृति प्रणाली में एसी4मैनाज या डीएमएसओ के साथ लेबल तंत्रिका कोशिकाओं से स्ट्रेपटाविडिन मनकों द्वारा शुद्ध प्रोटीन के Coomasie शानदार नीले दाग। नियंत्रण लेबलिंग समूहों में 55 केडी बैंड गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी, सी, ई और एफ) इस प्रोटोकॉल के अनुरूप बाई एट अल से अनुकूलित किया गया है. 10इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सतह मार्कर आमतौर पर इन विट्रो में और विवो17,18में विशिष्ट कोशिका प्रकारों को लेबल और शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है । सतह मार्करों की खोज चुनिंदा सामान्य या रोग ऊतकों और संस्कृति व्यंजनों से एक स्टेम सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए आणविक उपकरण उपलब्ध कराने के द्वारा पुनर्योजी दवा और स्टेम सेल शोध के लिए बहुत योगदान देता है, एक शुद्ध सेल की पेशकश नैदानिक उपयोग या जैविक गुणों के अध्ययन के लिए संसाधन. हालांकि, तंत्रिका स्टेम सेल अनुसंधान के लिए सतह मार्करों के विकास में प्रगति प्राथमिक ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं को अलग करने में कठिनाई के कारण धीमी गति से किया गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इन विट्रो मंच में एक सरलीकृत पर आधारित है. एक endothelial सह संस्कृति द्वारा एक differentiating तंत्रिका संस्कृति के लिए विस्तारित प्राथमिक NSPCs की तुलना करके, प्रोटीन अंतर विस्तारित NSPCs में व्यक्त पर प्रकाश डाला और आगे की पहचान के लिए अनुमति देते हैं. हमारे प्रोटोकॉल भी जैव gothogonal समूहों के साथ sialoglycan लेबल करने के लिए आंतरिक चयापचय मार्ग अपहरण द्वारा सेल सतह प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है. सेल सतह प्रोटीन शुद्ध करने के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, इस प्रोटोकॉल के लाभ दो विशिष्ट सुविधाओं द्वारा underpinned हैं: 1) सेल सतह प्रोटीन पर sialylation के प्रसार सेल सतह proteome के अधिक से अधिक कवरेज सुनिश्चित करता है, और 2) जैव-विषम समूह और इसके लिगन्ड्स के बीच अभिक्रिया विशिष्टता अर्जित सतह प्रोटीओम की शुद्धता प्रदान करती है। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल कम शुरू सामग्री के मामले में एक अधिक संवेदनशील proteomic विश्लेषण में परिणाम. हम प्राथमिक NSPCs सतह मार्करों में इस प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है. इन विट्रो में स्टेम कोशिकाओं के विस्तार पर उचित संशोधनों के साथ, इस chemoproteomic दृष्टिकोण अन्य स्टेम सेल प्रकार की सतह मार्करों की पहचान के साथ संगत हो सकता है. यह उल्लेखनीय है कि के रूप में Ac4ManNAz प्रति-O-acetylated यह कृत्रिम एस ग्लाइकोसिलेशन के लिए नेतृत्व कर सकता है. अनैसर्गिक शर्कराओं के प्रयोग से कलाकृति के निर्माण से बच ने बचने और जीवित कोशिकाओं में चयापचय ग्लिकन लेबलिंग की विशिष्टता और वैधता में सुधार कर सकते हैं19.

प्राथमिक cortical तंत्रिका जनक कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं की तैयारी प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम हैं. सबसे पहले, जब भ्रूण cortical ऊतकों को पचाने, पाचन समय, एंजाइम की मात्रा, और हैंडलिंग की ताकत ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए. अत्यधिक पाचन और यांत्रिक कतरनी बलों प्लाज्मा झिल्ली और सेल सतह रिसेप्टर्स कि सेल अस्तित्व और विकास के लिए संकेत transduction मध्यस्थता की अखंडता को नुकसान होगा, और वे भी की उत्तेजना के लिए NSPCs की प्रतिक्रिया को परेशान करेगा endothelial कोशिकाओं और उनके स्वयं नवीनीकरण की क्षमता. उचित पाचन प्राप्त करने के लिए, प्रयोगकर्ताओं को पैपिन को पूरी तरह से सक्रिय करना चाहिए और ऊतक ब्लॉक गायब होने के रूप में पाचन बंद कर देना चाहिए। दूसरा, BEND3 कोशिकाओं को स्राव का समर्थन करने के लिए एक स्वस्थ राज्य में बनाए रखा जाना चाहिए. यह कम मार्ग के साथ BEND3 सेल बैचों का उपयोग करें और कोशिकाओं को पारित करने से पहले वे 100% संगम तक पहुँचने की सिफारिश की है. यह सेल चक्र गिरफ्तारी और पारित होने के दौरान जमा डीएनए क्षति की वजह से और कोशिकाओं के बीच भीड़ भरे संपर्क से संवेदनशीलता को रोकने जाएगा.

उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकी आरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण के माध्यम से सेल सतह मार्करों की पहचान को बढ़ा देता है, विशेष रूप से ऊतक स्टेम कोशिकाओं सहित सेल प्रकार के लिए, जो अक्सर मात्रा में विवो में मौजूद हैं बहुत छोटी मात्रा में प्रोटीओम विश्लेषण करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री. हालांकि आरएनए-सेक विश्लेषण विशेष रूप से NSPCs में व्यक्त जीन की पहचान कर सकते हैं, यह वास्तव में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं, क्योंकि आरएनए अभिव्यक्ति हमेशा प्रोटीन अभिव्यक्ति20के साथ संगत नहीं है. इसके अलावा, गैर प्रोटीन जैव अणु है कि सतह मार्करों के रूप में काम कर सकते हैं transcriptomic अध्ययन द्वारा पता लगाया जा करने में सक्षम नहीं हैं. उदाहरण के लिए, ओलिगोसैकराइड लुईस एक्स एक प्रसिद्ध सतह निर्माता है जिसका व्यापक रूप से मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और एनएसपीसी को लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, भले ही यह कई प्रोटीन21के साथ जुड़ा हो सकता है। इसलिए, प्रत्यक्ष मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण अभी तक प्रतिस्थापनीय नहीं है, और तरीकों का विकास जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण को अधिक व्यवहार्य और सुविधाजनक बना सकता है, भविष्य के अध्ययनों के लिए बहुत रुचि का है।

sialylation के अलावा, पोस्ट-अनुवादप्रोटीन संशोधनों के अन्य प्रकार संशोधित प्रोटीन के कार्यों को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन संशोधनों से प्रोटीन गुणों जैसे रचना, अर्ध-जीवन तथा उपकोशिकीय स्थानीयकरण22,23को प्रभावित होता है। अनेक प्रोटीन संशोधनों में कोशिका प्रकार की विशिष्टता24,25,26होती है . रासायनिक उपकरण बॉक्स की बढ़ती सामग्री के साथ, अधिक संशोधन प्रकार रासायनिक पत्रकारों के साथ चयापचय लेबलिंग के लिए अनुकूल हैं27. इसलिए, यहाँ वर्णित रासायनिक दृष्टिकोण स्टेम कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं के बीच प्रोटीन संशोधन में अन्य मतभेदों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, स्टेम सेल गुणों और भेदभाव के रखरखाव के पीछे आणविक तंत्र illustrating विनियमन.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को प्रकटीकरण के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

चित्र 1B, 1C, 1E और 1F बाई से पुनरुत्पादित कर रहे हैं एट अल . 10 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ. हम आंकड़ा संपादन के लिए एक्स सी की प्रयोगशाला में Yi Hao धन्यवाद. यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 91753206 से Q. S. और X. C., No. 31371093 से Q. S., और Nos. 21425204 और 21672013 से X. C. ) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 151 मेटाबोलिक ग्लिकन लेबलिंग सियालिक एसिड bioorthogonal प्रतिक्रिया तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं संतति कोशिकाओं सतह मार्करों endothelial कोशिकाओं proteome रासायनिक लेबलिंग सेरेब्रल प्रांतस्था
Sialoglycan के मेटाबोलिक लेबलिंग द्वारा प्राथमिक तंत्रिका स्टेम और संतति कोशिकाओं के सेल सतह मार्करों की पहचान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter